用于檢測4種眼科感染病毒的lamp引物組合及應用
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測4種眼科感染病毒的LAMP引物組合及應用。本發明的引物組合，由序列1至24所示的24條單鏈DNA分子組成。本發明還保護所述引物組合的應用。本發明還保護一種鑒別待測病毒為單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型、水痘?帶狀皰疹病毒或巨細胞病毒的方法、一種鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型或水痘?帶狀皰疹病毒或巨細胞病毒的方法、一種鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型和/或單純皰疹病毒II型和/或水痘?帶狀皰疹病毒和/或巨細胞病毒的方法。應用本發明的LAMP引物及方法，可快速、準確的檢測出單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型、水痘?帶狀皰疹病毒和巨細胞病毒。
【專利說明】
用于檢測4種眼科感染病毒的LAMP引物組合及應用
技術領域
[0001] 本發明設及一種用于檢測4種眼科感染病毒的LAMP引物組合及應用。
【背景技術】
[0002] 單純瘤疹病毒化e巧es simplex virus,服V)是引起病毒性瘤疹的病原體，根據抗 原性的差別目前把該病毒分為單純瘤疹病毒I型和單純瘤疹病毒II型。I型首要引起生殖器 W外的皮膚、粘膜（口腔粘膜)和器官(腦)的感染。n型首要引起生殖器部位皮膚粘膜感染。 健康人群中約有50% W上為本病毒的攜帶者。HSV在人體內不產生經久免疫力，每當機體相 稱力降值時，如發熱、胃腸功效素亂、月經、妊娠、病灶感染和動機變卦時，體內隱匿的HSV被 激活而發病，影響人類健康。單純瘤疹性病毒引起的角膜感染稱為單純瘤疹病毒性角膜炎 化SK)，它是當今世界上危害嚴重的感染性眼病之一，發病率占角膜病首位。在我國服K致盲 占角膜盲的42.8%，居首位。HSK發病率高，難治愈，易復發，嚴重影響患者的視功能，已成為 國內外眼科界極為關注的熱點問題之一。
[0003] 巨細胞病毒(切tomegalovirus，CMV)亦稱細胞包涵體病毒，在人群中感染非常廣 泛，中國成人感染率達95% W上，通常呈隱性感染，多數感染者無臨床癥狀，但在一定條件 下侵襲多個器官和系統可產生嚴重疾病。病毒可侵入肺、肝、腎、唾液腺、乳腺其他腺體，W 及多核白細胞和淋己細胞，可長期或間隙地自唾液、乳汗血液、尿液、精液、子宮分泌物多處 排出病毒。通常口腔，生殖道，胎盤，輸血或器官移植等多途徑傳播，具有潛在致癌的可能 性。CMV視網膜炎是CMV感染的主要表現之一，CMV視網膜炎患者會出現視網膜水腫、視網膜 血管異常(血管閉塞）、視網膜脫離、脈絡膜視網膜炎等癥狀及并發癥，若不治療，將緩慢而 不可逆地發展，留下擁痕盲點，視網膜萎縮。CMV還可引起視神經病變，使視力迅速減退。
[0004] 水痘-帶狀瘤疹病毒(varicella-zoster vi;rus，VZV)，在兒童初次感染引起水痘， 恢復后病毒潛伏在體內，少數病人在成人后病毒再發而引起帶狀瘤疹，故被稱為水痘-帶狀 瘤疹病毒。人是水痘-帶狀瘤疹病毒的惟一自然宿主，皮膚上皮細胞是主要祀細胞。水瘤皮 疹內含大量病毒，水痘消失后不遺留癒痕，病情一般較輕，但偶有并發間質性肺炎和感染后 腦炎者。細胞免疫缺陷、白血病、腎臟病或長期使用皮質激素、抗代謝藥物的兒童患水痘表 現為重癥，甚至危及生命。成人患水痘時，20 % -30 %并發肺炎，一般病情重，病死率亦高。孕 婦患水痘的表現亦較嚴重，并可引起胎兒崎形、流產或死產。水痘-帶狀瘤疹病毒感染可引 起帶狀瘤疹眼炎。水痘-帶狀瘤疹病毒除可引起傳統的帶狀瘤疹眼炎外，還有兩種臨床形 式:一為急性視網膜壞死綜合征，表現為雙側性視網膜周邊廣泛的灰白色混濁的視網膜壞 死，常有眼痛，伴有角膜炎或虹膜睫狀體炎；另一為進展性外層視網膜壞死綜合征，其玻璃 體或前節炎癥反應不明顯，但病程早期可有黃斑中屯、凹損害。
[0005] 目前臨床針對病毒的檢測方法主要是分離培養和血清學診斷。運些檢測方法繁 瑣，檢測時間長，靈敏度低，容易發生漏檢和錯檢，無法滿足快速檢測的要求。近幾年發展起 來的分子檢測技術，特別是PCR技術，在微生物快速鑒定和檢測方面的應用，為病毒的快速 檢測開辟了新的途徑。但是，PCR存在檢測時間長、易污染、假陽性率高的缺點，使其應用受 到限制。環介導等溫擴增技術（loop-mediated isothermal amp 1 if i cat ion, LAMP)是近年 來發展出的一種敏感、特異、簡便、快捷的核酸擴增技術，其原理是在一種具有鏈置換活性 的DNA聚合酶的作用下，識另化-8個區域的4-6條引物，在等溫條件下快速、特異地擴增目的 基因，可推廣應用于快速、準確的檢測病毒。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種用于檢測4種眼科感染病毒的LAMP引物組合及應用。
[0007] 本發明提供一種引物組合，由引物組I、引物組II、引物組HI和引物組IV組成；
[000引所述引物組I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1 組成；
[0009] 所述引物F3-1為如下(al)或(a2):
[0010] (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；
[0011] (a2)將序列1經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有 相同功能的DNA分子；
[001^ 所述引物B3-1為如下（日3)或（曰4):
[001引（日3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；
[0014] (a4)將序列2經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有 相同功能的DNA分子；
[001引所述引物FIP-1為如下（日5)或（曰6):
[0016] (曰5)序列表的序列3所示的單鏈DNA分子；
[0017] (a6)將序列3經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有 相同功能的DNA分子；
[001引所述引物BIP-1為如下(曰7)或(曰8):
[0019](日7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子；
[0020] (a8)將序列4經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有 相同功能的DNA分子；
[0021] 所述引物LB-1為如下(a9)或(alO):
[0022] (a9)序列表的序列5所示的單鏈DM分子；
[0023] (alO)將序列5經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有 相同功能的DNA分子；
[0024] 所述引物LF-1為如下(all)或(al2):
[0025] (all)序列表的序列6所示的單鏈DM分子；
[0026] (al2)將序列6經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有 相同功能的DNA分子；
[0027] 所述引物組II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF- 2組成；
[0028] 所述引物F3-2為如下(bl)或化2):
[0029] (bl)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子；
[0030] (b2)將序列7經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有 相同功能的DM分子；
[0031] 所述引物B3-2為如下(b3)或(b4):
[0032] (b3)序列表的序列8所示的單鏈DM分子；
[0033] (b4)將序列8經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有 相同功能的DNA分子；
[0034] 所述引物FIP-2為如下化5)或化6):
[0035] 化5)序列表的序列9所示的單鏈DNA分子；
[0036] (b6)將序列9經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有 相同功能的DNA分子；
[0037] 所述引物BIP-2為如下化7)或化8):
[003引化7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子；
[0039] (b8)將序列10經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具 有相同功能的DNA分子；
[0040] 所述引物LB-2為如下化9)或(bio):
[0041 ] 化9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子；
[0042] (blO)將序列11經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具 有相同功能的DNA分子；
[0043] 所述引物LF-3為如下(bll)或(bl2):
[0044] (bll)序列表的序列12所示的單鏈DM分子；
[0045] (bl2)將序列12經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具 有相同功能的DNA分子；
[0046] 所述引物組III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物 LF-3組成；
[0047] 所述引物F3-3為如下（cl)或(c2):
[004引 （cl)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子；
[0049] (c2)將序列13經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具 有相同功能的DNA分子；
[0050] 所述引物B3-3為如下（c3)或（c4):
[0051 ] (c3)序列表的序列14所示的單鏈DM分子；
[0052] (c4)將序列14經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具 有相同功能的DNA分子；
[0053] 所述引物FIP-2為如下（c5)或（c6):
[0054] (c5)序列表的序列15所示的單鏈DNA分子；
[0055] (c6)將序列15經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具 有相同功能的DNA分子；
[0056] 所述引物BIP-3為如下（c7)或（c8):
[0057] (c7)序列表的序列16所示的單鏈DNA分子；
[005引（c8)將序列16經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具 有相同功能的DNA分子；
[0059] 所述引物LB-3為如下（c9)或(clO):
[0060] (c9)序列表的序列17所示的單鏈DM分子；
[0061] (clO)將序列17經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具 有相同功能的DNA分子；
[0062] 所述引物LF-3為如下（cll)或(cl2):
[0063] (cll)序列表的序列18所示的單鏈DM分子；
[0064] (cl2)將序列18經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具 有相同功能的DNA分子。
[0065] 所述引物組IV由引物F3-4、引物B3-4、引物FIP-4、引物BIP-4、引物LB-4和引物LF- 4組成；
[0066] 所述引物F3-4為如下(dl)或(d2):
[0067] (dl)序列表的序列19所示的單鏈DM分子；
[0068] (d2)將序列19經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具 有相同功能的DNA分子；
[0069] 所述引物B3-4為如下(d3)或(d4):
[0070] (d3)序列表的序列20所示的單鏈DM分子；
[0071] (d4)將序列20經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具 有相同功能的DNA分子；
[0072] 所述引物FIP-4為如下（d5)或(d6):
[0073] (d5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子；
[0074] (d6)將序列21經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具 有相同功能的DNA分子；
[0075] 所述引物BIP-4為如下(d7)或(d8):
[0076] (d7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子；
[0077] (d8)將序列22經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具 有相同功能的DNA分子；
[007引所述引物LB-4為如下(d9)或(dlO):
[0079] (d9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子；
[0080] (dlO)將序列23經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具 有相同功能的DNA分子；
[0081 ] 所述引物LF-4為如下(dll)或(dl2):
[0082] (dll)序列表的序列24所示的單鏈DM分子；
[0083] (dl2)將序列24經過一個或幾個核巧酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具 有相同功能的DNA分子。
[0084] 所述引物組合的用途為如下(el)至(e6)中的任意一種：
[0085] (el)鑒別單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀瘤疹病毒和巨細胞病 毒；
[0086] (e2)制備用于鑒別單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀瘤疹病毒和 巨細胞病毒的試劑盒；
[0087] (e3)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹病毒II型或水痘-帶狀瘤 疹病毒或巨細胞病毒；
[0088] (e4)制備用于鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹病毒II型或水 痘-帶狀瘤疹病毒或巨細胞病毒的試劑盒；
[0089] (e5)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型和/或單純瘤疹病毒II型和/或水 痘-帶狀瘤疹病毒和/或巨細胞病毒；
[0090] (e6)制備用于鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型和/或單純瘤疹病毒II 型和/或水痘-帶狀瘤疹病毒和/或巨細胞病毒的試劑盒。
[0091] 本發明還保護所述引物組合的應用，為如下(el)至(e6)中的任意一種：
[0092] (el)鑒別單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀瘤疹病毒和巨細胞病 毒；
[0093] (e2)制備用于鑒別單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀瘤疹病毒和 巨細胞病毒的試劑盒；
[0094] (e3)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹病毒II型或水痘-帶狀瘤 疹病毒或巨細胞病毒；
[0095] (e4)制備用于鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹病毒II型或水 痘-帶狀瘤疹病毒或巨細胞病毒的試劑盒；
[0096] (e5)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型和/或單純瘤疹病毒II型和/或水 痘-帶狀瘤疹病毒和/或巨細胞病毒；
[0097] (e6)制備用于鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型和/或單純瘤疹病毒II 型和/或水痘-帶狀瘤疹病毒和/或巨細胞病毒的試劑盒。
[0098] 本發明還保護含有所述引物組合的試劑盒;所述試劑盒的用途為如下(fl)或(f2) 或的)：
[0099] (fl)鑒別單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀瘤疹病毒和巨細胞病 毒；
[0100] (f2)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹病毒II型或水痘-帶狀瘤 疹病毒或巨細胞病毒；
[0101] (f3)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型和/或單純瘤疹病毒II型和/或水 痘-帶狀瘤疹病毒和/或巨細胞病毒。
[0102] 本發明還保護所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。
[0103] 本發明還保護一種鑒別待測病毒為單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘- 帶狀瘤疹病毒還是巨細胞病毒的方法，包括如下步驟：
[0104] (1)提取待測病毒的基因組DNA;
[010引（2似步驟（1)得到的基因組DNA為模板，分別采用所述引物組合的引物組I、引物 組II、引物組III和引物組IV進行LAMP擴增反應，如果采用引物組I可W實現W所述基因組 DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為單純瘤疹病毒I型，如果采用引物組II可W實現W所述 基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為單純瘤疹病毒II型，如果采用引物組III可W實 現W所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為水痘-帶狀瘤疹病毒，如果采用引物組 IV可W實現W所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為巨細胞病毒。
[0106] 所述方法中，所述待測病毒為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹病毒II型或水痘-帶狀 瘤疹病毒或巨細胞病毒。
[0107] 本發明還保護一種鑒定或輔助鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型或單純瘤疹 病毒II型或水痘-帶狀瘤疹病毒或巨細胞病毒的方法，包括如下步驟：
[010引（1)提取待測病毒的基因組DNA;
[0109] (2似步驟（1)得到的基因組DNA為模板，分別采用所述引物組合的引物組I、引物 組II、引物組III和引物組IV進行LAMP擴增反應，如果采用引物組I可W實現W所述基因組 DNA為模板的陽性擴增、待測病毒或候選為單純瘤疹病毒I型，如果采用引物組II可W實現 W所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為或候選為單純瘤疹病毒II型，如果采用引 物組III可W實現W所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為或獲選為水痘-帶狀瘤 疹病毒，如果采用引物組IV可W實現W所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為或候 選為巨細胞病毒，如果使用引物組I、引物組II、引物組HI和引物組IV均不能實現W所述基 因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為非單純瘤疹病毒I型且非單純瘤疹病毒II型且非水 痘-帶狀瘤疹病毒且非巨細胞病毒。
[0110] 本發明還保護一種鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型和/或單純瘤疹病 毒II型和/或水痘-帶狀瘤疹病毒和/或巨細胞病毒的方法，包括如下步驟：
[0111] (1)提取待測樣本的總DNA;
[0112] (2似步驟(1)得到的總DNA為模板，分別采用所述引物組合的引物組I、引物組II、 引物組m和引物組IV進行LAMP擴增反應，如果采用引物組I可W實現W所述總DNA為模板 的陽性擴增、待測樣品疑似感染了單純瘤疹病毒I型，如果采用引物組II可W實現W所述總 DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似感染了單純瘤疹病毒II型，如果采用引物組III可W 實現W所述總DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似感染了水痘-帶狀瘤疹病毒，如果采用 引物組IV可W實現W所述總DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似感染了巨細胞病毒，如果 使用引物組I、引物組II、引物組III和引物組IV均不能實現W所述總DNA為模板的陽性擴 增、待測樣本疑似未感染單純瘤疹病毒I型且疑似未感染單純瘤疹病毒II型且疑似未感染 水痘-帶狀瘤疹病毒且疑似未感染巨細胞病毒。
[0113] W上任一所述方法中，具體可通過如下方法判斷"陽性擴增"：用巧光PCR儀檢測巧 光信號，如果出現陽性擴增曲線則為陽性擴增。所述陽性擴增曲線具體可為S型擴增曲線。
[0114] 本發明還保護所述引物組I。
[0115] 所述所述引物組I的用途為如下(gl)或(g2):
[0116] (gl)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型；
[0117] (g2)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型。
[0118] 本發明還保護所述引物組I在制備試劑盒甲中的應用，所述試劑盒甲的用途為如 下(gl)或(g2):
[0119] (gl)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型；
[0120] (g2)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型。
[0121] 本發明還保護含有所述引物組I的試劑盒甲，所述試劑盒甲的用途為如下（gl)或 (邑 2):
[0122] (gl)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒I型；
[0123] (g2)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒I型。
[0124] 本發明還保護所述引物組II。
[0125] 所述所述引物組II的用途為如下(g3)或(g4):
[0126] (g3)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒II型；
[0127] (g4)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒II型。
[0128] 本發明還保護所述引物組II在制備試劑盒乙中的應用，所述試劑盒乙的用途為如 下(的)或(g4):
[0129] (g3)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒II型；
[0130] (g4)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒II型。
[0131] 本發明還保護含有所述引物組II的試劑盒乙，所述試劑盒乙的用途為如下(g3)或 (邑4):
[0132] (g3)鑒定待測病毒是否為單純瘤疹病毒II型；
[0133] (g4)鑒定待測樣本是否感染了單純瘤疹病毒II型。
[0134] 本發明還保護所述引物組III。
[0135] 所述所述引物組HI的用途為如下(g5)或(g6):
[0136] (g5)鑒定待測病毒是否為水痘-帶狀瘤疹病毒；
[0137] (g6)鑒定待測樣本是否感染了水痘-帶狀瘤疹病毒。
[0138] 本發明還保護所述引物組III在制備試劑盒丙中的應用，所述試劑盒丙的用途為 如下(g5)或(g6):
[0139] (g5)鑒定待測病毒是否為水痘-帶狀瘤疹病毒；
[0140] (g6)鑒定待測樣本是否感染了水痘-帶狀瘤疹病毒。
[0141] 本發明還保護含有所述引物組III的試劑盒丙，所述試劑盒丙的用途為如下（g5) 或(邑6):
[0142] (g5)鑒定待測病毒是否為水痘-帶狀瘤疹病毒；
[0143] (g6)鑒定待測樣本是否感染了水痘-帶狀瘤疹病毒。
[0144] 本發明還保護所述引物組IV。
[0145] 所述所述引物組IV的用途為如下(g7)或(g8):
[0146] (g7)鑒定待測病毒是否為巨細胞病毒；
[0147] (g8)鑒定待測樣本是否感染了巨細胞病毒。
[0148] 本發明還保護所述引物組IV在制備試劑盒下中的應用，所述試劑盒下的用途為如 下(g7)或(g8):
[0149] (g7)鑒定待測病毒是否為巨細胞病毒；
[0150] (g8)鑒定待測樣本是否感染了巨細胞病毒。
[0151] 本發明還保護含有所述引物組IV的試劑盒下，所述試劑盒下的用途為如下(g7)或 (邑 8):
[0152] (g7)鑒定待測病毒是否為巨細胞病毒；
[0153] (g8)鑒定待測樣本是否感染了巨細胞病毒。
[0154] W上任一所述待測樣本具體可為眼部臨床樣本培養物、眼液體或抽吸物。
[0155] W上任一所述采用引物組I進行LAMP擴增的反應體系中，引物組I中引物混合物的 濃度為：〇.5iiM F3-l、0.5iiMB3-l、2iiM FIP-l、2iiM BIP-1、化M LF-1、化M LB-1。
[0156] W上任一所述采用引物組II進行LAMP擴增的反應體系中，引物組II中引物混合物 的濃度為:〇.5iiM F3-2、0.5iiMB3-2、2iiM FIP-2、2iiM BIP-2、化M LF-2、化M LB-2。
[0157] W上任一所述采用引物組III進行LAMP擴增的反應體系中，引物組III中引物混合 物的濃度為:〇.5iiM F3-3、0.5iiMB3-3、2iiM FIP-3、2iiM BIP-3、化M LF-3、化M LB-3。
[015引 W上任一所述采用引物組IV進行LAMP擴增的反應體系中，引物組IV中引物混合物 的濃度為:0.5iiM F3-4、0.5iiMB3-4、2iiM FIP-4、2iiM BIP-4、化M LF-4、化M LB-4。
[0159] W上任一所述采用引物組I進行LAMP擴增的反應體系具體可為：1化1 0 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜堿，0.1 化 50mg/ml BSA，0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen，0.1扣L100mMdNTPs，0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段，l化引物混合物 (F3-1、B3-1、FIP-1、BIP-1、LF-1 和LB-1 的混合物），50pg-50ng模板DNA，用d地2〇補足至lOy L。
[0160] W上任一所述采用引物組11進行LAMP擴增的反應體系具體可為：1化10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜堿，0.1 化 50mg/ml BSA，0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen，0.1扣L100mMdNTPs，0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段，l化引物混合物 巧3-2、83-2少1口-2、81口-2、1。-2和1^8-2的混合物），50口邑-50叫模板0魁，用(1地2〇補足至10^ L。
[0161] W上任一所述采用引物組III進行LAMP擴增的反應體系具體可為：1化10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜堿，0.1 化 50mg/ml BSA，0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen，0.1扣L100mMdNTPs，0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段，l化引物混合物 巧3-3、83-3少1口-3、81口-3、1。-3和1^8-3的混合物），50口邑-50叫模板0魁，用(1地2〇補足至10^ L。
[0162] W上任一所述采用引物組IV進行LAMP擴增的反應體系具體可為：1 iiL 10 X ThermoPol Buffera.化L 5M甜菜堿，0.1 化 50mg/ml BSA，0.4化 lOOmM MgS〇4,0.3化 20 XEvaGreen，0.1扣L100mMdNTPs，0.化L洲/mlBstDNA聚合酶大片段，l化引物混合物 巧3-4、83-4少1?-4、81?-4、1。-巧化8-4的混合物），509邑-50叫模板0臟，用(1地20補足至10^ L。
[0163] W上任一所述LAMP擴增的反應程序具體可為:65°C恒溫50min。反應過程中，采用 巧光PCR儀檢測巧光信號。
[0164] 本發明提供了用于檢巧U4種眼科感染病毒的LAM巧I物及方法。所述4種病毒包括： 單純瘤疹病毒1型、單純瘤疹病毒2型、水痘-帶狀瘤疹病毒和巨細胞病毒。本發明所述的 LAMP引物共4套，每種病毒1套，每套包括外引物F3和B3，內引物FIP和BIP W及環引物LF和 LB，每套均可特異性識別祀序列上的六個獨立區域進行擴增，具有高特異性。應用本發明的 LAMP引物及方法，可快速、準確的檢測出單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀 瘤疹病毒和巨細胞病毒。
【附圖說明】
[0165] 圖1為實施例2的LAMP擴增曲線圖。
[0166] 圖2為實施例6的LAMP擴增曲線圖。
【具體實施方式】
[0167] W下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。W下實施例中的定量試驗，均設置=次重復實驗，結果取平 均值。
[0168] pGEM-T Easy Vector載體：購自promega公司，產品貨號A1360。
[0169] 實施例1、引物設計及制備
[0170] 進行大量序列分析、比對獲得了用于鑒定單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、 巨細胞病毒和水痘-帶狀瘤疹病毒的若干引物。將各個引物進行預實驗，比較靈敏度、特異 性等性能，最終得到用于鑒定單純瘤疹病毒I型、單純瘤疹病毒II型、水痘-帶狀瘤疹病毒和 巨細胞病毒的四套LAMP引物組。
[0171] 用于鑒定單純瘤疹病毒I型的引物組，包括2條外引物巧3-1、83-1)，2條內引物 (FIP-UBIP-1)和2條環引物(LF-ULB-1)，各條引物序列如下所示(5'一3'）：
[0172] F3-U序列表的序列1) :TGCGGCTCGTGAAGACC;
[0173] B3-l(序列表的序列2) :TACGGCGACGGTGCGTA;
[0174] FIP-1 (序列表的序列3):TACTTACAGGAGCCCTTGGGACTGGACGGAGATTACACAGCG;
[01 巧]BIP-U序列表的序列4) :ACCAGCAGGGGGTGACTCTCGGGGATGAAGCGGCT;
[0176] LF-1(序列表的序列5) :CGGTGCTCCAGGATAAACT;
[0177] LB-1(序列表的序列6) :TGGACAGCATCGGGGG。
[0178] 用于鑒定單純瘤疹病毒II型的引物組，包括2條外引物(F3-2、B3-2)，2條內引物 (FIP-2、BIP-2)和2條環引物(LF-2、LB-2)，各條引物序列如下所示(5'一3'）：
[0179] F3-2(序列表的序列7) :TGCCCCATCCGAACGTC;
[0180] B3-2(序列表的序列8) :CTTCGAGGTGAGGCAGC;
[0181 ] FIP-2(序列表的序列9) :CCGCGGTCTCAAAGGCCAGCTTTAGCGCCGTCAGAC;
[0182] BIP-2 (序列表的序列 10): GGCTAGTGAAGATAAACGACAGCGTACTTGCAGGAGGGC;
[0183] LF-2(序列表的序列11) :AGGAATCCCAGGTTATCCTCTC;
[0184] LB-2(序列表的序列 12) :GACGGAGATCACACAATTTATCTG。
[0185] 用于鑒定水痘-帶狀瘤疹病毒的引物組，包括2條外引物(F3-3、B3-3)，2條內引物 (FIP-3、BIP-3)和2條環引物(LF-3、LB-3)，各條引物序列如下所不(5'一3'）：
[0186] F3-3(序列表的序列 13) :AGGATGAAGACGATGAACC;
[0187] B3-3(序列表的序列 14) :GTTTGGTCTTACGAATCCTC;
[018引 FIP-3(序列表的序列 15) :TTGACGGGGAAGGGGCGTGCGTTTCGGTGGGAAGT;
[0189] BIP-3(序列表的序列 16):CGGATGATTCGGACTCAAATGAGATCGGGACCGCTgATG;
[0190] LF-3(序列表的序列 17) :GACCTGCTGCCTGTAGTTTC;
[0191] LB-3(序列表的序列 18) :ACAAAATATCCAACCGGGATATCGA。
[0192] 用于鑒定巨細胞病毒的引物組，包括2條外引物(F3-4、B3-4)，2條內引物(FIP-4、 BIP-4)和2條環引物(LF-4、LB-4)，各條引物序列如下所示(5'^3'）：
[0193] F3-4(序列表的序列 19) :AACAATCCGGCCAGCAC;
[0194] B3-4(序列表的序列20) :CAGTAACGGCCTACCTG;
[01 巧]FIP-4(序列表的序列 21):AGTTGGGCGAGTTAGTCTTGGCTTGCGGGTTCGGTGGTTA;
[0196] BIP-4(序列表的序列22): ATAAGCTCAACACTATGGCCGACGAAACAACGCGGGATG;
[0197] LF-4(序列表的序列23) :GCATACGGGGTACATGTCGA;
[019引 LB-4(序列表的序列24) :GCTTTACCTGCGGCAACGC。
[0199] 用于鑒定單純瘤疹病毒I型的引物組命名為引物組I。
[0200] 用于鑒定單純瘤疹病毒II型的引物組命名為引物組II。
[0201] 用于鑒定水痘-帶狀瘤疹病毒的引物組命名為引物組III。
[0202] 用于鑒定巨細胞病毒的引物組命名為引物組IV。
[0203] 引物組I、引物組II、引物組HI和引物組IV組成引物組合。
[0204] 實施例2、檢測方法建立
[02化]1、提取待測病毒的基因組DNA或提取待測生物樣本的總DNA。
[0206] 2、取步驟1得到的DNA，作為模板，采用實施例1中制備的引物組I進行LAMP擴增。
[0207] LAMP 擴增的反應體系：1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜堿，0.1 化 50mg/ ml BSA，0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen，0.1f5]iL lOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，1化引物混合物巧3-1、83-1少1?-1、81?-1、口^-巧化8-1的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇補足至10化。反應體系中各引物的濃度如下：0.5iiM F3-1、0.5iiMB3-l、 化M FIP-1、化M BIP-1、化M LF-1、化M LB-1。
[0208] LAMP擴增的反應程序：65°C恒溫50min。反應過程中，采用巧光PCR儀檢測巧光信 號。
[0209] 3、取步驟1得到的DNA，作為模板，采用實施例1中制備的引物組II進行LAMP擴增。
[0210] LAMP 擴增的反應體系：1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜堿，0.1 化 50mg/ ml BSA，0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen，0.1f5]iL lOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，1化引物混合物巧3-2、83-2少1?-2、81?-2、口^-2和1^8-2的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇補足至10化。反應體系中各引物的濃度如下：0.5iiM F3-2，0.5iiMB3-2， 化M FIP-2,化M BIP-2,化M LF-2,化M LB-2。
[0211] LAMP擴增的反應程序：65°C恒溫50min。反應過程中，采用巧光PCR儀檢測巧光信 號。
[0212] 4、取步驟1得到的DNA，作為模板，采用實施例1中制備的引物組n I進行LAMP擴增。
[0213] LAMP 擴增的反應體系：1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜堿，0.1 化 50mg/ ml BSA，0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen，0.1f5]iL lOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，1化引物混合物巧3-3、83-3少1?-3、81?-3、口^-3和1^8-3的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇補足至10化。反應體系中各引物的濃度如下：0.5iiM F3-3，0.5iiMB3-3， 化M FIP-3,化M BIP-3,化M LF-3,化M LB-3。
[0214] LAMP擴增的反應程序：65°C恒溫50min。反應過程中，采用巧光PCR儀檢測巧光信 號。
[0215] 5、取步驟1得到的DNA，作為模板，采用實施例1中制備的引物組IV進行LAMP擴增。
[0216] LAMP 擴增的反應體系：1 化 lOXThermoPol Buffera.化 L 5M 甜菜堿，0.1 化 50mg/ ml BSA，0.4]iL lOOmM MgS〇4,0.3]iL 20XEvaGreen，0.1f5]iL lOOmM dNTPs，0.4]iL 8U/ml Bst DNA聚合酶大片段，1化引物混合物巧3-4、83-4少1?-4、81?-4、口^-巧化8-4的混合物）， 2ng模板DNA，用d地2〇補足至10化。反應體系中各引物的濃度如下:0.5iiM F3-4，0.5iiMB3-4， 化M FIP-4,化M BIP-4,化M LF-4,化M LB-4。
[0217] LAMP擴增的反應程序：65°C恒溫50min。反應過程中，采用巧光PCR儀檢測巧光信 號。
[0218] 如果采用引物組I可W得到陽性擴增曲線，表明待測病毒為單純瘤疹病毒I型；如 果采用引物組II可W得到陽性擴增曲線，表明待測病毒為單純瘤疹病毒II型；如果采用引 物組III可W得到陽性擴增曲線，表明待測病毒為水痘-帶狀瘤疹病毒;如果采用引物組IV 可W得到陽性擴增曲線，表明待測病毒為巨細胞病毒。
[0219] 如果采用引物組I可W得到陽性擴增曲線，表明待測樣本感染了單純瘤疹病毒I 型;如果采用引物組II可W得到陽性擴增曲線，表明待測樣本感染了單純瘤疹病毒II型;如 果采用引物組III可W得到陽性擴增曲線，表明待測樣本感染了水痘-帶狀瘤疹病毒;如果 采用引物組IV可W得到陽性擴增曲線，表明待測樣本感染了巨細胞病毒。
[0220] 實施例3、參考品質粒構建
[0221] 單純瘤疹病毒I型參考品質粒:將序列表的序列25所示的雙鏈DNA分子插入pGEM-T Easy Vector載體的Apal和SacI酶切位點之間，得到參考品質粒。
[0222] 單純瘤疹病毒II型參考品質粒:將序列表的序列26所示的雙鏈DNA分子插入pGEM- T Easy Vector載體的Apal和SacI酶切位點之間，得到參考品質粒。
[0223] 水痘-帶狀瘤疹病毒參考品質粒：將序列表的序列27所示的雙鏈DNA分子插入 pGEM-T Easy Vector載體的Apal和SacI酶切位點之間，得到參考品質粒。
[0224] 巨細胞病毒參考品質粒:將序列表的序列28所示的雙鏈DNA分子插入pGEM-T化sy Vector載體的Apal和SacI酶切位點之間，得到參考品質粒。
[0225] 實施例4、特異性
[0226] 待測樣本分別為:單純瘤疹病毒I型參考品質粒DNA、單純瘤疹病毒II型參考品質 粒DNA、水痘-帶狀瘤疹病毒參考品質粒DNA、巨細胞病毒參考品質粒DNA。
[0227] 采用實施例2的檢測方法進行檢測。
[0228] 結果見圖1。圖1中，橫坐標為循環數，縱坐標為巧光信號強度，其中，A為采用引物 組I時各個待測樣本的擴增曲線，B為采用引物組II時各個待測樣本的擴增曲線，C為采用引 物組III時各個待測樣本的擴增曲線，D為采用引物組IV時各個待測樣本的擴增曲線。由圖 1A可見，單純瘤疹病毒I型參考品質粒DNA得到S型擴增曲線，擴增結果為陽性，單純瘤疹病 毒II型參考品質粒DNA、水痘-帶狀瘤疹病毒參考品質粒DNA和巨細胞病毒參考品質粒DNA均 沒有得到S型擴增曲線，擴增結果為陰性。由圖1B可見，單純瘤疹病毒II型參考品質粒DNA得 至化型擴增曲線，擴增結果為陽性，單純瘤疹病毒I型參考品質粒DNA、水痘-帶狀瘤疹病毒參 考品質粒DNA和巨細胞病毒參考品質粒DNA均沒有得到S型擴增曲線，擴增結果為陰性。由圖 1C可見，水痘-帶狀瘤疹病毒參考品質粒DNA得到S型擴增曲線，擴增結果為陽性，單純瘤疹 病毒I型參考品質粒DNA、水痘-帶狀瘤疹病毒參考品質粒DNA和巨細胞病毒參考品質粒DNA 均沒有得到S型擴增曲線，擴增結果為陰性。結果表明，實施例1制備的引物組合均具有很高 的特異性。
[0229] 實施例5、靈敏度
[0230] 待測樣本為分別為:單純瘤疹病毒I型參考品質粒DNA、單純瘤疹病毒II型參考品 質粒DNA、水痘-帶狀瘤疹病毒參考品質粒DNA、巨細胞病毒參考品質粒DNA。
[0231] 1、用無菌水10倍梯度稀釋各待測樣本，得到各稀釋液。
[0232] 2、分別取步驟1得到的各稀釋液作為模板，采用實施例2的檢測方法進行檢測。
[0233] 由于采用的稀釋度不同，形成如下不同的反應體系：
[0234] 反應體系1中，參考品質粒DNA的初始含量為:10000個拷貝；
[0235] 反應體系2中，參考品質粒DNA的初始含量為:1000個拷貝；
[0236] 反應體系3中，參考品質粒DNA的初始含量為:500個拷貝；
[0237] 反應體系4中，參考品質粒DNA的初始含量為:100個拷貝。
[0238] 每種病毒參考品質粒分別按上述4個體系進行檢測。
[0239] 結果表明，單純瘤疹病毒I型參考品質粒、單純瘤疹病毒II型參考品質粒、水痘-帶 狀瘤疹病毒參考品質粒、巨細胞病毒參考品質粒的DNA含量為500-10000個拷貝時均得到S 型擴增曲線，單純瘤疹病毒I型參考品質粒、單純瘤疹病毒II型參考品質粒、水痘-帶狀瘤疹 病毒參考品質粒、巨細胞病毒參考品質粒的DNA濃度濃度為100個拷貝時均沒有得到S型擴 增曲線。該結果表明本發明所提供的用于檢測4種眼科感染病毒的LAMP引物組合具有較高 的靈敏度。
[0240] 實施例6、臨床樣本檢測
[0241] 待測樣本為:經過臨床鑒定為單純瘤疹病毒I型陽性的眼部抽吸物樣本、經過臨床 鑒定為單純瘤疹病毒II型陽性的眼部抽吸物樣本、經過臨床鑒定為水痘-帶狀瘤疹病毒陽 性的眼部抽吸物樣本、經過臨床鑒定為巨細胞病毒的眼部抽吸物樣本和經過臨床鑒定不存 在單純瘤疹病毒I型、水痘-帶狀瘤疹病毒、巨細胞病毒的健康者的眼部抽吸物樣本。
[0242] 采用實施例2的檢測方法進行檢測。
[0243] 結果見圖2。圖2中，橫坐標為循環數，縱坐標為巧光信號強度，其中，A為采用引物 組I時各個待測樣本的擴增曲線，B為采用引物組II時各個待測樣本的擴增曲線，C為采用引 物組III時各個待測樣本的擴增曲線，D為采用引物組IV時各個待測樣本的擴增曲線。由圖 2A可見，只有單純瘤疹病毒I型陽性樣本得到S型擴增曲線（經測序，如序列表的序列25所 示），單純瘤疹病毒II型陽性樣本、水痘-帶狀瘤疹病毒陽性樣本和巨細胞病毒陽性樣本均 沒有得到S型擴增曲線，與臨床鑒定結果相符。由圖2B可見，只有單純瘤疹病毒II型陽性樣 本得到S型擴增曲線(經測序，如序列表的序列26所示），單純瘤疹病毒I型陽性樣本、水痘- 帶狀瘤疹病毒陽性樣本和水痘-帶狀瘤疹病毒陽性樣本均沒有得到S型擴增曲線，與臨床鑒 定結果相符。由圖2C可見，只有水痘-帶狀瘤疹病毒陽性樣本得到S型擴增曲線(經測序，如 序列表的序列27所示），單純瘤疹病毒I型陽性樣本、單純瘤疹病毒II型陽性樣本和巨細胞 病毒陽性樣本均沒有得到S型擴增曲線，與臨床鑒定結果相符。由圖2D可見，只有巨細胞病 毒陽性樣本得到S型擴增曲線(經測序，如序列表的序列28所示），單純瘤疹病毒I型陽性樣 本、單純瘤疹病毒II型陽性樣本和水痘-帶狀瘤疹病毒陽性樣本均沒有得到S型擴增曲線， 與臨床鑒定結果相符。結果表明，使用實施例1制備的引物組合進行病毒鑒定，結果準確可 靠。健康組織不顯示陽性S型擴增曲線，證明四個引物組對于人正常基因組來說不存在非特 異性擴增。
【主權項】
1.引物組合，由引物組I、引物組II、引物組III和引物組IV組成； 所述引物組I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1組 成； 所述引物F3-1為如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-1為如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-1為如下(a5)或(a6): (a5)序列表的序列3所不的單鏈DNA分子； (a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-1為如下(a7)或(a8): (a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LB-1為如下(a9)或(alO): (a9)序列表的序列5所不的單鏈DNA分子； (alO)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LF-1為如下(all)或(al2): (all)序列表的序列6所不的單鏈DNA分子； (al2)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同 功能的DNA分子； 所述引物組II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2組 成； 所述引物F3-2為如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-2為如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-2為如下(b5)或(b6): (b5)序列表的序列9所不的單鏈DNA分子； (b6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-2為如下(b7)或(b8): (b7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子； (b8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-2為如下(b9)或(blO): (b9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子； (blO)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-3為如下(bll)或(bl2): (bll)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子； (bl2)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相 同功能的DNA分子； 所述引物組III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物LF-3組 成； 所述引物F3-3為如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子； (c2)將序列13經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相 同功能的DNA分子； 所述引物B3-3為如下(c3)或(c4): (c3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子； (c4)將序列14經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相 同功能的DNA分子； 所述引物FIP-2為如下(c5)或(c6): (c5)序列表的序列15所不的單鏈DNA分子； (c6)將序列15經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相 同功能的DNA分子； 所述引物BIP-3為如下(c7)或(c8): (c7)序列表的序列16所不的單鏈DNA分子； (c8)將序列16經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-3為如下(c9)或(clO): (c9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子； (clO)將序列17經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-3為如下(ell)或(cl2): (ell)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子； (cl2)將序列18經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相 同功能的DNA分子； 所述引物組IV由引物F3-4、引物B3-4、引物FIP-4、引物BIP-4、引物LB-4和引物LF-4組 成； 所述引物F3-4為如下(dl)或(d2): (dl)序列表的序列19所示的單鏈DNA分子； (d2)將序列19經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相 同功能的DNA分子； 所述引物B3-4為如下(d3)或(d4): (d3)序列表的序列20所示的單鏈DNA分子； (d4)將序列20經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相 同功能的DNA分子； 所述引物FIP-4為如下(d5)或(d6): (d5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子； (d6)將序列21經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相 同功能的DNA分子； 所述引物BIP-4為如下(d7)或(d8): (d7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子； (d8)將序列22經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-4為如下(d9)或(dlO): (d9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子； (dlO)將序列23經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-4為如下(dll)或(dl2): (dll)序列表的序列24所示的單鏈DNA分子； (dl2)將序列24經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相 同功能的DNA分子。2.權利要求1所述引物組合的應用，為如下(el)至(e6)中的任意一種： (el)鑒別單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型、水痘-帶狀皰疹病毒和巨細胞病毒； (e2)制備用于鑒別單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型、水痘-帶狀皰疹病毒和巨細 胞病毒的試劑盒； (e3)鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型或水痘-帶狀皰疹病 毒或巨細胞病毒； (e4)制備用于鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型或水痘-帶 狀皰疹病毒或巨細胞病毒的試劑盒； (e5)鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型和/或單純皰疹病毒II型和/或水痘-帶狀皰疹病毒和/或巨細胞病毒； (e6)制備用于鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型和/或單純皰疹病毒II型和/ 或水痘-帶狀皰疹病毒和/或巨細胞病毒的試劑盒。3. 含有權利要求1所述引物組合的試劑盒；所述試劑盒的用途為如下（Π )或（f2)或 (f3)： (Π )鑒別單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型、水痘-帶狀皰疹病毒和巨細胞病毒； (f2)鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型或水痘-帶狀皰疹病 毒或巨細胞病毒； (f3)鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型和/或單純皰疹病毒II型和/或水痘-帶狀皰疹病毒和/或巨細胞病毒。4. 權利要求3所述試劑盒的制備方法，包括將各條引物單獨包裝的步驟。5. -種鑒別待測病毒為單純皰疹病毒I型、單純皰疹病毒II型、水痘-帶狀皰疹病毒還 是巨細胞病毒的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測病毒的基因組DNA; (2) 以步驟（1)得到的基因組DNA為模板，分別采用權利要求1所述引物組合的引物組I、 弓丨物組II、引物組III和引物組IV進行LAMP擴增反應，如果采用引物組I可以實現以所述基 因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為單純皰疹病毒I型，如果采用引物組II可以實現以 所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為單純皰疹病毒II型，如果采用引物組III可 以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為水痘-帶狀皰疹病毒，如果采用引 物組IV可以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為巨細胞病毒。6. -種輔助鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型或單純皰疹病毒II型或水痘-帶狀 皰疹病毒或巨細胞病毒的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測病毒的基因組DNA; (2) 以步驟（1)得到的基因組DNA為模板，分別采用權利要求1所述引物組合的引物組I、 弓丨物組II、引物組III和引物組IV進行LAMP擴增反應，如果采用引物組I可以實現以所述基 因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為或候選為單純皰疹病毒I型，如果采用引物組II可 以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為或候選為單純皰疹病毒II型，如果 采用引物組III可以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為或候選為水痘-帶狀皰疹病毒，如果采用引物組IV可以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒 為或候選為巨細胞病毒，如果使用引物組I、引物組II、引物組III和引物組IV均不能實現以 所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測病毒為非單純皰疹病毒I型且非單純皰疹病毒II型 且非水痘-帶狀皰疹病毒且非巨細胞病毒。7. -種鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型和/或單純皰疹病毒II型和/或水 痘-帶狀皰疹病毒和/或巨細胞病毒的方法，包括如下步驟： (1) 提取待測樣本的總DNA; (2) 以步驟（1)得到的總DNA為模板，分別采用權利要求1所述引物組合的引物組I、引物 組II、引物組III和引物組IV進行LAMP擴增反應，如果采用引物組I可以實現以所述基因組 DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似感染了單純皰疹病毒I型，如果采用引物組II可以實 現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似感染了單純皰疹病毒II型，如果采用 引物組III可以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似感染了水痘-帶狀 皰疹病毒，如果采用引物組IV可以實現以所述基因組DNA為模板的陽性擴增、待測樣品疑似 感染了巨細胞病毒，如果使用引物組I、引物組II、引物組III和引物組IV均不能實現以所述 基因組DNA為模板的陽性擴增、待測樣本疑似未感染單純皰疹病毒I型且疑似未感染單純皰 疹病毒II型且疑似未感染水痘-帶狀皰疹病毒且疑似未感染巨細胞病毒。8.引物組I或引物組II或引物組III或引物組IV; 所述引物組I由引物F3-1、引物B3-1、引物FIP-1、引物BIP-1、引物LB-1和引物LF-1組 成； 所述引物F3-1為如下(al)或(a2): (al)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子； (a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-1為如下(a3)或(a4): (a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子； (a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-1為如下(a5)或(a6): (a5)序列表的序列3所不的單鏈DNA分子； (a6)將序列3經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列3具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-1為如下(a7)或(a8): (a7)序列表的序列4所示的單鏈DNA分子； (a8)將序列4經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列4具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LB-1為如下(a9)或(alO): (a9)序列表的序列5所不的單鏈DNA分子； (alO)將序列5經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列5具有相同 功能的DNA分子； 所述引物LF-1為如下(all)或(al2): (all)序列表的序列6所不的單鏈DNA分子； (al2)將序列6經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列6具有相同 功能的DNA分子； 所述引物組II由引物F3-2、引物B3-2、引物FIP-2、引物BIP-2、引物LB-2和引物LF-2組 成； 所述引物F3-2為如下(bl)或(b2): (bl)序列表的序列7所示的單鏈DNA分子； (b2)將序列7經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列7具有相同 功能的DNA分子； 所述引物B3-2為如下(b3)或(b4): (b3)序列表的序列8所示的單鏈DNA分子； (b4)將序列8經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列8具有相同 功能的DNA分子； 所述引物FIP-2為如下(b5)或(b6): (b5)序列表的序列9所不的單鏈DNA分子； (b6)將序列9經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列9具有相同 功能的DNA分子； 所述引物BIP-2為如下(b7)或(b8): (b7)序列表的序列10所示的單鏈DNA分子； (b8)將序列10經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列10具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-2為如下(b9)或(blO): (b9)序列表的序列11所示的單鏈DNA分子； (blO)將序列11經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列11具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-3為如下(bll)或(bl2): (bll)序列表的序列12所示的單鏈DNA分子； (bl2)將序列12經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列12具有相 同功能的DNA分子； 所述引物組III由引物F3-3、引物B3-3、引物FIP-2、引物BIP-3、引物LB-3和引物LF-3組 成； 所述引物F3-3為如下(cl)或(c2): (cl)序列表的序列13所示的單鏈DNA分子； (c2)將序列13經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列13具有相 同功能的DNA分子； 所述引物B3-3為如下(c3)或(c4): (c3)序列表的序列14所示的單鏈DNA分子； (c4)將序列14經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列14具有相 同功能的DNA分子； 所述引物FIP-2為如下(c5)或(c6): (c5)序列表的序列15所不的單鏈DNA分子； (c6)將序列15經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列15具有相 同功能的DNA分子； 所述引物BIP-3為如下(c7)或(c8): (c7)序列表的序列16所不的單鏈DNA分子； (c8)將序列16經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列16具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-3為如下(c9)或(clO): (c9)序列表的序列17所示的單鏈DNA分子； (clO)將序列17經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列17具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-3為如下(ell)或(cl2): (ell)序列表的序列18所示的單鏈DNA分子； (cl2)將序列18經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列18具有相 同功能的DNA分子； 所述引物組IV由引物F3-4、引物B3-4、引物FIP-4、引物BIP-4、引物LB-4和引物LF-4組 成； 所述引物F3-4為如下(dl)或(d2): (dl)序列表的序列19所示的單鏈DNA分子； (d2)將序列19經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列19具有相 同功能的DNA分子； 所述引物B3-4為如下(d3)或(d4): (d3)序列表的序列20所示的單鏈DNA分子； (d4)將序列20經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列20具有相 同功能的DNA分子； 所述引物FIP-4為如下(d5)或(d6): (d5)序列表的序列21所示的單鏈DNA分子； (d6)將序列21經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列21具有相 同功能的DNA分子； 所述引物BIP-4為如下(d7)或(d8): (d7)序列表的序列22所示的單鏈DNA分子； (d8)將序列22經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列22具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LB-4為如下(d9)或(dlO): (d9)序列表的序列23所示的單鏈DNA分子； (dlO)將序列23經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列23具有相 同功能的DNA分子； 所述引物LF-4為如下(dll)或(dl2): (dll)序列表的序列24所示的單鏈DNA分子； (dl2)將序列24經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列24具有相 同功能的DNA分子。9.權利要求8所述引物組I在制備試劑盒甲中的應用，或，所述引物組II在制備試劑盒 乙中的應用，或，所述引物組III在制備試劑盒丙中的應用，或，所述引物組IV在制備試劑盒 丁中的應用； 所述試劑盒甲的用途為如下(gl)或(g2): (gl)鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型； (g2)鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型； 所述試劑盒乙的用途為如下(g3)或(g4): (g3)鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒II型； (g4)鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒II型； 所述試劑盒丙的用途為如下(g5)或(g6): (g5)鑒定待測病毒是否為水痘-帶狀皰疹病毒； (g6)鑒定待測樣本是否感染了水痘-帶狀皰疹病毒； 所述試劑盒丁的用途為如下(g7)或(g8): (g7)鑒定待測病毒是否為巨細胞病毒； (g8)鑒定待測樣本是否感染了巨細胞病毒。10.含有權利要求8所述引物組I的試劑盒甲，或，含有權利要求8所述引物組II的試劑 盒乙，或，含有權利要求8所述引物組III的試劑盒丙，或，含有權利要求8所述引物組IV的試 劑盒丁； 所述試劑盒甲的用途為如下(gl)或(g2): (gl)鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒I型； (g2)鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒I型； 所述試劑盒乙的用途為如下(g3)或(g4): (g3)鑒定待測病毒是否為單純皰疹病毒II型； (g4)鑒定待測樣本是否感染了單純皰疹病毒II型； 所述試劑盒丙的用途為如下(g5)或(g6): (g5)鑒定待測病毒是否為水痘-帶狀皰疹病毒； (g6)鑒定待測樣本是否感染了水痘-帶狀皰疹病毒； 所述試劑盒丁的用途為如下(g7)或(g8): (g7)鑒定待測病毒是否為巨細胞病毒； (g8)鑒定待測樣本是否感染了巨細胞病毒。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048088SQ201610404661
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月8日
【發明人】陶勇
【申請人】首都醫科大學附屬北京朝陽醫院