一種檢測tert基因啟動子突變的試劑盒、其檢測方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于臨床醫學基因檢測技術，具體設及一種檢測TERT基因啟動子突變的試 劑盒、其檢測方法及應用。
【背景技術】
[0002] 膀脫尿路上皮癌是泌尿道的最常見的惡性腫瘤。癌發病率水平在全國32個腫瘤登 記處的合計為6.69/10萬，占全部惡性腫瘤新發病例的2.52%。按性別統計，膀脫癌男、女性 發病率分別為10.10/10萬和3.20/10萬，男性是女性的3.16倍。膀脫癌死亡率水平在全國32 個腫瘤登記中為2.53/10萬，占全部惡性腫瘤死亡總數的1.47%。此癌多數組織學表現為分 化良好的乳頭狀病變。尿細胞學在診斷高級別腫瘤中有較高的靈敏度和特異性，但是在檢 測高分化低級別腫瘤時表現較差，其靈敏度和特異性較低，尤其W伴有非腫瘤性病變，如感 染時為甚。目前常用的方法是尿液細胞學檢查。雖說尿細胞學在高級別腫瘤檢測中具有合 理的靈敏度和特異性，但是其檢測低級別腫瘤常有困難，其靈敏度和特異性均較低。目前應 用的尿基腫瘤標記物，包括食品和藥物管理局(FDA)批準的Immunocy，核基質蛋白22,和巧 光原位雜交(FISH)具有較高的靈敏度和特異性。但是各項檢查性能不一致，價格高昂，受標 本因素影響較大，妨礙了其廣泛的臨床使用。
[0003] 端粒反轉錄酶(TERT)激活性突變導致端粒酶的表達增加，是尿路上皮癌的最常見 的突變，出現于80%的膀脫癌中，而且與癌的分化水平無關。現在已經被認定為膀脫癌的驅 動突變，其突變的檢測為膀脫癌的診斷提供了較好的目標基因。
[0004] TERT啟動子突變發生于致癌過程早期，結合膀脫癌的外生性傾向，使細胞極易于 脫落于尿液中，為TERT突變經尿液脫落細胞診斷膀脫癌成為可能。TERT突變的檢測不但可 用于臨床診斷和篩查，而且極為適合復發監測。
[000引現有的無創篩查和監測膀脫癌尿基標記物，包括食品和藥物管理局(FDA)批準的 試驗Immunocy，核基質蛋白22(NMP22)，UroVysion原位巧光雜交具有70%的總靈敏度和高 達89%的特異性。但是各項檢查性能不一致，價格相對昂貴，妨礙了其廣泛的臨床使用。
[0006] 端粒酶逆轉錄酶的啟動子(TERT)基因激活性突變在導致端粒酶的表達增加，是膀 脫癌的致癌驅動因子。TERT啟動子突變被發現于80%的膀脫性尿路上皮癌，并且與腫瘤分 級分期無關，是一個理想的診斷和監測指標。
[0007] CN 104805206 A公開了檢測TERT基因突變的試劑盒及其檢測方法，試劑盒含有針 對TERT基因突變位點的LNA鎖核酸修飾的特異探針，該特異探針能夠與野生型DNA結合，能 檢出含0.01 % TERT基因突變DNA的樣本、最低檢出限為2-5拷貝。但是該試劑盒反應體系復 雜，影響因素多，每一因子均可對反應結果和解讀產生影響，難W解讀;貌似可W探知幾乎 所有突變，然C228TW外的突變在總突變中所占權重約為1 %，并且混合的多重PCR不能明確 病人為何種突變，尚需要測序來確定具體突變，如果用單純PCR，則需要做多次PCR反應，工 作量大。

【發明內容】

[0008] 本發明應用實時PCR融解技術，檢測TERT基因啟動子突變.本發明設計僅需一對探 針和一對引物，所發現為特異性C228T型突變，約占膀脫癌TERT突變的98%;且檢測方法試 劑簡單，價格低廉，而且反應體系中僅含有最基本的引物和探針，影響因素少;本發明方法 檢測精準，操作簡單，為臨床醫學上快速檢測膀脫癌奠定了基礎。
[0009] 第一方面，本發明提供了一種檢測TERT基因啟動子突變的試劑盒，所述試劑盒包 含針對TERT基因的巧光標記探針。
[0010] 本發明，當檢測TERT基因啟動子存在突變時，突變特異性探針與基因組DNA特異性 結合，而野生型DNA則因為有單點的不配對，而形成"泡"，從而顯示較低的烙點。
[0011] 優選地，所述巧光標記探針包括供體探針和受體探針。
[0012] 優選地，所述供體探針的核巧酸序列包含如SEQ ID NO. 1所示的片段，所述受體探 針的核巧酸序列包含如SEQ ID NO.2所示的片段；
[0013] 所述探針的核巧酸序列如下：
[0014] 供體探針：5'-CGT CCC GAC CCC TCC CGG GTC-Flc-3'（沈Q ID N0.1);
[0015] 受體探針：5'-Lc640-GCC CAG CCC CTT CCG GGC CCT-Phos-3'（SEQ ID N0.2)。
[0016] 優選地，所述試劑盒還包括檢測TERT的特異性引物。
[0017] 優選地，所述特異性引物的核巧酸序列包含如SEQ ID NO.3-4所示的片段；
[0018] 所述特異性引物的核巧酸序列如下：
[0019] 上游引物：5'-ccc ttc acc ttc cag ctc-3'（沈Q ID N0.3);
[0020] 下游引物：5'-agc get gcc tga aac tgg-3'（沈Q ID N0.4)。
[0021 ] 優選地，所述試劑盒所述試劑盒還包括PCR緩沖液、dNTPs、One化q DNA聚合酶。
[0022] 本發明中，所有試劑包括特異性引物，巧光探針，及PCR緩沖液，dNTPs(除酶之外） 均已混合，作為"主液"，不需要單獨配制，極大地方便用戶操作。
[0023] 所述PCR緩沖液的濃度為1 X緩沖液。
[0024] 優選地，所述dNTPs的濃度為dNTPs的濃度為0.05-1μΜ，例如可W是0.05μΜ、0.0化 1、0.0如]?、0.化]\1、0.24]\1、0.34]\1、0.44]\1、0.54]\1、0.64]\1、0.74]\1、0.祉]\1、0.94]\1或化]\1，優選為 0.1-0.祉Μ，進一步優選為0.2μΜ。
[0025] 優選地，所述OneTaq DNA聚合酶的濃度為0.5-8U/mg，例如可W是0.抓/mg、0.抓/ mg、0.7U/mg、0.洲/mg、lU/mg、1.2U/mg、1.抓/mg、2U/mg、2.抓/mg、3U/mg、3.抓/mg、4U/mg、 4.抓/mg、抓/mg、5.抓/mg、抓/mg、6.抓/mg、7U/mg、7.抓/mg 或 8U/mg，優選為 1 -抓/mg，進一步 優選為1.抓/mg。
[0026] 第二方面，本發明提供一種利用如第一方面所述的檢測TERT基因啟動子突變的試 劑盒在非疾病診斷中檢測TERT基因啟動子突變的方法，包括W下步驟：
[0027] (1)從待測樣品中提取模板〇魁5-2〇11邑，利用569 10^).3-4的特異性引物對模板 DNA進行實時PCR擴增；
[0028] (2)將步驟(1)擴增后的片段加入SEQ ID NO. 1-2的巧光探針進行加溫烙解；
[0029] (3)通過得到的PCR產物的烙解曲線來判斷TERT基因的突變情況。
[0030] 優選地，步驟(1)所述的模板來自于尿液細胞沉淀物和/或膀脫組織。
[0031 ]優選地，步驟(1)所述的擴增條件為：
[0032] (a)95°C 預變性 4min，1 循環；
[0033] (b)94°C 變性 20s、62°C 退火 20s、68°C 延伸 40s，45 個循環；
[0034] (c)37°C 延伸 30s，l 循環。
[003引優選地，步驟（2)所述的加溫烙解的條件為：95°Clmin，62°C30s，45°C30s，40°C 2min，再WO.rC/秒的速度升高至70°C。
[0036 ]優選地，步驟(3)所述