專利名稱：一種細胞培養基的制作方法
技術領域：
本發明是生物技術領域的一種新型細胞培養基。
背景技術：
自上世紀初細胞培養基出現以來，細胞培養技術已經成為生物技術和生物工程領域不可 或缺的基礎性技術，同時對培養基的要求也在不斷提高。目前的培養基主要由基礎培養基和 添加劑構成，基礎培養基主要由平衡鹽、蛋白質水解物、維生素和能量成分構成；添加劑主 要是各種動物血清(司徒振強，吳軍正細胞培養世界圖書出版公司北京2004; 44-61 )。 由于血清中含有抗體和補體等免疫分子會對細胞構成影響，而且血清蛋白質成分負責和目標 蛋白可能存在交叉，而且受到人畜共患病的影響，人們不斷在摸索各種血清的替代產品，比 如各種細胞因子的組合，或者利用植物源生物活性物質，但是這些技術要么過于昂貴、要么 細胞生長效率較低，難以完全替代血清產品，而且血清對于部分工程細胞尤其是昆蟲細胞的 支持并不理想。因此我們希望開發一種新的血清替代產品，并結合對基礎培養成分的調整建 立一套新的細胞培養體系，目前國內和國際上尚未發現類似的報道。

發明內容
本發明涉及生物技術領域一種細胞培養用培養基，由基礎培養成本和添加成分構成，其
特征是基礎成分由平衡鹽溶液、能量物質，維生素，蛋白質水解物，以及酸堿指示劑構成， 添加成分為昆蟲幼蟲提取物。
其中，昆蟲幼蟲提取物來源于無菌條件下培養的蠅蛆，黃粉蟲、蠶或者菜青蟲，首選但 不限于無菌蠅蛆。基礎成分可以選擇傳統基礎培養基，也可以自行配置。自制基礎培養成分
中平衡鹽溶液可以是Hanks溶液、Earle溶液、Ringer溶液、Dulbecco溶液、D-Hanks溶液
或者PBS;其中能量物質可以是葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶性淀粉中一種或者幾種；其中維 生素是目前發現的13種微生物中的一種或者幾種；其中蛋白質水解物可以是氨基酸、蛋白胨 或者蛋白腙，其來源可以是動物乳汁、大豆、小麥、魚或者動物肉制品中一種或者幾種，首 選但不限于動物乳汁。
實施實例
昆蟲幼蟲提取物的制備
1、 無菌培養昆蟲幼蟲到幼蟲青年期，優選但不限于無菌蠅蛆
2、 加入適量平衡鹽溶液制備勻漿，
3、 離心去處殘渣和脂類成分
4、 微孔濾膜過濾得到提取物
5、 以標準血清為參照測定提取物相對生長活性基礎培養基的制備
參照商品化基礎培養基比例，以平衡鹽溶液為基礎制備基礎培養基，其中蛋白質水解物 首選但不限于蛋白胨，添加量推薦但不限于0.1%-5.0% (w/v %);能量物質首選但不限于葡
萄糖，添加量推薦但不限于0.1%-1.0% (W/V%);其他成分參照商品化培養基添加。
培養基調配
以待培養細胞為實驗對象，以標準血清作為參照，在商品化基礎培養集中加入不同體積 的昆蟲幼蟲提取物，測定培養物相對活性并確定添加比例。之后可與商品化基礎培養基配合 使用。
以待培養細胞為實驗對象，以商品化基礎培養作為參照，在自制基礎培養集中加入等體 積活性確定的昆蟲幼蟲提取物，選擇最佳基礎培養基配方。之后可和昆蟲幼蟲提取物配合使用。
本發明所涉及的血清代用品不含有動物成分，來源廣泛，成本低廉，利用自制基礎培養 成分進一歩降低了成本，培養適合工程細胞尤其是昆蟲細胞的工業化培養，具有一定的經濟 價值、實用價值和社會價值。
具體實施實例
下面舉例說明本發明所涉及培養基的配置過程，其內容不構成對本發明所要求各項權利 的限制。
1、 人工培養無菌蠅蛆到1周齡，預冷無菌水快速清洗三次。
2、 加入等體積預冷D-Hinkers溶液，低溫勻漿
3、 低溫4000g到6000g離心10分鐘，勻漿分為三層，提取中層清液
4、 0.22微米微孔濾膜正壓過濾，收集濾液，低溫保存或凍干保存，濾液既為添加劑。
5、 將濾液按照5%、 10%、 20%、 30%的體積比例添加到RPMI1640培養基中混合，并以添 加10。/。標準胎牛血清的RPMI1640培養基作為參照，以Hela細胞作為檢驗對象，測定 添加劑活性和添加比例。
6、 取醫用復合氨基酸注射液，復合維生素溶液，葡萄糖注射液，無菌水按照不同比例混 合后，加入等體積2倍D-Hinkers溶液，和適量酸堿指示劑，調節酸堿度到7.40。 添加等體積昆蟲細胞提取物，以RPMI1640培養基作為參照，以Hela細胞作為檢驗對 象，確定最佳配合比例。
權利要求
1本發明涉及生物技術領域一種細胞培養基，由基礎培養成本和添加成分構成，其特征是基礎成分由平衡鹽溶液、能量物質，維生素，蛋白質水解物，以及酸堿指示劑構成，添加成分為昆蟲幼蟲提取物。
2. 根據權利要求(1)中所描述的細胞培養基，其特征是添加成分中昆蟲幼蟲提取物來 源于蠅蛆，黃粉蟲、蠶或者菜青蟲，首選但不限于無菌蠅蛆。
3. 根據權力要求(l)中所描述的細胞培養基，其特征是基礎成分可以選擇傳統基礎培養基，也可以自行配置；其中平衡鹽溶液可以是Hanks溶液、Earie溶液、Ringer溶液、 Dulbecco溶液、D-Hanks溶液或者PBS;其中能量物質可以是葡萄糖、果糖、蔗糖和可溶 性淀粉中一種或者幾種；其中維生素是目前發現的13種微生物中的一種或者幾種；其中蛋 白質水解物可以是氨基酸、蛋白胨或者蛋白腙，其來源可以是動物乳汁、大豆、小麥、魚或 者動物肉制品中一種或者幾種，首選但不限于動物乳汁。
全文摘要
本發明涉及生物技術領域一種細胞培養基，由基礎成本和添加成分構成，其特征是基礎成分由平衡鹽溶液、能量物質，維生素，蛋白質水解物，以及酸堿指示劑構成，添加成分為昆蟲幼蟲提取物。其中，添加成分不含有動物成分，來源廣泛，成本低廉，利用自制基礎培養成分可進一步降低操作成本，適合工程細胞尤其是昆蟲細胞的工業化培養，具有一定的經濟價值、實用價值和社會價值。
文檔編號C12N5/00GK101624578SQ20081011653
公開日2010年1月13日 申請日期2008年7月11日 優先權日2008年7月11日
發明者張永鋼 申請人:張永鋼