新的綜合性耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001 ]本發明設及生物學研究和Waardenburg綜合征的分子檢測領域，具體設及一種新 的綜合性耳聾相關基因突變檢測體系及試劑盒。
【背景技術】
[0002] Waardenburg綜合征(Waardenburg Syn化ome，WS)，是最常見的染色體顯性和隱性 遺傳性綜合征型耳聾，又稱聽力-色素綜合征，主要的臨床特征為感音神經性耳聾W及虹 膜、頭發和皮膚的色素分布異常，根據不同的伴隨表型又分為4型。WS的人群發病率為1/ 212000,但由于該綜合征的不完全外顯率達20%，故推測實際人群發病率為1/42000,占先 天性耳聾的2~5%，聾啞人群中發病率為0.9~2.8%。據目前研究表明，WS具有高度的遺傳 異質性，已證實與WS有關的基因有6個，分別為:Μ 口F、PAX3、SOX 10、SNA 12、ENDRB、EDN3，已報 道WS基因突變位點有近278個。關于WS的拷貝數變異(Copy number variation,CNV)國外已 有報道，Mil un sky、Wildhardt G利用多重連接依賴探針擴增（Multiplex li gat ion- dependent probe amplif ication，MLPA) 分別發現了WS 相關基因上 PAX3 和 MITF 的多個 CNV， 提高了 WS的突變檢出率，并一致認為，相關基因的CNV檢測應作為一種常規檢測方法應用到 WS的分子診斷檢測中。
[0003] 目前針對目標基因 CNV的檢測方法有W下幾種：FISH、多重可擴增探針雜交 (Multiplex amplifiable probe hyb;ridization，MAPH).、多重連接依賴探針擴增 (Multiplex ligation-dependent probe amplification,MLPA)、實時巧光定量PCR(Rea]_- time quantitative PCR)、短巧光片段多重定量PCR(Quantitative multiplex PCR of short fluorescent fra卵ents，QMPSF)、C細 Array。除FI細和CGH外，W上運些方法都W PCR為基礎，適用于對特定目標基因進行定量分析。在篩查和診斷遺傳性疾病上，運些方法 存在各自的優缺點。
[0004] 基于多重可擴增探針雜交的MAPH方法是Armour等人于2000年報導的一種用于基 因拷貝數變異的定量分析方法。該方法把特定的PCR產物與固定在尼龍膜上基因組DNA進行 雜交，通過PCR及電泳技術檢測雜交回收探針的量，來實現基因組中相應目的DNA片段拷貝 數的檢巧U。相比較下面要介紹的MLPA技術，MAPH與MLPA均可W同時檢測40多個目的序列，結 果的準確度、精度高。但是，該方法的步驟繁瑣，需要先固定樣本DNA及洗脫未反應的探針， 難W滿足臨床診斷的需要。
[0005] MLPA是Schouten等人于2002年首先報導的，該方法可W檢測出DNA序列的缺失和 重復。該方法特異、高效，一次反應可W同時檢測40多個目的序列拷貝數的改變，但存在W 下幾方面不足:1、檢測平臺開放式，容易造成污染;2、其設計的長探針不能通過化學方法合 成，需要通過M13載體克隆的方法獲得;3、雜交步驟耗時過長（16小時）。運些都是MLPA不可 避免的局限性。
[0006] 短巧光片段多重定量PCR最早應用于染色體非整倍體的產前基因診斷。運項技術 的方法原理是，首先選取目的基因外顯子上的一段短片段序列，用標記了巧光的引物同時 對多個短片段進行擴增，然后將擴增的產物進行毛細管電泳分析，根據圖譜中產物峰的長 度和面積計算待測位點的拷貝數。目前已成為臨床應用得較為成熟的一項技術。該方法的 優點是準確性高，無需細胞培養，診斷可在一天內完成。它的不足之處在于多個短片段存在 于一個體系中進行多重PCR，增加了設計的難度。
[0007] 實時巧光定量PCR，是目前臨床診斷系統廣泛應用的檢測平臺之一。因為它具備了 傳統PCR的優點，同時又克服了傳統PCR的許多缺點。首先，操作簡便，快速高效，具有很高的 敏感性和特異性;其次，是在封閉的體系中完成擴增并進行實時測定，有效的避免污染，而 且直接檢測結果，無需擴增后操作;另外，多巧光通道允許在同一反應體系中同時對多個目 的序列進行擴增。該方法廣泛應用于針對特定位點進行拷貝數定量，對已知的CNV進行確 認。但是多重PCR本身存在一些問題。不同引物對之間的錯配擴增，不同勒序列擴增效率不 一致導致效率低的祀點被擴增效率較高的祀點所抑制，運些都會影響拷貝數定量分析。

【發明內容】

[0008] 本發明的目的在于克服現有技術存在的W上問題，提供一種新的綜合性耳聾相關 基因突變檢測體系及試劑盒，篩選出59個Waardenburg綜合征相關基因檢測位點，并且結合 多重PCR和毛細管電泳等技術設計專用檢測探針，組合成一個高效準確快速的檢測體系，實 現在該體系內對6個WaardenbiKTg綜合征相關基因的拷貝數變異的同時快速檢測。
[0009] 為實現上述技術目的，達到上述技術效果，本發明通過W下技術方案實現：
[0010] -種新的綜合性耳聾相關基因突變檢測體系，針對目前已知的6個與Waardenbu;rg 綜合征相關的基因，選取的59個檢測位點組成耳聾基因突變檢測體系，采用連接酶連接反 應的高特異性對目的區域進行雜交、連接，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特 異序列W及通過連接酶加接反應獲得位點對應的不同長度連接產物，利用標記巧光的通用 引物對連接產物進行PCR擴增，通過巧光毛細管電泳對擴增產物進行電泳分離，最后通過對 電泳圖譜的分析獲取各個位點的峰高，其中：
[001。 1)共設計了 91對多重PCR引物，91對引物中包括59對檢測探針和32對參照探針;針 對每個位點設計2條探針：1條5 '端探針和1條3 '端探針，其5 '端探針序列由巧光集團，正向 通用引物序列和位點5'側特異性序列組成，3'端探針序列由位點3'側特異性序列、位點鑒 別連接序列、3'端通用引物序列組成;所述的5'端探針序列如SEQ ID NO.: 1至SEQ ID NO.: 91所示，所述的3'端探針序列如沈Q ID NO. :92至沈Q ID NO. :182所示；
[0012] 2)將高溫處理后的短片段基因組DNA與探針混合物變性復性，各探針與對應模板 進行配對；
[0013] 3)加入連接酶反應體系，配對在同一模板上的緊鄰探針在連接酶作用下進行特異 性連接，產生連接產物；
[0014] 4)利用帶巧光標記的通用引物對連接產物進行PCR擴增，不同長度的擴增產物利 用巧光毛細管電泳獲得分離；
[0015] 5)通過對巧光毛細管電泳數據文件中不同長度的連接產物峰譜的分析確定不同 位點的峰高；
[0016] 6)多重位點分型的實現:通過改變位點鑒別序連接序列的長度來獲取不同連接長 度的連接產物，實現多個位點的檢測;通過改變探針中通用引物序列，隨后采用不同巧光標 記的通用PCR引物進行擴增從而進一步增加檢測位點的數目，所述通用PCR引物序列如SEQ ID NO. :183至沈Q ID NO. :188所示。
[0017] 進一步的，所述的多重PCR引物Tm在64-66°C，PCR產物長度在170bp之內。
[0018] -種新的綜合性耳聾相關基因突變檢測試劑盒，包括：
[0019] 4址NA裂解緩沖液，
[0020] lOx連接酶緩沖液，
[0021 ] 連接酶，
[0022] 探針混合液，
[0023] d地 2〇，
[0024] 2xPCR反應混合液，
[002引 PCR引物混合液。
[0026] 進一步的，所述探針混合液序列如沈Q ID NO. :1至沈Q ID NO. : 182所示。
[0027] 進一步的，所述PCR引物混合液序列如沈Q ID NO. : 183至沈Q ID NO. : 188所示。
[0028] 本發明的有益效果是：
[0029] 本發明的優越性在于通過對現有多重核酸分子擴增技術加 W改進，設計特定的檢 測探針，設置特定的檢測體系組分和反應條件，W同時對6個已知與Waardenburg綜合征有 關的基因上的共59個位點進行快速拷貝數變異檢測，市面尚無專口針對Waardenburg綜合 征相關拷貝數變異進行檢測的技術和產品，檢測可在一個工作日內完成，最低僅需200納克 的DNA即可得到準確的檢測結果。
[0030] 1.該檢測試劑盒選取的6個基因是利用最新報道的Waardenburg綜合征相關基因 突變信息和湘雅醫院耳鼻咽喉科在臨床檢測中積累的第一手資料進行篩選得到，覆蓋了已 知明確與Waardenbu;rg綜合征致病相關的所有基因，相比目前市面已有的Waardenburg綜合 征檢測產品，本試劑盒覆蓋了更多的致病基因，提高了檢出率。
[0031 ] 2.市面尚無專口對Waardenburg綜合征進行拷貝數變異檢測的試劑盒。本試劑盒 同時對6個Waardenburg綜合征相關基因的56個檢測位點進行檢測，覆蓋所有基因的各個外 顯子和上游調控序列，目前還沒有Waardenburg綜合征的檢測試劑盒可實現運樣的檢測分 辨率。
[0032] 3.通過對檢測探針序列、反應條件、反應體系和檢測流程進行設計和優化，使該試 劑盒能更準確、更高效的對59個檢測位點同時進行拷貝數變異檢測，只需200納克的DNA樣 本即可進行檢測，可在一個反應體系內進行，24小時內完成，提高了檢測人員的工作效率。
[0033] 上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予W實施，W下W本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。 本發明的【具體實施方式】由W下實施例及其附圖詳細給出。
【附圖說明】
[0034] 此處所說明的附圖用來提供對本發明的進一步理解，構成本申請的一部分，本發 明的示意性實施例及其說明用于解釋本發明，并不構成對本發明的不當限定。在附圖中： [003引圖1為本發明反應流程示意圖；
[0036] 圖2為MITF_promoter2_0探針巧光信號示意圖；
[0037] 圖3為MITF_promoterl_0探針巧光信號示意圖 [003引圖4為MITF_E01_0探針巧光信號示意圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面將參考附圖并結合實施例，來詳細說明本發明。
[0040] 本技術是針對目前已知的6個與Waardenburg綜合征相關的基因，選取的59個檢測 位點組成耳聾基因突變檢測體系。該技術基本原理是基于專利申請人前期已申請的《多重 核酸分析》創新技術（中國專利申請號201280001947.3)，采用連接酶連接反應的高特異性 對目的區域進行雜交、連接，然后通過在連接探針末段引入不同長度的非特異序列W及通 過連接酶加接反應獲得位點對應的不同長度連接產物，利用標記巧光的通用引物對連接產 物進行PCR擴增，通過巧光毛細管電泳對擴增產物進行電泳分離，最后通過對電泳圖譜的分 析獲取各個位點的峰高。具體流程見附圖1:
[0041] 1)針對每個位點設計2條探針：1條5'端探針和1條3'端探針，其5'端探針序列由巧 光集團，正向通用引物序列和位點5'側特異性序列組成，3'端探針序列由位點3'側