快速測定囊泡病毒滴度的方法
【專利摘要】本發明涉及生物技術領域，具體而言，公開了一種用于囊泡病毒滴度的快速檢測方法。該方法重懸對數生長期Sf9昆蟲細胞；置培養箱中靜置培養30分鐘至細胞貼壁，棄上清培養基，換用新的Sf?900IISFM培養基；利用血小球計數板測定細胞濃度；取Sf9昆蟲細胞懸液與囊泡病毒稀釋液混勻后接種至96孔細胞培養盤；置于培養箱中培養24小時后，每孔加臺盼藍染色液，統計每孔被染色細胞個數、總細胞個數。計算每孔Sf9昆蟲細胞死亡率，每孔的死細胞率低于對照組的死細胞率，認定該孔被囊泡病毒侵染，反之則認為該孔未被病毒侵染，根據公式計算囊泡病毒的TCID50。本發明測定囊泡病毒滴度的方法結合了細胞染色，可用于囊泡病毒滴度的快速測定，測定結果更為準確。
【專利說明】
快速測定囊泡病毒滴度的方法
技術領域
[0001] 本發明設及測定病毒滴度的方法，具體地指一種快速測定囊泡病毒滴度的方法。
【背景技術】
[0002] 囊泡病毒(ascovirus)是一類主要侵染鱗翅目夜蛾科昆蟲的DNA病毒。囊泡病毒粒 子含一個環狀超螺旋雙鏈DNA，病毒基因組大小依種的不同從11化bp(DpAV4)到185kbp (HvAV3)不等。囊泡病毒基因組包含兩組重復序列。第一組依種的不同大小從l.lkbp到 3.8化P，目前所知在生理上并沒有什么特殊的作用。第二組大小約0.3~1.化bp，編碼桿狀 病毒重復開讀框基因序列。囊泡病毒侵染宿主幼蟲后宿主幼蟲表現為生長發育遲緩，肌肉 彈性降低，取食量減少等癥狀。細胞病理學特征顯示侵染初期細胞核肥大，隨之核膜破裂， 細胞過度增長，細胞質膜嵌入細胞內部，將細胞劃分為20~30個小囊。病毒從囊泡內生成， 囊泡相互分離后在血淋己中累積。侵染3、4天后，病毒大量復制，在血淋己中的濃度達到1〇8 個含毒顆粒/毫升，血淋己呈乳白色，運是囊泡病毒侵染的顯著特征。因此，從感病幼蟲收集 的血淋己中，除含有大量的病毒粒子外，還含有包含病毒粒子的囊泡。900由于囊泡病毒特 殊的細胞病理學特征，迄今未有較為理想的囊泡病毒滴度測定方法，嚴重影響了囊泡病毒 及相關學科的研究進程。
[0003] 而今，病毒學及分子生物學等學科的飛速發展，病毒滴度測定方法呈現簡單快速 等特點。目前最常見的滴度測定方法有兩種，分別為隧斑法和終點稀釋法，
[0004] 1)隧斑法(plaque assay)是測定病毒滴度經典且被廣大病毒學家較認可的方法， 其原理為:單個隧菌斑是由一個病毒粒子產生的，通過隧斑數和稀釋度的換算，獲得病毒滴 度，W隧斑形成單位(PFU/mL)表示。該方法檢測時間長，易受細胞質量、單層細胞密度、瓊脂 糖的一致性、解育時間和操作者熟練程度等多種因素的影響，且相鄰的隧斑可能聯合到一 起，降低了隧斑數，也可能母斑病毒產生子斑，增加了隧斑數，導致試驗重復性差，即結果不 同。
[0005] 2)終點稀釋法（end-point dilution assay)W50%組織培養侵染劑量（TCID加)表 示，是指能使半數單層細胞孔(管）出現病變的病毒稀釋度，是使用較廣泛的一種病毒含量 測定方法，該方法主要通過觀察細胞病變來確定病毒的滴度。然而，由于囊泡病毒侵染昆蟲 細胞引起的細胞病變不明顯，漏檢及誤判可能性非常大，即主觀和經驗因素對檢測結果的 影響較大，故依照傳統的終點稀釋法測定囊泡病毒滴度有很大缺陷。
[0006] 綜上所述，由于囊泡病毒特殊的細胞病理學特征W及現有病毒滴度測定方法的明 顯缺陷，導致目前尚沒有一種快速簡便測定囊泡病毒滴度的方法。

【發明內容】

[0007] 本發明克服了傳統的終點稀釋法和隧斑法檢測囊泡病毒滴度的技術缺陷，提供一 種快速測定囊泡病毒滴度方法，該方法是通過囊泡病毒侵染單層昆蟲細胞，致使細胞病變， 結合細胞活力染色，在顯微鏡下觀察細胞是否被侵染，統計昆蟲細胞死亡率，并計算病毒滴 度。
[0008] 為實現上述目的，本發明提供的一種快速測定囊泡病毒滴度的方法，包括W下步 驟：
[0009] 1)制備昆蟲細胞懸液:將昆蟲細胞置于Sf-900II SFM液體培養基中進行培養，得 到對數生長期的昆蟲細胞，然后用Sf-900II SFM液體培養基對昆蟲細胞進行稀釋，得到昆 蟲細胞懸液，其中，Sf-900II SFM液體培養基購于gibco公司；
[0010] 2)制備待測囊泡病毒稀釋液:將待測囊泡病毒使用Sf-900II SFM液體培養基十倍 梯度稀釋備用，得到不同稀釋度的待測囊泡病毒稀釋液；
[0011] 3)制備細胞病毒懸液:將步驟2)得到的不同稀釋度的待測囊泡病毒稀釋液分別與 步驟1)得到昆蟲細胞懸液混合，得到不同稀釋度的細胞病毒懸液；
[0012] 4)囊泡病毒侵染：將步驟3)得到不同稀釋度的細胞病毒懸液接種至細胞培養盤 內，置于細胞培養箱中培養20~30h，在20~30h內細胞調亡明顯，但病毒侵染時間過長，被 病毒侵染的細胞破裂，釋放出病毒粒子和囊泡，不利于后續染色試驗和死細胞個數統計；
[0013] 5)臺吩藍染色:取出上述細胞培養盤，并向細胞培養孔中滴加臺吩藍染色液染色， 混合均勻，染色2~3分鐘，在顯微鏡下計數每孔被染色的死細胞個數和細胞總個數；
[0014] 6)囊泡病毒滴度計算：根據每孔的死細胞個數和細胞總個數計算每孔細胞死亡 率，即每孔細胞死亡率=每孔死細胞個數/該孔細胞總個數，從而統計細胞培養盤中，每個 稀釋度細胞病毒懸液的侵染孔數;計算囊泡病毒的TCIDso。
[0015] 進一步地，所述步驟1)中，昆蟲細胞的為草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda卵巢 細胞Sf9細胞、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢細胞Sf21細胞、粉紋夜蛾 Trichoplusia ni曲bner卵細胞系H巧細胞中任意一種。
[0016] 再進一步地，所述步驟1)中，所述昆蟲細胞懸液中，昆蟲細胞的個數為1.0~9.9X 1〇5個/1111^。
[0017] 再進一步地，所述步驟2)中，囊泡病毒為狀4￥3、5'4￥1、化4￥2和564￥5中任意一種。
[0018] 再進一步地，所述步驟2)中，待測囊泡病毒稀釋液的稀釋度的梯度為2~10。
[0019] 再進一步地，所述步驟3)中，待測囊泡病毒稀釋液與昆蟲細胞懸液的體積比為1:8 ~15。
[0020] 再進一步地，所述步驟4)中，細胞病毒懸液接種至細胞培養盤的具體步驟如下：
[0021] 1)處理組:每一排或列的細胞培養孔內均接種同樣稀釋度的細胞病毒懸液，
[0022] 2)對照組:保留一排或列的細胞培養孔內均接種Sf-900II SFM液體培養基與昆蟲 細胞懸液的混合液；
[0023] 其中，每個孔的接種量均為100~20化L。
[0024] 再進一步地，所述步驟5)中，臺吩藍染色液的質量分數為0.3~0.6%，臺吩藍染色 液滴加量為7~30iiL。
[0025] 再進一步地，所述步驟6)中，根據每孔細胞死亡率計算對照組的平均細胞死亡率， 即對照組的平均細胞死亡率=對照組每孔細胞死亡率之和/對照組孔數；比較處理組每孔 細胞死亡率和對照組的平均死亡率，判斷接種病毒的處理組是否被病毒侵染，
[0026] 若處理組的某孔內細胞死亡率大于對照組的平均細胞死亡率，則判定該孔被病毒 侵染，即該孔為陽性，
[0027] 或，若處理組的某孔內細胞死亡率小于對照組的平均細胞死亡率，則判定該孔未 被病毒侵染，即該孔為陰性；
[0028] 由上述判定統計每個病毒稀釋度處理組的侵染孔數，計算該病毒稀釋度處理組的 侵染率，即每組處理侵染率=該組侵染孔數/該組總孔數，從而根據Reed-Muench法計算囊 泡病毒的TCIDso
[0029] 旨P，距離比例=(高于50%的病變率-50%)/(高于50%的病變率-低于50%病變 率）
[0030] 1巧CI化0 =高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數-距離比例。
[0031] 本發明的有益效果在于：
[0032] 本發明方法操作簡單、結果精確、耗時短、穩定性好。該方法能W較高的檢測準確 度測定囊泡病毒滴度;本發明所述的滴度檢測方法測定囊泡病毒滴度僅需2天，而傳統的終 點稀釋法則需要8-10天，隧斑形成需要很多個感染周期，得到最終結果通常需要S個星期， 大大縮短了檢測時間。囊泡病毒侵染細胞后沒有明顯的細胞病變特征，單純的顯微鏡觀察 無法判斷細胞是否被病毒侵染，故傳統的終點稀釋法無法準確檢測囊泡病毒滴度。相比較 傳統的終點稀釋法和隧斑法，本發明所述方法檢測周期縮短6-8天，檢測效率高，不僅大大 縮短了操作時間，節約成本，實驗結果更具預料性，在不同操作個體間也更精確穩定。本發 明對操作人員的要求相對較低，不可控因素較小，實驗結果的操作穩定性較高。
【具體實施方式】
[0033] 為了更好地解釋本發明，W下結合具體實施例進一步闡明本發明的主要內容，但 本發明的內容不僅僅局限于W下實施例。
[0034] 實施例1囊泡病毒HvAV-化滴度的快速測定
[0035] 具體步驟如下：
[0036] 1.制備囊泡病毒HvAV-化梯度稀釋液
[0037] 將待測囊泡病毒液HvAV-化用Sf-900II SFM培養基梯度稀釋，滿旋振蕩30秒混勻。 具體稀釋度如表1所示。
[0038] 表1囊泡病毒稀釋方案
[0039]
[0040] 2.制備昆蟲細胞懸液
[0041] 取足量Sf9昆蟲細胞培養物按常規傳代方法收集昆蟲細胞，靜置30min后棄去上清 培養基，換用新鮮Sf-900II SFM培養基，用槍吹打使昆蟲細胞懸浮，用血細胞計數板計數細 胞個數，并用Sf-900IISFM培養基將細胞稀釋至濃度為1 X 105個/mL。
[0042] 3.制備細胞病毒懸液
[0043] 分別取1300化的昆蟲細胞懸液和13化L的病毒梯度稀釋液于1.5mL已滅菌的離屯、 管，輕輕混勻。
[0044] 4.病毒侵染
[0045] 取11化L細胞病毒懸液加入到96孔細胞培養盤中，每列為一個梯度稀釋的細胞懸 液，第一列為空，第二列到第六列病毒稀釋度分別為1〇^、1〇入1〇^、1〇^、1〇^，第屯列為不 加病毒梯度稀釋液的對照組，做好相應標記，置細胞培養箱中培養24小時。
[0046] 表2 96孔盤加樣分布
[0047]
[004引 4.昆蟲細胞染色
[0049] 取出96孔培養盤，每孔加 lOiiLO. 4%的臺吩藍染色液，輕輕晃動混勻。
[(K)加]5.實驗結果觀察
[0051]臺吩藍染色2-3分鐘后，在顯微鏡下計數每孔被染色的細胞個數和細胞總個數。 [0化2] 6.數據處理
[0053]通過計數細胞個數，計算每孔的細胞死亡率，根據對照組的平均細胞死亡率，判斷 接種病毒的處理組是否被病毒侵染，若處理組的細胞死亡率大于對照組的平均細胞死亡 率，該孔被病毒侵染，則判定該孔為陽性，反之則為陰性。
[0化4] 7.結果計算
[0化日]表3昆蟲細胞死亡率
[0化6]
[
[
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[0060] 按Reed-Muench法計算該病毒的TCIDsq值，具體計算方法如下：
[0061] 距離比例=(高于50%的侵染率-50%)/(高于50%的侵染率-低于50%的侵染率） Xlg稀釋倍數
[0062] =(58.33%-50%)/(58.33%-33.33%)
[0063] =0.3332
[0064] 1巧Cl化0 =高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數-距離比例 [00化]=-5.3332
[0066] TCID己o=l〇igT圓
[0067] = 10-5.3332
[006 引 由此可知，病毒的滴度為 105'3332TCID50/10 化，即 2.15X107TCID50/mL。
[0069] 上述Sf-900II SFM液體培養基購于gibco公司；其它材料均購于市面。
[0070] 其它未詳細說明的部分均為現有技術。盡管上述實施例對本發明做出了詳盡的描 述，但它僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部實施例，人們還可W根據本實施例在不經 創造性前提下獲得其他實施例，運些實施例都屬于本發明保護范圍。
【主權項】
1. 一種快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 制備昆蟲細胞懸液:將昆蟲細胞置于Sf-900II SFM液體培養基中進行培養，得到對 數生長期的昆蟲細胞，然后用Sf-900 II SFM液體培養基對昆蟲細胞進行稀釋，得到昆蟲細 胞懸液， 2) 制備待測囊泡病毒稀釋液:將待測囊泡病毒使用Sf-900 II SFM液體培養基十倍梯 度稀釋備用;得到不同稀釋度的待測囊泡病毒稀釋液； 3) 制備細胞病毒懸液:將步驟2)得到的不同稀釋度的待測囊泡病毒稀釋液分別與步驟 1)得到昆蟲細胞懸液混合，得到不同稀釋度的細胞病毒懸液； 4) 囊泡病毒侵染:將步驟3)得到不同稀釋度的細胞病毒懸液接種至細胞培養盤內，置 于細胞培養箱中培養20~30h; 5) 臺盼藍染色:取出上述細胞培養盤，并向細胞培養孔中滴加臺盼藍染色液染色，混合 均勻，染色2~3分鐘，在顯微鏡下計數每孔被染色的死細胞個數和細胞總個數； 6) 囊泡病毒滴度計算:根據每孔的死細胞個數和細胞總個數計算每孔細胞死亡率，即 每孔細胞死亡率=每孔死細胞個數/該孔細胞總個數，從而統計細胞培養盤中，每個稀釋度 細胞病毒懸液的侵染孔數;計算囊泡病毒的TCID 50。2. 根據權利要求1所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟1)中，昆 蟲細胞的為草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢細胞Sf9細胞、草地貪夜蛾Spodoptera frugiperda卵巢細胞Sf21細胞、粉紋夜蛾Trichoplusia ni卵細胞系Hi5細胞中任意一種。3. 根據權利要求1或2所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟1)中， 所述昆蟲細胞懸液中，昆蟲細胞的個數為1.0~9.9 X 105個/mL。4. 根據權利要求1或2所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟2)中， 囊泡病毒為HvAV3、Sf AVI、TnAV2和SeAV5中任意一種。5. 根據權利要求4所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟2)中，待 測囊泡病毒稀釋液的稀釋度的梯度為2~10。6. 根據權利要求1或2所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟3)中， 待測囊泡病毒稀釋液與昆蟲細胞懸液的體積比為1:8~15。7. 根據權利要求1或2所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟4)中， 細胞病毒懸液接種至細胞培養盤的具體步驟如下： 1) 處理組:每一排或列的細胞培養孔內均接種同樣稀釋度的細胞病毒懸液， 2) 對照組:保留一排或列的細胞培養孔內均接種Sf-900 II SFM液體培養基與昆蟲細 胞懸液的混合液； 其中，每個孔的接種量均為1〇〇~200yL。8. 根據權利要求1或2所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟5)中， 臺盼藍染色液的質量分數為0.3~0.6%，臺盼藍染色液滴加量為7~30yL。9. 根據權利要求1或2所述快速測定囊泡病毒滴度的方法，其特征在于:所述步驟6)中， 根據每孔細胞死亡率計算對照組的平均細胞死亡率，即對照組的平均細胞死亡率=對照組 每孔細胞死亡率之和/對照組孔數;比較處理組每孔細胞死亡率和對照組的平均死亡率，判 斷接種病毒的處理組是否被病毒侵染， 若處理組的某孔內細胞死亡率大于對照組的平均細胞死亡率，則判定該孔被病毒侵 染，即該孔為陽性， 或，若處理組的某孔內細胞死亡率小于對照組的平均細胞死亡率，則判定該孔未被病 毒侵染，即該孔為陰性； 由上述判定統計每個病毒稀釋度處理組的侵染孔數，計算該病毒稀釋度處理組的侵染 率，即每組處理侵染率=該組侵染孔數/該組總孔數，從而根據Reed-Muench法計算囊泡病 毒的TCID50 即，距離比例=(高于50 %的病變率-50 % )/(高于50 %的病變率-低于50 %病變率）， lgTCID5Q =高于50%病變的病毒最高稀釋度的對數-距離比例。
【文檔編號】C12Q1/06GK106048090SQ201610522012
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】萬虎, 韓寧寧, 李建洪, 陳子姝, 黃國華
【申請人】華中農業大學, 湖南農業大學