一種提取核酸的方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體的說是涉及一種提取核酸的方法及試劑盒。
【背景技術】
[0002] 作為攜帶遺傳信息的重要物質，核酸通常存在于復雜的實際樣品中，例如血液，細 胞，糞便，樹葉等等。這些樣品中的核酸通常無法直接被用于分子生物學實驗和檢測，需要 進一步的純化以去除干擾物質才能進行下游的一些實驗和分析。
[0003] 分離提取核酸的方法在文獻中多有報道（e.g.Chapter2(DNA)andChapter4 (RNA)ofF.Ausubeletal.,eds.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,ffiley-Interscience,NewYork, 1993)。這些方法通常需要將樣品在一定溶液中重懸并通過化學 試劑或者酶的方法將細胞破裂，將核酸釋放出來。這一過程稱為裂解。釋放出的核酸在溶液 中會可逆的結合于吸附核酸的材料上。這些材料包括玻璃顆粒，玻璃纖維，磁珠，硅藻土，硅 膠等，或者以上各種材料的變化或組合。高濃度的離液鹽將有利于核酸結合到上述材料上。 在接下來的步驟中，通過離心或者加入磁場等外界作用力，收集這些結合核酸的材料。這些 結合核酸的材料接下來會被特定溶液洗滌，例如80%乙醇，以去除雜質。最后這些結合核酸 的材料會被洗脫液處理并將核酸洗脫下來，一般是加熱至60度并以重蒸水進行洗脫。以此 原理為基礎，研究者報道了大量的提取核酸的方法。（e.g.US5,075,430;Markoetal.， Anal.Biochem.121,382-387,1982；Vogelsteinetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)76, 615-619,1979；Boometal.,J.Clin.Microbiol.28,495-503,1990；ChenandThomas, Anal.Biochem. 101，339-341，1980)。但是，目前的核酸提取方法在經過洗脫后所獲得的核 酸分子的量仍然不夠理想，需要進一步改進。
[0004] 另外，在實際應用中，隨著時間的推移，洗脫下來的核酸并不能穩定保存。這樣，通 過上述方法提取的核酸分子如果不能馬上進行下游的分析實驗，而是存放起來的話，核酸 分子就存在著不穩定的風險，也不利于下游分子生物學實驗在以后實驗中的重復。

【發明內容】

[0005] 有鑒于此，本發明的目的在于提供一種提取核酸的方法及基于所述方法的試劑 盒，使得所述方法能夠提取更多量的核酸分子；
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種提取核酸的方法及基于所述方法的試劑盒，使 得所述方法提取的核酸分子在4度條件下保存20天后仍能成功擴增并有效分型。
[0007] 為了實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0008] -種提取核酸的方法，包括：
[0009] 步驟1、向待提取樣品中加入裂解液裂解解釋放核酸分子，然后加入吸附核酸的材 料以及結合液對核酸分子進行吸附，獲得核酸-吸附材料復合物；
[0010]步驟2、將核酸-吸附材料復合物洗滌后，用含有表面活性劑的水溶液作為洗脫液 進行洗脫，收集洗脫下來的溶液，獲得目標核酸分子。
[0011] 為了能夠獲得更多量的核酸分子，本發明在洗脫液中增加了表面活性劑，一方面 有利于提高洗脫的得率，獲得更多量的核酸分子；另一方面表面活性劑也有利于提取后的 核酸長久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解。
[0012] 其中，作為優選，所述表面活性劑為離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。進 一步優選地，所述離子型表面活性劑為陰離子表面活性劑;更進一步優選，所述陰離子表面 活性劑為SDS，所述非離子型表面活性劑為TritonX-100。
[0013] 作為優選，所述洗脫液中表面活性劑的質量百分比濃度為0.1-1%，在本發明的一 些實施方式中，所述洗脫液為包含SDS的重蒸水，SDS濃度可以為0.1 %、0.5%或1 %，或者洗 脫液為包含TritonX-100的重蒸水，TritonX-100濃度為0 · 1 %。
[0014] 對于本發明所采用的裂解液、核酸吸附材料以及結合液(也稱為裂解結合液），本 領域技術人員可根據現有的提取方法進行選擇并根據所提取的核酸種類以及所選擇的試 劑確定合適的加入量，這對于本領域技術人員來說是可以實現的。
[0015] 在本領域中，所述裂解液一般為離液試劑、蛋白酶、堿、表面活性劑，可以采用其中 一種或兩種以上對樣品進行裂解。而其中的離液試劑主要是離液鹽或其組合。離液試劑指 的是通過其水溶液能夠破壞其他分子主要指生物大分子(例如核酸和蛋白質）的氫鍵從而 影響其穩定性的試劑。在高濃度的離液試劑中，蛋白質的二級結構通常被破壞但其一級結 構仍然保持。本發明給出了更加優選的裂解液方案，為離液試劑和蛋白酶。其中蛋白酶優選 蛋白酶K。而離液試劑優選為鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化鈉，尿素中的一種或兩種以上。進一 步優選地，所述裂解液為異硫氰酸胍和蛋白酶K，濃度為25ηιΜ/μ1異硫氰酸胍，1.5yg/yl蛋白 酶K，以此增強裂解細胞的效果，釋放更多核酸分子。
[0016] 本發明所述核酸的吸附材料指的是能在一定的液體環境中，與核酸相互作用，能 可逆的形成核酸-吸附材料復合物的材料。吸附核酸的材料在吸附的溶液環境中是固態的， 常常以顆粒，粉末，纖維或者薄膜的形式出現。常見的吸附核酸的材料包括但不限于硅珠， 磁珠，娃藻土等，其中廣泛使用的是磁珠，通過對磁性顆粒進行一定的包被(如娃基、氨基、 羧基等），形成磁珠，從而可以實現對核酸的高通量、自動化提取。這一技術產生于20世紀80 年代，已經有了成熟的試劑盒并形成為產業。磁性顆粒的內核通常由T-Fe203或者Fe304等 材料組成。
[0017] 在結合液存在的情況下，核酸將更有利于被吸附至吸附核酸的材料上，形成核酸-吸附材料復合物。本發明給出包含離液試劑的結合液選擇方案，更加優選的結合液方案為 離液試劑和異丙醇，離液試劑采用上述優選方案。更加優選的為異硫氰酸胍和異丙醇，濃度 為4000πιΜ/μ1異硫氰酸胍，10 %異丙醇。
[0018] 本發明所述核酸是指由許多核苷酸聚合而成的生物大分子，它是一種極為重要的 生命物質。核酸廣泛存在于動植物細胞，微生物體內。根據化學組成，核酸主要分為脫氧核 糖核酸(DNA)與核糖核酸(RNA)兩種，而本發明所述核酸分子也指DNA、RNA或兩者的混合。
[0019] 作為優選，所述洗滌采用乙醇洗滌，乙醇的濃度為30-100%，在本發明的具體實施 方式中采用80 %乙醇進行洗滌。
[0020] 作為優選，所述洗脫在50-70°C下洗脫5-20min，更優選為在65°C下洗脫lOmin。
[0021] 采用相同樣品分別按照本發明方法和現有方法提取DNA，并通過熒光定量PCR反應 檢測Ct平均值，結果顯示，在本發明方法下Ct平均值小于現有方法，這表明通過本發明方法 能提取出更多量的DNA。
[0022] 同時將相同DNA分別處于本發明洗脫液和重蒸水中在4°C下保存20天，然后進行毛 細管凝膠電泳，結果顯示，在本發明洗脫液中的多個DNA樣品全部能夠擴增，且可以有效分 型，而重蒸水中的多個DNA樣品不能全部擴增，且出峰不完全。
[0023] 基于上述技術效果，本發明同時提供了一種提取核酸的試劑盒，包括：
[0024] 離液試劑、結合液、核酸吸附材料和洗脫液，所述洗脫液為包含表面活性劑。
[0025] 其中，作為優選，所述表面活性劑為離子型表面活性劑或非離子型表面活性劑。進 一步優選地，所述離子型表面活性劑為陰離子表面活性劑;更進一步優選，所述陰離子表面 活性劑為SDS，所述非離子型表面活性劑為TritonX-100。
[0026] 作為優選，所述洗脫液中表面活性劑的質量百分比濃度為0.1-1%。
[0027] 作為優選，所述裂解液為離液試劑、蛋白酶、堿、表面活性劑中的一種或兩種以上。 進一步優選為離液試劑和蛋白酶。最優選地，所述裂解液為異硫氰酸胍和蛋白酶K
[0028] 作為優選，所述結合液為離液試劑和異丙醇。
[0029] 作為優選，所述離液試劑為鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化鈉，尿素中的一種或兩種以 上。
[0030] 作為優選，所述吸附核酸的材料為硅珠，磁珠，硅藻土或硅膠。
[0031] 在本發明所述試劑盒中，可以將上述各種試劑配制成各種濃度規格的溶液，只需 在使用時進行調配即可。
[0032] 由以上技術方案可知，本發明針對現有提取核酸的方法的缺陷，在洗脫環節中將 表面活性劑加入到洗脫液中，進而提高了洗脫核酸的得率，獲得更多量的核酸分子，同時提 取后的核酸長久保存而不被吸附在管壁或者被核酸酶降解，眼饞了核酸分子的保存時間。
【附圖說明】
[0033] 圖1所示為采用不同洗脫液提取的DNA的熒光定量PCR擴增圖；
[0034] 圖2所示為本發明洗脫液下保存的DNA的毛細管凝膠電泳圖；
[0035]圖3所示為重蒸水下保存的DNA的毛細管凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0036] 本發明實施例公開了一種提取核酸的方法及試劑盒。本領域技術人員可以借鑒本 文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領域技術 人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方法和試劑盒已經通過較 佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內對本文所述的 產品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[0037] 為了進一步理解本發明，下面結合實施例對本發明提供的一種提取核酸的方法及 試劑盒進行詳細說明。
[0038] 實施例1:本發明所述提取方法以及對比試驗
[0039]取5ul的新鮮的人血液，滴在濾紙片上，并在烘箱中用60度烘干，將烘干后的血斑 用剪刀剪下作為待提取DNA的樣品。用相同的方法一共制作15個樣品，并分為5組，每組3