一種近視風險評估的基因檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種近視風險評估的基因檢測試劑盒及其檢測方法，包括盒體及盒體內單獨存放試劑，單獨存放試劑包括：(1)針對2個基因SNP多態位點的PCR反應引物組；(2)PCR擴增試劑；(3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴增反應在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、特異性，分析得到受測者發展成為高度近視的風險，為其發現近視的遺傳與基因內在因素，能夠更好的為受測者提供科學的參考，幫助其改善、調理生活工作習慣，以預防或降低近視的風險，同時在日常生活中采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。
【專利說明】
-種近視風險評估的基因檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域
[0001] 本發明設及基因檢測領域，具體是一種近視風險評估的基因檢測試劑盒及其檢測 方法。
【背景技術】
[0002] 近視，是指眼在調節松弛狀態下，平行光線經眼的屈光系統的折射后，光線在視網 膜前聚焦而非在視網膜上聚焦，運通常是因為晶狀體的增厚和老化所導致，近視受先天遺 傳因素和后天環境因素的共同影響。調查表明，近視的產生受遺傳的影響比較大。如果父母 兩人都是近視，子女同樣近視的幾率高達33-60%;如果父母一方是近視，子女近視的幾率 降低到23-40%;如果父母兩人都不近視，則子女近視的幾率只有6-15%。與近視眼有關聯 的基因在眼睛發育W及視覺信號向大腦的傳遞過程中發揮著關鍵作用。該類基因一旦出現 缺陷，眼球就可能過度發育生長，導致觀看遠處物體時發生視覺模糊，近視形成。
[0003] 很顯然，近視的發生深受遺傳因素的影響。2001年英國研究者對226對同卵李生成 年人和280對異卵李生成年人的研究表明，近視的遺傳率高達0.89,也就是說，近視主要受 基因控制，與后天因素的關系不大。差不多同時丹麥研究者對53對同卵和61對異卵李生成 年人的研究也得出了相同的結論。
[0004] 不過，基因的表達離不開環境因素的作用，某些環境因素（例如閱讀）可能是近視 的誘因。另外某些人在某些環境因素的刺激下，天生就比較容易得近視。總之，對近視的基 因檢測將會幫助我們更好的了解遺傳因素的影響，避免不利的環境因素誘發，更好的保護 視力。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的在于提供一種近視風險評估的基因檢測試劑盒及其檢測方法，該試 劑盒對受測者的相關基因進行檢測，分析得到受測者發展成為高度近視的風險，為其發現 近視的遺傳與基因內在因素，能夠更好的為受測者提供科學的參考，幫助其改善、調理生活 工作習慣，W預防或降低近視的風險，同時在日常生活中采取相應的策略避免對其無效甚 至是有害的方法。且PCR擴增反應在同一臺PCR儀上同步進行并具備檢測的高效性、特異性， W解決上述【背景技術】中提出的問題。
[0006] 為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
[0007] 本實施例對測試者采用近視風險評估基因檢測試劑盒同時檢測2個基因的SNP多 態位點，并根據基因分型結果，分析得到受測者發展成為高度近視的風險，為其發現近視的 遺傳與基因內在因素，能夠更好的為受測者提供科學的參考，幫助其改善、調理生活工作習 慣，W預防或降低近視的風險，同時在日常生活中采取相應的策略避免對其無效甚至是有 害的方法。
[000引一種近視風險評估的基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放試劑，所述單 獨存放試劑包括：
[0009] (I)針對2個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組，引物序列方向均為5 '端至3 '端：
[0010] ①針對SNP rsl89798的引物組：
[0011] 1 GTAGTGCTG GTGG
[0012] 2 CAGAGAGAGCACTTCAG
[0013] 3 GACAGA GACATTGAGGC
[0014] 4 GGAATACTGCAAGATCCGT
[0015] ②針對SNP rs100 34228的引物組：
[0016] 1 GGTGCTCTCT CAAGCCTTTG
[0017] 2 CTTTTGTGCCTCCACTATTC
[0018] 3 GAAGAAGTCA GAGATGTGTAT
[0019] 4 GACTGCCACACTAACAAAT；
[0020] (2)PCR擴增試劑：IOXPCR緩沖液，該PCR緩沖液由90~IlOmM Tris-HCl P冊.3、 480~520mM KCU13~17mM MgC12組成;dNTPs混合物，該dNTPs混合物由S憐酸鳥嚷嶺脫氧 核巧酸dGTP、=憐酸腺嚷嶺脫氧核巧酸dATP、=憐酸胸腺喀晚脫氧核巧酸dTTP、=憐酸胞喀 晚脫氧核巧酸dCTP四種核巧酸組成，各組分濃度為2.2~2. SmM; 4~抓AU熱啟動化q酶;基 因組模板；
[0021] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑:瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、Goldvi ew染色 液和DNA上樣緩沖液，該緩沖液W漠酪藍為指示劑稀釋至1倍后使用。
[0022] 作為本發明進一步的方案：所述DNA無毒染色液為Biotium Gelred無毒染料或 Goldview染色液。
[0023] -種所述的近視風險評估的基因檢測試劑盒的檢測方法，步驟如下：
[0024] (1)提取樣本基因組DNA
[0025] 采集測試者唾液，向1~2ml唾液樣品中加入480~52化L提取緩沖溶液，該提取緩 沖溶液溶劑為48~52mM的化is-肥1 pH7.4、0.4~0.6mM的抓TA和48~52mM的化Cl，反復吹 打混勻后，8000 Xg離屯、4~6min，棄去上清，此步驟重復一次;得到的沉淀中加入480~52化 L裂解液，該裂解液溶劑為48~52mM化is-HCl抑7.4,48~52mM化is-HClpH7.4，145~ 155mMNaCl，0.9~l.lmMEDTA，0.9~l.l%Tritonx-100,0.9~l.l%Sodium deo巧cholate，0.09~0.11 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，徹底懸浮沉淀并充分混勻后，室溫放置 28~32min，期間來回顛倒離屯、管數次;得到的混合液中，加入濃度為9~1 Img/mL RNA酶的 水溶液9~11化，36~38°C下靜置IOmin;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯仿混合溶液， 苯酪和氯仿體積比為0.9~1.1:1，充分混勻，混合液3~5°C，12000 Xg離屯、4~6min，上清液 移入干凈離屯、管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積比為 24~26:23~25:1，充分混勻后，3~5°C，12000 Xg離屯、4~6min，上清液移入干凈離屯、管內； 加入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，3~5°C，12000 Xg離屯、4~6min，上清液移 入干凈離屯、管內；加入0.5~0.7倍體積的冰浴異丙醇溶液及0.09~0.11倍的2.8~3.2mol/ L醋酸鋼溶液，-19~-2rC靜置57~63min，3~5°C，12000 X g離屯、9~1 Imin，棄上清液;得到 的沉淀物中加入0.4~0.6mL 70 %乙醇清洗沉淀物，3~5°C，12000 X g離屯、4~6min，棄上清 液，此步驟重復一次;得到的沉淀物自然風干，加入18~22化無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保存；
[00%] (2)PCR 擴增
[0027] 每個SNP的檢測需要一對上下游引物、兩條多態引物共4條PCR引物，共需要8條引 物，每個SNP的檢測需要做兩管PCR擴增，為防止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功， 加設一管陰性對照組，共做5管PCR，陰性對照組基因組模板沒有引物存在；
[0028] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系：2.3~2.7 化10 X PCR緩沖液，1.8~2.化L dNTPs，0.4~0.6化引物組，熱啟動Taq酶0.12~0.1祉L，基 因組模板78~82mg，添加超純水至總體積為24~
[0029] 將裝有反應溶液的Eppendorf試管放入PCR儀中，設置反應條件如下:預變性94~ 96^2.5~3.5111111;熱循環93~95^28~323,59~61^28~323,71~73^28~323,35個循 環;延伸71~73°C2.5~3.5min，反應結束后，取出試管；
[0030] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0031] 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下：2.7~3.3g瓊脂糖，加入95~ 105mL去離子水，微波爐加熱55~65s，冷卻到58~62°C，加入4.8~5.化L DNA無毒染色液， 審Ij成2.9~3.1 %的瓊脂糖凝膠，用9~11化的PCR產物與0.7~0.9化的6 X T肥緩沖液混合上 樣，在98~102V電壓下電泳14~16min，紫外燈下讀取結果并拍照。
[0032] 與現有技術相比，本發明的有益效果是:本發明通過PCR引物的設計使多個PCR擴 增反應在同一臺PCR儀上同步進行，對受測者的相關基因進行檢測，并實現檢測的高效性、 特異性，分析得到受測者發展成為高度近視的風險，為其發現近視的遺傳與基因內在因素， 能夠更好的為受測者提供科學的參考，幫助其改善、調理生活工作習慣，W預防或降低近視 的風險，同時在日常生活中采取相應的策略避免對其無效甚至是有害的方法。
【附圖說明】
[0033] 圖1為反應產物瓊脂糖凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0034] 下面將結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完 整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基于 本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他 實施例，都屬于本發明保護的范圍。
[00對實施例
[0036] (1)針對2個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組（W下引物序列方向均為5 '端至3 ' 端)：
[0037] 針對SNP rsl89798的引物組：
[0038] 1 GTAGTGCTG GTGG
[oow] 2 CAGAGAGAGCACTTCAG
[0040] 3 GACAGA GACATTGAGGC
[0041 ] 4 GGAATACTGCAAGATCCGT
[0042] 針對SNP rs100 34228的引物組：
[0043] 1 GGTGCTCTCT CAAGCCTTTG
[0044] 2 CTTTTGTGCCTCCACTATTC
[0045] 3 GAAGAAGTCA GAGATGTGTAT
[0046] 4 GACTGCCACACTAACAAAT
[0047] (2)PCR擴增試劑aOXPCR緩沖液，該PCR緩沖液為IOOmM IYis-HCl P冊.3,500mM KCl，15mM MgCl 2; dNTPs混合物，該dNTPs混合物為S憐酸鳥嚷嶺脫氧核巧酸dGTP，S憐酸腺 嚷嶺脫氧核巧酸dATP，S憐酸胸腺喀晚脫氧核巧酸dTTP，S憐酸胞喀晚脫氧核巧酸dCTP四 種核巧酸，各組分濃度為2.5mM;抓AU熱啟動化q酶；
[004引（3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑:瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、Goldvi ew染色 液和DNA上樣緩沖液，該緩沖液W漠酪藍為指示劑稀釋至1倍后使用。
[0049]使用上述運動后體質恢復狀況基因檢測試劑盒按如下步驟進行檢測：
[(K)加](1)提取樣本基因組DNA
[0051 ]采集該測試者唾液，向l-2ml唾液樣品中加入50化L提取緩沖溶液，該DNA提取緩沖 溶液溶劑為50mM的化is-肥1 pH7.4、0.5mM的邸TA和50mM的化Cl，反復吹打混勻后，8000 X g 離屯、5min，棄去上清，此步驟重復一次;得到的沉淀中加入5(K)化裂解液，該裂解液溶劑為 50mM Tris-肥 1 pH7.4,50mM Tris-肥 1 pH7.4，150mM NaCiamM EDTA，l%Triton X-100， I % Sodium deoxycholate，0.1 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，徹底懸浮沉淀并充分混勻后，室溫 放置30min，期間來回顛 倒離屯、管數次;得到的混合液中，加入濃度為lOmg/mLRNA酶的水溶 液10化，37°C下靜置IOmin;得到的上清液中，加入等體積苯酪-氯仿混合溶液，苯酪和氯仿 體積比為1:1，充分混勻，混合液4°C，12000 X g離屯、5min，上清液移入干凈離屯、管內；加入等 體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酪、氯仿和異戊醇體積比為25: 24:1，充分混勻后，4°C， 12000 X g離屯、5min，上清液移入干凈離屯、管內；加入等體積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混 勻后，4°C，12000 X g離屯、5min，上清液移入干凈離屯、管內；加入0.6倍體積的冰浴異丙醇溶 液及0.1倍的3mol/L醋酸鋼溶液，-20°C靜置60min后，4°C，12000Xg離屯、lOmin，棄上清液； 得到的沉淀物中加入0.5mL 70 %乙醇清洗沉淀物，4°C，12000 X g離屯、5min，棄上清液，此步 驟重復一次;得到的沉淀物自然風干，加入20化無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保存。 [0化 2] (2)PCR 擴增
[0化3] 本實施例同時檢測rsl89798、rs100 34228,每個SNP的檢測需要一對上下游引物、 兩條多態引物共4條PCR引物，共需要8條引物。每個SNP的檢測需要做兩管PCR擴增，為防止 出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設一管陰性對照組，共做5管PCR，所述陰性對 照組基因組模板及反應體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0054] 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系:2.5化10 X PCR緩沖液，dNTPs，0.5化引物組，熱啟動化q酶0.15化，基因組模板SOmg，添加超純水 至總體積為2如L。
[0055] 將裝有反應溶液的化pendorf試管放入ABI 9700PCR儀中，設置反應條件如下:預 變性 95°C3min;熱循環 941：3〇3,6〇1：3〇3,721：3〇3,35個循環;延伸721：3111111。反應結束后， 取出試管。
[0056] 由于5管PCR擴增反應是在同一臺PCR儀上同步進行的，為了實現檢測的高效性、特 異性，要求8條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進行大量的DNA序列軟件分析來設計PCR引 物，并通過大量的實驗來進行Tm值的優化并確定設計的合理性，本試劑盒各基因 SNP多態性 的檢測是既相對獨立又相互聯系的，不可分割。
[0057] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測
[0058] 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下:：3g瓊脂糖，加入IOOmL去離子水， 微波爐加熱Imin，冷卻到60°C時加入扣L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR產物 10化與6 X T邸緩沖液0.祉L混合上樣，電壓IOOV電泳15min。紫外燈下讀取結果并拍照，所得 瓊脂糖電泳檢測圖如圖1所示。
[0059] 檢測得到2個基因分型分析結果如下：
[0061] 根據W上分析結果，該測試者不容易患高度近視。如在平常生活和學習中，注意用 眼保護，則更能保證眼睛的健康，遠離近視的苦惱。
[0062] 對于本領域技術人員而言，顯然本發明不限于上述示范性實施例的細節，而且在 不背離本發明的精神或基本特征的情況下，能夠W其他的具體形式實現本發明。因此，無論 從哪一點來看，均應將實施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本發明的范圍由所附權 利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和范圍內的所有 變化囊括在本發明內。不應將權利要求中的任何附圖標記視為限制所設及的權利要求。
【主權項】
1. 一種近視風險評估的基因檢測試劑盒，包括盒體及盒體內單獨存放試劑，其特征在 于，所述單獨存放試劑包括： (1) 針對2個基因 SNP多態位點的PCR反應引物組，引物序列方向均為5 '端至3 '端： ① 針對SNP rsl89798的引物組： 1 GTAGTGCTG GTGG 2 CAGAGAGAGCACTTCAG 3 GACAGA GACATTGAGGC 4 GGAATACTGCAAGATCCGT ② 針對SNP rs100 34228的引物組： 1 GGTGCTCTCT CAAGCCTTTG 2 CTTTTGTGCCTCCACTATTC 3 GAAGAAGTCA GAGATGTGTAT 4 GACTGCCACACTAACAAAT； (2) PCR擴增試劑：10XPCR緩沖液，該PCR緩沖液由90~llOmM Tris-HCl pH8.3、480~ 520mM KC1、13~17mM MgCl2組成；dNTPs混合物，該dNTPs混合物由三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷 酸dGTP、三磷酸腺嘌呤脫氧核苷酸dATP、三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP、三磷酸胞嘧啶脫 氧核苷酸dCTP四種核苷酸組成，各組分濃度為2.2~2.8mM; 4~6UAU熱啟動Taq酶;基因組 模板； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑:瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標準、Go 1 dvi ew染色液和 DNA上樣緩沖液，該緩沖液以溴酚藍為指示劑稀釋至1倍后使用。2. 根據權利要求1所述的近視風險評估的基因檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA無毒 染色液為Biotium Gelred無毒染料或Goldview染色液。3. -種如權利要求1所述的近視風險評估的基因檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于， 步驟如下： (1)提取樣本基因組DNA 采集測試者唾液，向1~2ml唾液樣品中加入480~520yL提取緩沖溶液，該提取緩沖溶 液溶劑為48~52mM的Tris-HCl pH7 ·4、0 ·4~0 · 6mM的EDTA和48~52mM的NaCl，反復吹打混 勻后，8000 Xg離心4~6min，棄去上清，此步驟重復一次;得到的沉淀中加入480~520yL裂 解液，該裂解液溶劑為48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4,48~52mM Tris-HCl ρΗ7·4，145~155mM NaCl，0.9~l.lmM EDTA，0.9~l.l%Triton χ_100,0·9~l.l%Sodium deoxycholate， 0.09~0.11 % SDS，蛋白酶K20mg/mL，徹底懸浮沉淀并充分混勻后，室溫放置28~32min，期 間來回顛倒離心管數次;得到的混合液中，加入濃度為9~1 lmg/mL RNA酶的水溶液9~11μ L，36~38°C下靜置10min;得到的上清液中，加入等體積苯酚-氯仿混合溶液，苯酚和氯仿體 積比為0.9~1.1:1，充分混勻，混合液3~5°C，12000 Xg離心4~6min，上清液移入干凈離心 管內；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和異戊醇體積比為24~26: 23~ 25:1，充分混勻后，3~5°C，12000 Xg離心4~6min，上清液移入干凈離心管內；加入等體積 氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，3~5°C，12000 X g離心4~6min，上清液移入干凈離心 管內；加入0.5~0.7倍體積的冰浴異丙醇溶液及0.09~0.11倍的2.8~3.2mol/L醋酸鈉溶 液，-19~-21°C靜置57~63min，3~5°C，12000Xg離心9~llmin，棄上清液;得到的沉淀物 中加入0.4~0.6mL 70 %乙醇清洗沉淀物，3~5°C，12000 X g離心4~6min，棄上清液，此步 驟重復一次;得到的沉淀物自然風干，加入18~22yL無菌超純水回溶，電泳檢測，-20°C保 存； (2) PCR擴增 每個SNP的檢測需要一對上下游引物、兩條多態引物共4條PCR引物，共需要8條引物，每 個SNP的檢測需要做兩管PCR擴增，為防止出現假陽性之類的反應，衡量PCR是否成功，加設 一管陰性對照組，共做5管PCR，陰性對照組基因組模板沒有引物存在； 根據不同的檢測位點，用相應的引物按如下比例分別配制PCR反應體系：2.3~2.7yL 10 X PCR緩沖液，1 · 8~2 · 2yL dNTPs，0 · 4~0 · 6yL引物組，熱啟動Taq酶0 · 12~0 · 18yL，基因 組模板78~82mg，添加超純水至總體積為24~26yL; 將裝有反應溶液的Eppendorf試管放入PCR儀中，設置反應條件如下：預變性94~96°C 2.5~3.5111丨11;熱循環93~951€28~328,59~611€28~328,71~73 1€28~328,35個循環；延 伸71~73°C2.5~3.5min，反應結束后，取出試管； (3) 瓊脂糖凝膠電泳檢測 將擴增后的產物進行瓊脂糖電泳檢測，過程如下：2.7~3.3g瓊脂糖，加入95~105mL去 離子水，微波爐加熱55~65s，冷卻到58~62°C，加入4.8~5.2yLDNA無毒染色液，制成2.9~ 3.1 %的瓊脂糖凝膠，用9~1 lyL的PCR產物與0.7~0.9yL的6 X TBE緩沖液混合上樣，在98~ 102V電壓下電泳14~16min，紫外燈下讀取結果并拍照。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861714SQ201610345524
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月22日
【發明人】李則軒
【申請人】深圳中美基因研究院有限公司