一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒及其檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測技術，可以快速檢測21種粉蚧，至少包括20次用量以上的引物PseJ /PseN試劑和基因條形碼序列盤；引物PseJ序列：5'? CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG ?3'，引物PseN序列：5'? TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA?3'；所述基因條形碼序列盤存有93條標準條碼序列，詳細序列為SEQ ID NO.1到SEQ ID NO.93所示。本發明的粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測技術，是一種高效、準確、便捷的粉蚧科昆蟲分子檢測技術，可在分子水平將粉蚧科21種昆蟲種類區分，能滿足使用需求。
【專利說明】
-種粉蟻科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒及其檢測方法
技術領域
[0001] 本發明設及一種PCR檢測試劑盒及其檢測方法，尤其設及一種粉階科昆蟲基因條 形碼檢測試劑盒及其檢測方法，屬于植物檢疫技術領域。
【背景技術】
[0002] 粉階是一類分布廣、寄主多的植食性昆蟲，除少部分為資源昆蟲外，多為農林業中 發生普遍且危害嚴重的害蟲(Ben-Dov，2002)。該類群的成蟲和若蟲主要在寄主植物的幼嫩 部位取食危害，導致生長勢衰弱；亦可傳播病原微生物導致植物病害大面積的發生；另外蟲 體排出的蜜露常誘致煤煙病的產生，影響光合作用，對農林業生產、城市景觀等的生態影響 巨大。
[0003] 長期W來，基于形態特征的粉階科分類研究的操作性和準確性一直受到質疑。粉 階體形較小或微小，有些種類鮮見雄蟲，可供比較的形態學特征有限;粉階的個體大小、巧U 毛長短、透明孔的有無等重要的形態分類特征不穩定，極易受外部環境的影響而發生變化 (齊曉豐，2002);同時傳統階蟲形態分類對專業知識和經驗要求較高，只有分類專家或者經 過專口培訓的人員才能有效開展此項工作;此外，傳統的昆蟲形態鑒定方法必須W完整成 蟲作為形態學研究對象，若蟲、卵與殘缺的蟲體等情況均難于通過形態特征進行快速有效 地鑒定化ondo，2008;化SUgi，2011)。
[0004] 近年來，昆蟲分子生物學迅速發展起來，在分子鑒定和系統演化兩個方面的應用 較為廣泛，通過研究昆蟲核酸分子結構探求各類群之間的親緣關系和進化關系(Frgzal， 2008,鄭斯竹，2015)。利用分子生物學技術，可W有效地掲示自然種群中遺傳結構、基因流 動和選擇作用等問題，為粉階的分類鑒定提供新的技術和方法(魏亦寒，2105)。尤其是DNA 條形碼技術的出現，越來越多的研發人員加入了DNA條形碼技術研究行列，使該領域成為生 物學研究的熱點之一 (Hebert, 2006)。何衍彪等(2007)對大洋臀紋粉階、相橘臀紋粉階、無 花果臀紋粉階/icus等3種近緣種粉階的mtDNA COI序列W及18S和 28S基因序列進行研究發現階蟲COI基因序列變異程度高于其他基因；Park等(2011)通過 重新設計COI基因序列的正向引物，對盾階科和粉階科進行了物種鑒定的有效性研究，掲示 了介殼蟲DNA條形碼序列核巧酸組成的特性(Deng et aJ.，2012); Saccaggi等（2008) 通過mtDNA COI基因序列特征分析成功將葡萄綿粉階jP/anococcus巧CUS、相橘臀紋粉階和 長尾粉階iongisjoint/s區別開來。但運些數據仍遠達不到廣泛解決粉階科種 類準確鑒定的問題。
[0005] DNA條形碼技術是利用一段或幾段標準的、易擴增的、種間差異顯著大于種內差異 的DNA片段來鑒別物種的新技術，該概念最早由加拿大學者化bed提出。與傳統的分類鑒定 技術相比，DNA條形碼技術具有許多無可比擬的優點：（1)操作簡單，對物種分類鑒定知識缺 乏的人也可W通過標準技術流程對物種進行鑒定；（2)不受個體發育階段和形態特征的限 審IJ，只要個體存在完整的目標DNA片段即可滿足鑒定需求；（3)該技術可W作為傳統分類學 的輔助手段，幫助傳統分類學家修正W往的分類結論，解決形態分類無法解決的難題。正是 由于DM條形碼技術具有W上及其它很多優點，越來越多的研發人員加入了 DNA條形碼技術 研究行列，使該領域成為生物學研究的熱點之一(Hebert,2006)。但是關于粉階的基因條碼 快速檢測技術研究，國內外相關的系統報道仍然不多。因此，建立準確可靠的粉階條形碼檢 測技術，不僅對我國檢疫部口具有重要的意義，更是對我國基因資源的補充，特別是粉階害 蟲資源的補充，為我國在爭奪有限的資源方面能做出一定的貢獻，同時也為粉階的分類鑒 定提供新的方法。

【發明內容】

[0006] 本發明的目的在于解決上述的技術問題，提供一種一種粉階科昆蟲基因條形碼檢 測試劑盒及其檢測方法。
[0007] 本發明的目的通過W下技術方案來實現： 一種粉階科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒，至少包括一基因條形碼序列盤和20次用量W 上的引物PseJ與引物PseN;所述引物PseJ與引物PseN序列號為， PseJ:5'- CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN:5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3； 所述基因條形碼序列盤內存有93條標準條碼序列，所述標準條碼序列如SEQ ID NO. 1 到沈Q ID NO.93所示。
[000引優選地，所述試劑盒還包括20次用量W上的下列試劑：Taq buffer ,MgCb, dNTP miX，Taq DNA聚合酶，d地20, DNA標準樣。
[0009]優選地，一種粉階科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒的檢測方法，用所述試劑盒進行 擴增包括W下步驟： 51、 DNA模板的制備:采用GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠法提取試劑 盒，提取待檢測樣品； 52、 DNA條形碼序列的擴增：WSl中的DNA檢測樣品為模板，采用引物PseJ與引物PseN 進行PCR擴增，所述引物PseJ與引物PseN序列號為， PseJ:5'- CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN: 5 ' -TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3;所述PCR反應體系采用標準體系，總體積為 50化或25化； 所述PCR反應條件:95°C預變性4min;35個循環:94°C變形1111111，48°(：退火1111111，72°(：延 伸90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 53、 混合8化待測樣品與化1 eXGlycerol DNA上樣緩沖液上樣，Wdna Marker DLlOO 為分子量標記，室溫下恒壓120 V，用3%瓊脂糖凝膠電泳45min，0.5% ymol/L的邸染色，凝膠 成像系統檢測樣品，拍照分析； 54、 PCR結果判定： 混合8化PCR產物與2 yL 6 XGlycerol DNA上樣緩沖液上樣，Wdna Marker DLlOO為 分子量標記，室溫下恒壓120 V，用3 %瓊脂糖凝膠電泳45分鐘，0.5% ymol/L的邸染色，凝膠 成像系統檢測樣品，拍照;照片顯示粉階與標準DNA樣品在70化P位置有清晰的擴增條帶，即 為目標條帶； 55、 RCR產物測序獲得基因序列； S6、粉階科昆蟲基因比對 將待測粉階測序得到的序列與基因條形碼序列盤中標準基因條碼序列進行比對，若比 對相似度100%，則認定其為該種類;當沒有與任何標準條碼序列相似度達100%，則進行氨基 酸遺傳距離的比對判定是否在目標范圍內。
[0010] 優選地，所述PCR反應體系為50化，其中含5化IOXTaq buffer含有KCl、2mmol/L MgCl2、200ymol/L dNTP mix、2U hq DNA 聚合酶、化L DNA模板、引物各lymol/l; 所述PCR反應體系為25化，其中模板DNA化L，含Mg2+的10 X反應緩沖液2.扣UdNTPs 0.2mmol/L化L，5pmol/L上游引物和下游引物各化L，1.0 U hq DNA聚合酶0.化L，無菌水 補至2如L。
[0011] 優選地，所述Sl中的樣品為渡蘿潔粉階、李比利氏灰粉階、灰粉階屬一種斯smi coccus neobreWjOes、萍綿粉階、綿粉階屬一種化6/33(：?〇(：?(：?帖 3^^6/336、綿粉階屬一種/%aoacocct/s joarras、石蒜綿粉階、扶桑綿粉階、枯臀紋粉階、臀紋粉階屬一種PJanococct/s巧ct/s、日本 臀紋粉階、臀紋粉階屬一臀紋粉階屬一韋々Planococcus minor、 臀紋粉階屬一種戶Jaoococcus rarae、粉階屬一種Pset/c/ococcus 薦根粉階、康氏 粉階、粉階屬一種A?et/c/ococct/s Cr乃7tt/s、杰克貝爾氏粉階、擬長尾粉階、粉階屬一種 Pseudococcus vIburn1。
[0012] 優選地，所述S6粉階科昆蟲基因比對結果包括如下步驟， 561、 當得到的序列與標準基因條碼序列相似度100%，則認定其為該種類； 562、 當沒有與任何標準條碼序列相似度達100%，則將待測粉階基因序列按"無脊椎動 物密碼子"翻譯為氨基酸，與標準基因條碼序列所對應的氨基酸序列使用"P-distance模 型"計算遺傳距離，若與未知種類粉階基因序列遺傳距離小于1%的標準基因條碼種類，即為 目標種類;若遺傳距離都大于1%，判定未知粉階種類不在此21種粉階范圍內。
[0013] 本發明的有益效果主要體現在：（1)目標基因短，降低了實驗對標本質量的需求， 擴增效率高；（2)種間變異大而種內變異小，W區分不同物種;包含足夠的系統進化信息W 定位物種在分類系統中的位置，能滿足使用需求。（3)操作簡單，對物種分類鑒定知識缺乏 的人也可W通過標準技術流程對粉階科物種進行鑒定；（4)不受個體發育階段和形態特征 的限制，只要個體存在完整的目標DNA片段即可滿足鑒定需求。
【附圖說明】
[0014] 下面結合附圖對本發明技術方案作進一步說明： 圖1:扶桑綿粉階、石蒜綿粉階、康氏粉階=種粉階樣品的引物PseJ /Pse府廣增結果圖。
[0015] 圖2:實施例中的樣品擴增條帶示意圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發明掲示了一種粉階科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒及其檢測方法，本方法能高 效、準確、便捷的粉階科昆蟲分子檢測技術，可在分子水平將粉階科21種昆蟲種類區分，能 滿足使用需求。
[0017] -種粉階科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒，可W快速檢測21種粉階，所述粉階具體 如表1所示，所述試劑盒至少包括基因條形碼序列盤和20次用量W上的引物PseJ /PseN試 劑： 引物PseJ序列：5 ' - CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3 '， 引物PseN序列：5 ' - TAAACTTCT GGATGTCCAAAAAATCA-3 ' ； 所述基因條形碼序列盤存有93條標準條碼序列，詳細序列為SEQ ID NO.1到SEQ ID NO. 93所示。
[001引親1 :粉階種類與么疏
優選地，所述試劑盒還包括20次用量W上的下列試劑:Taq buffer,MgCb，dNTP mix, Taq DNA聚合酶，d地20, DNA標準樣。
[0019] W下詳細闡述下采用該試劑盒的檢測和區分方法： 選取扶桑綿粉階、石蒜綿粉階、康氏粉階、四紋豆象、白腹皮蠢、紅蠟階六份樣品作為待 檢測樣品。步驟如下： 1)總DNA提取 DNA的提取采用GenMa濁io動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠提取試劑盒進行提取。 具體過程如下： 直接將1-2頭昆蟲樣品放入2mm試管，無水乙醇浸泡保存標本用無菌蒸饋水沖洗浸泡4~ 5次，棄水;干標本無菌蒸饋水浸泡化后吸干水分。置于2mL離屯、管，MM400球磨儀中震蕩娠磨 (30次/3)303，加入180化17313 8證'6'、20化？'〇16111日36 1(，震蕩混勻，常溫過夜，55°(：震 蕩溫浴3-化，12000巧m離屯、IOmin，取上清，加入200化Binding Buf fer和200化無水乙醇， 充分混勻，加入20化磁珠，輕柔顛倒混勻lOmin。離屯、管置于磁力架，吸棄管內液體，保留磁 珠 ，Wash Buffer I SOOuL顛倒混勻2min置于磁力架，棄去管內液體，Wash Buffer n同樣 洗涂兩次，離屯、管仍置于磁力架上，緩慢加入Wash Buffer虹，Imin后移走管內液體。加入 20化Elution Buffer,55°C水浴IOmin洗脫磁珠上吸附的DNA，4°C儲存備用。
[0020] 2)序列擴增與測定 PCR反應體系：總體積為50 化，其中含5 yl IOXTaq buffer with KC1、2 mmol/L MgCbJOO ymol/L dNTP mix、2 U Taq DNA 聚合酶、3 yL DNA模板、引物各I ymol/l; 所述PCR反應體系為25化，其中模板DNA化L，含Mg2+的10 X反應緩沖液2.扣UdNTPs 0.2mmol/L化L，5pmol/L上游引物和下游引物各化L，1.0 U hq DNA聚合酶0.化L，無菌水 補至2如L。
[0021] 反應條件：95°C 預變性 4min;35 個循環：94°C 變形 1111111，48°(：退火1111111，72°(：延伸 90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 混合8 yL待測樣品與2 yL 6 X Glycerol DNA loading Buffer上樣，Wdna Marker DLlOO為分子量標記，室溫下恒壓120 V，用3%瓊脂糖凝膠電泳45 min，0.5% ymol/L的邸染 色，進行凝膠成像系統檢測樣品，拍照、分析； 電泳圖，如圖2所示，圖中1為扶桑綿粉階;圖中2為石蒜綿粉階;圖中3為康氏粉階;圖中 4為四紋豆象;圖中5為白腹皮蠢；圖中6為紅蠟階。
[0022] 六個樣品中、=種粉階、紅蠟階擴增出7(K)bp大小的條帶，四紋豆象、白腹皮蠢未擴 增出條帶，排除的運兩種不在粉階科昆蟲之內，且符合實際，排除準確。
[0023] W上擴增出條帶的產物WPCR引物作為測序引物，進行雙向測序，由蘇州金唯智 生物科技有限公司完成。
[0024] 3)基因比對 利用現有的比對軟件和計算機技術，將未知種類粉階測序得到的序列結果與基因條形 碼序列盤中標準基因條碼序列進行比較，具體結果按W下方式運行： A:當序列與標準基因條碼序列相似度100%，則認定其為該種類； B:當序列沒有與任何標準條碼序列相似度達100%，則將未知種類粉階基因序列按"無 脊椎動物密碼子"翻譯為氨基酸，與標準基因條碼的氨基酸序列使用"P-distance模型"計 算遺傳距離，與未知種類粉階基因序列遺傳距離小于2%的標準基因條碼種類，即為目標種 類;如果遺傳距離都大于1%，說明未知粉階種類不在此21種粉階范圍內。
[00巧]準確性檢測： 所得5條序列依次輸入基因條形碼序列盤進行計算比對，結果如下： 1)石蒜綿粉階序列與序列盤中谷斑粉階標準條碼基因相似度為100%，鑒定結果準確。
[0026] 2)扶桑綿粉階序列與序列盤中扶桑綿粉階標準條碼基因相似度為98%，與序列盤 中扶桑綿粉階標準條碼基因遺傳距離0.2%，按結果認定規則認定為扶桑綿粉階，鑒定結果 準確。
[0027] 3)康氏粉階序列與序列盤中康氏粉階標準條碼基因相似度為98%~100%，與序列盤 中的康氏粉階標準條碼基因遺傳距離在0%~0.88%之間，按結果認定規則認定為康氏粉階， 鑒定結果準確。
[0028] 4)紅蠟階與序列盤中粉階標準條碼基因遺傳距離為31.9%~39.7%，遠大于2%，按結 果認定規則認定非21種粉階。
[0029] 所有結果與供試的樣本種類相符，結果符合要求，表明該試劑盒可W準確鑒定運3 種粉階。
[0030] 本發明尚有多種具體的實施方式，凡采用等同替換或者等效變換而形成的所有技 術方案，均落在本發明要求保護的范圍之內。
【主權項】
1. 一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒，其特征在于：至少包括一基因條形碼序列 盤和20次用量以上的引物PseJ與引物PseN;所述引物PseJ與引物PseN序列號為， PseJ:5'_ CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN:5'-TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3； 所述基因條形碼序列盤內存有93條標準條碼序列，所述標準條碼序列如SEQ ID NO.1 到SEQ ID NO.93所示。2. 根據權利要求1所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒，其特征在于:所述試 劑盒還包括20次用量以上的下列試劑：Taq buffer，MgCl2，dNTP mix，Taq DNA聚合酶， CldH2O，DNA 標準樣。3. -種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒的檢測方法，其特征在于，用所述試劑盒進 行擴增包括以下步驟： 51、 DNA模板的制備：采用GenMagBio動物細胞組織/細胞基因組DNA磁珠法提取試劑 盒，提取待檢測樣品； 52、 DNA條形碼序列的擴增：以Sl中的DNA檢測樣品為模板，采用引物PseJ與引物PseN 進行PCR擴增，所述引物PseJ與引物PseN序列號為， PseJ:5'_ CCTTCAACTAATCATAAAAATATNAG -3'； PseN: 5 ' -TAAACTTCTGGATGTCCAAAAAATCA-3;所述PCR反應體系采用標準體系，總體積為 50yL 或 25yL; 所述PCR反應條件:95°C預變性4min;35個循環:94°C變形lmin，48°C退火lmin，72°C延 伸90s;最后72°C延伸4min，4°C保存； 53、 混合8yL待測樣品與2yL 6 XGlycerol DNA上樣緩沖液上樣，以DNA Marker DLlOO 為分子量標記，室溫下恒壓120 V，用3%瓊脂糖凝膠電泳45min，0.5% ymol/L的EB染色，凝膠 成像系統檢測樣品，拍照分析； 54、 PCR結果判定： 混合8yL PCR產物與2 yL 6 X Glycerol DNA上樣緩沖液上樣，以DNA Marker DLlOO為 分子量標記，室溫下恒壓120 V，用3 %瓊脂糖凝膠電泳45分鐘，0.5% μ mol/L的EB染色，凝膠 成像系統檢測樣品，拍照；照片顯示粉蚧與標準DNA樣品在700bp位置有清晰的擴增條帶，即 為目標條帶； 55、 RCR產物測序獲得基因序列； 56、 粉蚧科昆蟲基因比對 將待測粉蚧測序得到的序列與基因條形碼序列盤中標準基因條碼序列進行比對，若比 對相似度100%，則認定其為該種類;當沒有與任何標準條碼序列相似度達100%，則進行氨基 酸遺傳距離的比對判定是否在目標范圍內。4. 如權利要求3所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于，所述PCR反應體系為50yL，其中含5yL IOXTaq buffer 含有KCl、2mmol/L MgCl2、200μ mol/L dNTP mix、2U Taq DNA 聚合酶、3yL DNA模板、引物各Ιμπιο?/L; 所述？〇?反應體系為25以1^，其中模板0嫩2以1^，含1%2+的10\反應緩沖液2.5以1^，(11?1^ 0.2mmol/L 2yL，5pmol/L上游引物和下游引物各lyL，1.0 U Taq DNA聚合酶0.2yL，無菌水 補至25yL。5. 如權利要求3所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于，所述Sl中的樣品為菠蘿潔粉蟻、李比利氏灰粉蟻、灰粉蟻屬一種 /3eo/7rerij〇es、萍綿粉蟻、綿粉蟻屬一種/%e/3acocct/s amoae、綿粉蟻屬一種PAe/jacocct/s parn/s、石蒜綿粉蚧、扶桑綿粉蚧、桔臀紋粉蚧、臀紋粉蚧屬一種/^a/3〇 C〇CCtAs /ict/s、日本 臀紋粉蟻、臀紋粉蟻屬一臀紋粉蟻屬一種Planococcus minor、 臀紋粉蟻屬一rarae、粉蟻屬一種Pset/c/ococct/s 鹿根粉蟻、康氏 粉蟻、粉蟻屬一種JpSeuczococcus CiTPius、杰克貝爾氏粉蟻、擬長尾粉蟻、粉蟻屬一種 Pseudococcus viburni。6. 如權利要求3所述的一種粉蚧科昆蟲基因條形碼檢測試劑盒的檢測方法，其特征在 于，所述S6粉蚧科昆蟲基因比對結果包括如下步驟， 561、 當得到的序列與標準基因條碼序列相似度100%，則認定其為該種類； 562、 當沒有與任何標準條碼序列相似度達100%，則將待測粉蚧基因序列按"無脊椎動 物密碼子"翻譯為氨基酸，與標準基因條碼序列所對應的氨基酸序列使用"P-distance模 型"計算遺傳距離，若與未知種類粉蚧基因序列遺傳距離小于1%的標準基因條碼種類，即為 目標種類;若遺傳距離都大于1%，判定未知粉蚧種類不在此21種粉蚧范圍內。
【文檔編號】C12Q1/68GK105925697SQ201610381928
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】鄭斯竹, 楊曉軍, 詹國輝
【申請人】蘇州市外來有害生物防控技術中心