檢測病毒樣品中回復突變的方法和用于該方法的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本申請公開了一種檢測病毒樣品中回復突變的方法，其包括：獲得所述病毒樣品中的核酸；獲得PCR反應混合物，所述PCR反應混合物包含所述核酸、引物、核苷酸單體混合物和核酸聚合酶，其中所述引物能夠特異性地與發生回復突變的核酸通過堿基互補結合；將所述PCR反應混合物分散成多個微滴；對所述多個微滴分別進行PCR擴增；檢測在所述多個微滴中的PCR擴增產物。本申請還公開了實現上述方法的試劑盒。
【專利說明】
檢測病毒樣品中回復突變的方法和用于該方法的試劑盒
技術領域
[0001] 本申請涉及生物檢測領域，更具體地，涉及一種檢測病毒樣品中回復突變的方法 和用于該方法的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 基因治療是將人的正常基因或有治療作用的基因通過一定方式導入人體靶細胞 以糾正基因的缺陷或者發揮治療作用，從而達到治療疾病目的的生物醫學技術。基因治療 與常規治療方法不同，其針對的是疾病的根源一異常的基因本身。隨著研究的不斷深入，基 因治療己從單基因遺傳病擴展到多個病種范圍，例如惡性腫瘤、心血管疾病、遺傳病、AIDS 和類風濕等。
[0003] 雖然基因治療藥物有著光明的前景，但是也有潛在的危險性。在基因治療藥物的 生產的過程中，基因藥物有一定的概率會與宿主細胞產生回復突變，而回復突變后的基因 藥物會對人體產生潛在的副作用，因此，各國監管部門對基因治療藥物的回復突變的比例 提出了非常高的要求，例如，美國食品藥品監督管理局（FDA)要求回復突變率應在 個拷貝的基因藥物中不超過1個拷貝的回復突變。
[0004] 由于病毒樣品中具有的回復突變的病毒拷貝數可能只占總的病毒拷貝數的極少 數，甚至遠遠低于百萬分之一的水平，在絕對數量上更可能僅有個位數的拷貝。在現有技術 中，要準確定量檢測如此痕量的回復突變非常困難，在技術上面臨巨大的挑戰。不僅如此， 由于病毒樣品中總的病毒拷貝數達到3X10 1(]個拷貝甚至更多，這與極少的（例如個位數 的）回復突變拷貝數形成鮮明對比。要在這些數以億計的不具有回復突變的病毒拷貝中準 確地定量檢測出稀少的回復突變拷貝，無異于大海撈針。而且這些數以億計的不具有回復 突變的病毒拷貝與待檢測的回復突變拷貝具有極為相似的核苷酸序列，這又反過來對定量 檢測造成極大的干擾，使得準確的定量檢測更加困難，甚至幾乎不可能。所以，提供一種能 夠準確檢測回復突變的方法是至關重要的。

【發明內容】

[0005] 本申請提供了一種檢測病毒樣品中回復突變的方法和用于該方法的試劑盒。
[0006] 在本申請的一個方面中，提供了一種檢測病毒樣品中回復突變的方法，其包括：獲 得所述病毒樣品中的核酸；獲得PCR反應混合物，所述PCR反應混合物包含所述核酸、引物、 核苷酸單體混合物和核酸聚合酶，其中所述引物能夠特異性地與發生回復突變的核酸通過 堿基互補結合；將所述PCR反應混合物分散成多個微滴；對所述多個微滴分別進行PCR擴 增；及檢測在所述多個微滴中的PCR擴增產物。
[0007] 在一些實施方式中，所述將所述PCR反應混合物分散成多個微滴的步驟包括將所 述PCR反應混合物和油相混合以形成含有油相和水相的乳液，并將所述乳液分散成多個微 滴。
[0008] 在一些實施方式中，所述病毒樣品含有具有突變的病毒，且所述回復突變涉及在 所述具有突變的病毒的基因組中原本缺失的核酸被至少部分或全部恢復。在一些實施方式 中，所述病毒樣品含有具有突變的腺病毒。在一些實施方式中，所述具有突變的腺病毒是溶 瘤性腺病毒。在一些實施方式中，所述具有突變的腺病毒在Ela基因和/或Elb基因缺失 了至少部分的核酸。在一些實施方式中，具有突變的腺病毒與Ad5相比，缺失對應于Ad5的 Ela基因的SEQ ID NO: 1所示區域的全長或者其片段。在一些實施方式中，所述具有突變 的腺病毒與Ad5相比，缺失對應于Ad5的Elb基因的SEQ ID NO: 2所示區域的全長或者其 片段。在一些實施方式中，所述回復突變涉及在所述具有突變的病毒的基因組中原本缺失 的SEQ ID NO: 1的全長或者其片段被至少部分或全部恢復。在一些實施方式中，所述回復 突變涉及在所述具有突變的病毒的基因組中原本缺失的SEQ ID NO: 2的全長或者其片段被 至少部分或全部恢復。
[0009] 在一些實施方式中，所述引物能夠特異性結合于被部分或全部恢復的所述缺失的 核酸。在一些實施方式中，所述引物能夠特異性結合于具有如序列SEQ ID N0:1或2所示 的序列。在一些實施方式中，所述引物具有序列SEQ ID NOs: 3-6任一所述的序列。
[0010] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有病毒核酸拷貝數大于或等于 1 X 10'在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸拷貝數大 于或等于3X10'在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸 拷貝數大于或等于IX 1011。
[0011] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸濃度大于 或等于l〇ng/yl。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸 濃度大于或等于lOOng/ y 1。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣 品的核酸濃度大于或等于200ng/ y 1。
[0012] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸摩爾濃度 (以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計）的比值大于或等 于1/1080。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸摩爾濃 度（以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計）的比值大于或 等于1/360。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸摩爾濃 度（以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計）的比值大于或 等于1/108。
[0013] 在一些實施方式中，所述反應混合物進一步含有探針，所述探針能夠特異性地顯 示含有所述突變的核酸的PCR擴增。
[0014] 在一些實施方式中，所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于或等于30nM。 在一些實施方式中，所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于或等于100nM。在一些實 施方式中，所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于或等于200nM。
[0015] 在一些實施方式中，所述探針具有序列SEQ ID NO:7。在一些實施方式中，所述探 針在5'端具有FAM，在3'段具有MGBNFQ。
[0016] 在一些實施方式中，所述的方法還包括通過計算含有PCR擴增產物的微滴的數量 來確定所述病毒樣品中回復突變的數量。
[0017] 在一些實施方式中，所述病毒樣品中回復突變的數量為在每3X101(]個拷貝的病 毒樣品中大于或等于1個拷貝。在一些實施方式中，病毒樣品中回復突變的數量為在每 3 X 101(]個拷貝的病毒樣品中為0-10000個拷貝、0-1000個拷貝、0-100個拷貝或0-10個拷 貝。
[0018] 在本申請的另一個方面中，提供了一種用于本申請所述檢測病毒樣品中回復突變 的方法的試劑盒，其包括引物和探針。
[0019] 在一些實施方式中，所述引物具有核苷酸序列SEQ ID NOs: 3-6任一所述的核苷酸 序列、或SEQ ID N0s:3-4的組合、或SEQ ID N0s:5-6的組合。
[0020] 在一些實施方式中，所述探針具有核苷酸序列SEQ ID N0:7。
[0021] 以上為本申請的概述，可能有簡化、概括和省略細節的情況，因此本領域的技術人 員應該認識到，該部分僅是示例說明性的，而不旨在以任何方式限定本申請范圍。本概述部 分既非旨在確定所要求保護主題的關鍵特征或必要特征，也非旨在用作為確定所要求保護 主題的范圍的輔助手段。
【附圖說明】
[0022] 通過下面說明與附圖結合，將更加充分地描述本申請內容的上述和其他特征。可 以理解，這些附圖僅描繪了本申請內容的若干實施方式，因此不應認為是對本申請內容范 圍的限定。通過采用附圖，本申請內容將會得到更加明確和詳細地說明。
[0023] 圖1示出了常規PCR方法檢測陽性模板（即含有模擬回復突變的病毒核酸）的電 泳照片。
[0024] 圖2A示出了熒光PCR方法檢測陽性模板，其中未加入陰性模板（即不含有模擬回 復突變的病毒核酸），的標準曲線。
[0025] 圖2B示出了陽性模板中加入了陰性模板的熒光PCR方法的標準曲線。
[0026] 圖3A示出了用微滴式數字PCR方法檢測未加入陰性模板的陽性模板所得到的結 果擬合圖。圖中的橫坐標代表陽性模板的理論拷貝數，縱坐標代表數字PCR方法檢測出的 實際拷貝數。
[0027] 圖3B示出了用微滴式數字PCR方法檢測加入了陰性模板的陽性模板所得到的結 果擬合圖。圖中的橫坐標代表陽性模板的理論拷貝數，縱坐標代表數字PCR方法檢測出的 實際拷貝數。
[0028] 圖4A示出了使用25nM的探針時微滴式數字PCR方法的檢測結果圖。
[0029] 圖4B示出了使用250nM的探針時微滴式數字PCR方法的檢測結果圖。
[0030] 圖5A示出了對含有1. 8 X 109個拷貝的病毒核酸的樣品用微滴式數字PCR方法進 行檢測的結果圖。
[0031] 圖5B示出了對含有1. 57X 1011個拷貝的病毒核酸的樣品用微滴式數字PCR方法 進行檢測的結果圖。
【具體實施方式】
[0032] 本申請涉及一種檢測病毒樣品中回復突變的方法，其包括：獲得所述病毒樣品中 的核酸；獲得PCR反應混合物，所述PCR反應混合物包含所述核酸、引物、核苷酸單體混合物 和核酸聚合酶，其中所述引物能夠特異性地與發生回復突變的核酸通過堿基互補結合；將 所述PCR反應混合物分散成多個微滴；對所述多個微滴分別進行PCR擴增；和檢測在所述 多個微滴中的PCR擴增產物。
[0033] 病毒樣品
[0034] 病毒是一種生物物質，當其感染宿主細胞后，能夠利用宿主細胞內的核酸復制和/ 或蛋白合成機制，復制自身核酸和/或合成自身蛋白。某些病毒還可以利用宿主細胞，組裝 出成熟的病毒顆粒，其包括外殼和包裹在外殼內的核酸基因組。病毒的核酸基因組可以是 RNA或DNA，可以是單鏈核酸分子也可以是雙鏈核酸分子。
[0035] 病毒可以以不同的形式存在。在某些實施方式中，病毒可以是感染性的核酸分子， 當進入宿主細胞后，可以利用宿主細胞內核酸復制機制進行核酸的復制。感染性的核酸分 子包括DNA和RNA，可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。感染性的核酸分子的例子包括，例如， 分離的病毒核酸基因組序列，或者載有病毒核酸基因組序列的質粒。在某些實施方式中，病 毒可以是病毒顆粒，其包含外殼和包裹在外殼內的核酸基因組。病毒顆粒中的外殼可以包 含蛋白外殼。病毒顆粒可以有不同的形狀和大小（例如約0.02微米至0.3微米）。應理 解，本申請所述的病毒包括上述任一的病毒形式，而不僅僅指成熟的病毒顆粒。
[0036] 本申請所述的病毒不僅包括野生型病毒，也包括具有突變的病毒。術語"具有突 變的病毒"在本申請中是指與野生型病毒相比，在核酸序列上存在改變的病毒，所述改變 包括，例如，在病毒基因組序列中刪除、插入和/或取代一個或多個核酸。具有突變的病毒 可以包括天然突變的病毒，也包括人工突變的病毒。人工突變的方法可以包括，例如，使用 一種或多種分子生物學技術對病毒的基因組序列進行人為改變，或者將病毒在非天然宿主 細胞中進行人工傳代以導致病毒基因組序列在傳代過程中發生改變。人工突變的病毒可 以包括重組病毒或者經過人工傳代而導致基因組發生改變的病毒。在某些實施方式中，具 有突變的病毒中的核酸刪除、插入和/或取代發生在病毒的一個或多個基因序列中。所述 缺失、插入和/或取代可以影響所述基因的功能，例如但不限于，降低或消除所述基因的功 能、提高或引入所述基因的功能。病毒的非限制性實例包括流感病毒、脊髓灰質炎病毒、腺 病毒、蟲媒病毒、星狀病毒、噬菌體、腸病毒、胃腸炎病毒、漢坦病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎 病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、皰疹病毒（例如，愛潑斯坦巴爾病毒（EBV)、巨細胞病 毒（CMV)和單純皰疹病毒（HSV))、諾瓦克病毒、脊椎動物痘病毒亞科（例如，5型正痘病毒、 牛痘病毒、MVA、NYVAC、禽痘病毒、金絲雀痘病毒、ALVAC、ALVAC(2)、禽痘病毒）、彈狀病毒、 呼腸孤病毒、鼻病毒、輪狀病毒、逆轉錄病毒、桿狀病毒科、杯狀病毒科、花椰菜花葉病毒科、 冠狀病毒科、絲狀病毒科、黃病毒科、嗜肝病毒科、野田村病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、 乳頭瘤毒科、細小病毒科、藻類去氧核糖核酸病毒科、微小核糖核酸病毒科和披膜病毒科， 以及衍生自這些病毒的變體病毒。還包括本領域已知的其它適合的病毒，例如Fields等在 Virology (第 34 版，L ippincott ffilliams&fTilkins (2001))中所描述的。
[0037] 在一些實施方式中，本申請所述的病毒是腺病毒。成熟的腺病毒顆粒是一種中型 的（直徑為90-100nm)、含有約36kb雙鏈DNA的無包膜二十四面體病毒顆粒。腺病毒的基 因組通常不會整合至宿主細胞的染色體，而是保持線性游離體形式，從而極大降低了重組 的腺病毒干擾正常細胞功能的可能性。本申請所述的腺病毒優選是人類腺病毒，但也可以 是非人類腺病毒例如猿腺病毒、禽腺病毒、犬腺病毒、綿羊腺病毒或牛腺病毒。目前已知51 種腺病毒的血清型，分別分為A到F共6個亞群：A亞群包括例如，血清型12、18和31 ;B亞 群包括例如，血清型3、7、11、14、16、21、34、35和50 ;C亞群包括例如，血清型1、2、5和6 ;D 亞群包括例如，血清型 8、9、10、13、15、17、19、20、22-30、32、33、36-39 和 42-48 ;E 亞群包括 例如，血清型4 ;F亞群包括例如，血清型40和41。本申請的檢測方法可應用于任何適合的 腺病毒血清型。在某些實施方式中，本申請的檢測方法可應用于血清型2的腺病毒（其全 基因組序列請參見Genbank登陸號：AC_000007)和血清型5的腺病毒（其全基因組序列請 參見 Genbank 登陸號：AY339865) 〇
[0038] 在某些實施方式中，本申請所使用的腺病毒是具有突變的腺病毒。所述具有突變 的腺病毒的基因組已被改變，以缺失至少一部分野生型的病毒核酸序列，和/或者插入對 于被改造的腺病毒而言是異源的核酸序列（例如可以是非腺病毒的核酸序列或者是不同 血清型的腺病毒的核酸序列）、和/或者取代至少一部分野生型的病毒核酸序列。
[0039] 在一些實施方式中，本申請所述的腺病毒是溶瘤性腺病毒。"溶瘤性腺病毒"在本 申請中是指能夠特異性地在腫瘤細胞中復制或者特異性地在腫瘤細胞中具有復制能力的 腺病毒。在某些實施方式中，溶瘤性腺病毒包含腫瘤特異性啟動子。"腫瘤特異性啟動子" 在本申請中是指優選地或特異性地在腫瘤細胞中具有啟動基因表達的功能且在非腫瘤細 胞或非癌細胞中無活性或具有降低活性的啟動子。腫瘤特異性啟動子的實例包括，但不限 于，E2F-1啟動子、a -甲胎蛋白啟動子、縮膽囊肽啟動子、癌胚抗原啟動子、C_erbB2/neu癌 基因啟動子、環氧合酶啟動子、CXCR4啟動子、HE4啟動子、II型己糖激酶啟動子、L-網素啟 動子、MUC1啟動子、PSA啟動子、存活素啟動子、TRP1啟動子、和酪氨酸酶啟動子。腫瘤特異 性啟動子可以通過基因工程的方式插入到腺病毒的基因組序列中或取代一部分腺病毒的 天然序列。
[0040] 在一些實施方式中，本申請所述的病毒（例如腺病毒）在某些病毒基因中缺失了 至少部分的核酸。利用本領域公知的技術，可以對腺病毒基因組中的多種基因進行人工改 造，以使其缺失至少部分核酸序列。例如，可以對腺病毒的復制必需的基因進行改造，以刪 除至少部分核酸，從而得到具有改變的復制能力的、有條件地復制能力的或復制缺陷的腺 病毒。復制必需的基因是指參與腺病毒復制過程（例如，基因組復制、病毒顆粒的包裝等） 的基因，包括但不限于，腺病毒早期區基因（例如E1、E2和E4)、晚期區基因（例如L1、L2、 L3、L4和L5)、參與病毒包裝的基因（例如IVa2基因）和病毒相關RNA (例如VA-RNA-1和 /或VA-RNA-2)。對于某個給定的腺病毒，本領域技術人員可以通過公知的方法確定出在某 個感興趣的基因中是否缺失了至少部分的核酸。例如，對于某個感興趣的基因，可以使用已 知的參考腺病毒（例如野生型腺病毒Ad5)的參考基因序列，在給定腺病毒的基因組中進行 同源性比對，從而判斷在給定腺病毒的對應的基因序列中是否缺失了部分核酸序列。可以 使用本領域已知的同源性比對工具進行同源性比對，例如，BLAST',
[0041] 在某些實施方式中，本申請所述的腺病毒在El (例如Ela和/或Elb基因）和/或 E3基因中、在E1 (例如Ela和/或Elb基因）和/或E2基因中、和/或在E1 (例如Ela和 /或Elb基因）和/或E4基因中缺失了至少部分核酸。所述腺病毒的E1 (例如Ela、Elb)、 E2、E3、E4基因序列可以根據參考腺病毒（例如野生型腺病毒Ad5)的對應的基因序列在所 述腺病毒的基因組序列中進行同源性搜索得到確認。"缺失"或"刪除"在本申請中是指， 當給定腺病毒的對應基因與參考腺病毒的參考基因相比時，某一段核酸序列（長度至少為 1個堿基）在參考腺病毒的參考基因中存在但是在特定腺病毒的對應基因的對應位置處為 空缺。參考腺病毒可以是野生型腺病毒，例如但不限于Ad5,其基因組序列可參見Genebank 登錄號AY339865。在某些實施方式中，當與Ad5的基因組序列相比時，本申請所述的腺病 毒可以在Ela基因中缺失對應于Ad5的Ela基因的SEQ ID N0:1所示區域的全長或者其片 段，所述片段至少包括 l〇bp、20bp、50bp、lOObp、200bp、300bp、400bp、或 500bp。在某些實施 方式中，當與Ad5的基因組序列相比時，本申請所述的腺病毒可以在Elb基因中缺失對應于 Ad5的Elb基因的SEQ ID N0:2所示區域的全長或者其片段，所述片段至少包括10bp、20bp、 50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、或500bp。不受理論的限制，腺病毒的Ela和/或Elb基 因的缺失可能使得腺病毒無法在正常人類細胞中復制。
[0042] 在一些實施方式中，本申請所述的腺病毒的Ela基因對應于Ad5全基因組序列 (Genbank登陸號：AY339865)的第468-1632位核苷酸。在一些實施方式中，Ela基因具有 如序列SEQ ID NO: 1所示的序列。在一些實施方式中，本申請所述的腺病毒的Elb基因對 應于Ad5全基因組序列（Genbank登陸號：AY339865)的第1672-3509位核苷酸。在一些實 施方式中，Elb基因具有如序列SEQ ID N0:2所示的序列。
[0043] 本申請所述的"病毒樣品"是指含有病毒的材料或制劑，例如病毒制劑。在某些實 施方式中，所述病毒樣品是用于基因治療的病毒制劑。
[0044] 本申請所述的病毒樣品可以在它們的天然狀態（當收集時）和/或以改變的狀態 下進行分析，例如在儲存、保存、抽提、溶解、稀釋、濃縮、純化、過濾、與一種或多種試劑混合 的狀態下。
[0045] 回復突奪
[0046] 本申請所述的病毒的"回復突變"是指在具有突變的病毒中，所述突變的核酸序列 被進一步改變以部分或全部恢復為突變以前的序列。回復突變的實例可以包括，例如：原本 缺失的核酸序列被部分或全部恢復成缺失以前的核酸、或者原本被插入的核酸序列被部分 或全部缺失、或者原本被取代的核酸序列被部分或全部恢復成取代以前的核酸序列。
[0047] 在某些實施方式中，所述回復突變是在具有突變的病毒基因組中，原本缺失的核 酸序列被至少部分或全部插入，從而部分或全部恢復成缺失以前的核酸序列。在某些實施 方式中，所述具有突變的病毒基因組是具有突變的腺病毒基因組，例如溶瘤腺病毒基因組， 其中可選地在Ela和/或Elb基因缺失了至少部分的核酸，例如，與Ad5相比時，其缺失對 應于Ad5的Ela基因的SEQ ID NO: 1所示區域的全長或者其片段，或缺失對應于Ad5的Elb 基因的SEQ ID N0:2所示區域的全長或者其片段。
[0048] 在一些實施方式中，所述回復突變涉及具有突變的腺病毒基因組（例如溶瘤性腺 病毒基因組）中缺失的Ela基因或其片段、和/或缺失的Elb基因或其片段被至少部分或全 部恢復。在一些實施方式中，所述缺失的Ela基因或其片段（例如SEQ ID NO: 1所示的全 長或其片段）被至少部分或全部恢復。在一些實施方式中，所述的Elb基因或其片段（例 如SEQ ID N0:2所示的全長或其片段）被至少部分或全部恢復。
[0049] "至少部分恢復"是指，至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、或至少90%的 缺失的核酸被恢復（包括連續及間斷的序列）。在某些實施方式中，缺失的核酸被至少部分 恢復后，原本由于缺失而受影響的生物學功能至少部分或完全被恢復。
[0050] 在一些實施方式中，每3X101(]個拷貝的病毒樣品中包含不多于10, 000個拷貝的 回復突變、不多于1，〇〇〇個拷貝的回復突變、不多于100個拷貝的回復突變、不多于10個拷 貝的回復突變或不多于1個拷貝的回復突變。在一些實施方式中，所述病毒樣品中回復突 變的數量為或者被懷疑為在每3X 101(]個拷貝的病毒樣品中不超過10個拷貝，或者不超過 1個拷貝。
[0051] 獲得所沭病毒樣品中的核酸
[0052] 本申請的方法包括獲得所述病毒樣品中的核酸。本申請所述的核酸可以是脫氧核 糖核酸（DNA)，也可以是核糖核酸（RNA)。核酸可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。在一些實 施方式中，本申請的核酸是指病毒樣品本身的基因組核酸。例如，如果病毒樣品是腺病毒， 則核酸是指腺病毒的基因組核酸。
[0053] 可以使用本領域已知的方法提取病毒樣品中的核酸。可以使用本領域已知的從生 物樣品中提取核酸的方法（參見，例如Nucleic Acids Isolation Methods，Bowein(編）， American Scientific Publishers (2002)。在一些實施方式中，可以使用機械剪切（比如 振蕩、攪拌等）以破壞病毒顆粒從而使病毒樣品中的核酸得以游離出來。通常而言，還可以 通過常用的化學試劑（例如酚氯仿等）處理病毒樣品，在保持核酸分子不受破壞的同時使 蛋白質等雜質變性并沉淀，從而與核酸分子分離開來。分離的過程還可以使用抑制核酸酶 的物質，以盡可能保持核酸分子的完整性。分離的核酸分子可以進一步被純化，例如通過用 無水乙醇洗滌并沉淀。
[0054] 在一些實施方式中，本申請的方法還可以進一步包括對獲得的核酸進行預處理以 降低核酸粘度的步驟。在一些實施方式中，所述預處理包括使用核酸酶處理所述核酸以降 低核酸粘度。核酸酶可以是位點特異性的核酸內切酶，其可以識別在核酸序列上的特定位 點（即特定的序列），并將核酸分子在該特定的位點處剪切，從而得到核酸片段。本領域公 知的任何適當的核酸酶都可以使用。可以選擇適當的核酸內切酶，以使得其識別的特定位 點在待檢測的發生回復突變的區域之外，從而避免對發生回復突變的區域的破壞。
[0055] 獲得PCR反應混合物
[0056] 本申請的方法還包括獲得PCR反應混合物。PCR反應混合物是指用于進行PCR反 應的反應混合物。在一些實施方式中，PCR反應混合物包含從病毒樣品中獲得的核酸，還包 含引物、核苷酸單體混合物和核酸聚合酶。PCR反應混合物還可以進一步包含緩沖液（例 如Tris-Cl緩沖液），其有助于將反應混合物保持在適當的pH，以及可選地金屬離子（例如 Mg +2等），其為某些核酸聚合酶發揮酶活性所必需。
[0057] 在本申請的方法中，從病毒樣品中獲得的核酸中包含或者被懷疑包含極少量的回 復突變，例如每3 X 101(]個拷貝的病毒樣品中不超過100個拷貝、不超過10個拷貝、或不超 過1個拷貝的回復突變。通常，在基因治療領域，美國FDA規定，用于基因治療的病毒制品 中，每3 X 101(]個拷貝的病毒拷貝中應不超過1個拷貝的回復突變。
[0058] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸拷貝數 大于或等于1\10 1°、3\101°或1\1011。在一些實施方式中，所述？0?反應混合物中含有 的所述病毒樣品的核酸拷貝數小于或等于IX 1015、IX 1014、IX 1013或IX 10 12。在一些實 施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸拷貝數為1 X 101(]-1 X 1015、 lXlOiO-lXlO^XK^-lXlOllXloH-lXlO12。
[0059] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸拷貝數是 指進行一次檢測所用的PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸拷貝數。所述核酸拷 貝數可以通過本領域公知的方法確定。例如，可以對獲得的病毒樣品中的核酸通過分光光 度法檢測，計算得到總拷貝數或總拷貝濃度，再根據在PCR反應混合物中的核酸的加入量 或體積計算PCR反應混合物中的拷貝數；或者，可以直接對PCR反應混合物通過分光光度法 檢測，通過計算得到PCR反應混合物中的核酸拷貝數。
[0060] 在一些實施方式中，為計算病毒樣品的核酸拷貝數，可以將從病毒樣品中獲得的 核酸用適當的溶液（例如TE緩沖液）溶解，使用分光光度計檢測該核酸溶液在260nm的吸 光值，使用獲得的吸光值計算核酸的濃度進而根據核酸的分子量推算出核酸的拷貝數。例 如，可以根據如下公式計算DNA濃度：
[0061]
[0062] 其中，A260 = 260nm處的吸光值；L =比色皿的厚度；N =稀釋倍數。
[0063] 在一個實施方式中，當所述病毒樣品是腺病毒時，可以根據如下公式計算腺病毒 樣品的單位體積中的病毒核酸拷貝數，再乘以核酸溶液的體積可以得出樣品中病毒核酸的 總拷貝數，
[0064]
[0065] 病毒核酸分子量=喊基對數X660道爾頓。
[0066] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸濃度大于 或等于10ng/ y l、100ng/ y 1或200ng/ y 1。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中 含有的所述病毒樣品的核酸濃度小于或等于500ng/ y l、400ng/ y 1或300ng/ y 1。在一 些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸濃度為10-500ng/y 1、 100-400ng/ y 1或200-300ng/ y 1。所述核酸濃度可以通過本領域公知的方法確定。例如， 可以對獲得的病毒樣品中的核酸通過分光光度法檢測，通過計算得到核酸的濃度，再根據 在PCR反應混合物中的核酸的加入量或體積，計算PCR反應混合物中的核酸濃度；或者，可 以直接對PCR反應混合物通過分光光度法檢測，通過計算得到PCR反應混合物中的核酸濃 度。
[0067] 在一個實施方式中，還可以計算病毒樣品的核酸摩爾濃度。當所述病毒樣品是腺 病毒時，其摩爾濃度可以如下計算：
[0069] 病毒核酸分子量=喊基對數X660道爾頓。
[0070] 在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸摩爾濃 度為大于或等于〇. 83、2. 5、或8. 33nM。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有 的所述病毒樣品的核酸拷貝數小于或等于83, 333、8, 333、833. 3或83. 3nM。在一些實施 方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸拷貝數為0. 83nM-83, 333nM、 0? 83nM-8, 333nM、2. 5nM-833. 3nM 或 8. 33nM-83. 3nM。
[0071] 本申請所述的"引物"是指能夠和/或用于起動核酸模板的復制的寡聚核苷酸分 子，其具有7-40個核苷酸、10-38個核苷酸、15-30個核苷酸、15-25個核苷酸，或者17-20個 核苷酸。例如，引物可以是長度為 7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29或30的寡聚核苷酸。引物可以包含DNA、RNA、核酸類似物、或其任意的 組合。示例性引物可以是化學合成的。在某些實施方式中，在所述PCR混合物中可以使用 至少一對引物。在一對引物中，其中一條引物可以與雙鏈核酸的5'-3'鏈的第一位置結合， 另一條引物可以與雙鏈核酸的3 ' -5 '鏈的第二位置結合，當通過PCR反應延伸這對引物時， 可以擴增獲得包括從第一位置開始到第二位置結束的雙鏈核酸分子的核酸分子，該核酸分 子也叫擴增子。
[0072] 在一些實施方式中，所述引物與發生回復突變的核酸通過堿基互補結合。本申請 中"通過堿基互補結合"是指在所述引物與靶核酸分子之間可以有足夠數量的堿基互補形 成氫鍵，使得該引物能夠與靶核酸分子的靶序列結合并通過PCR反應擴增該靶序列。引物 能夠與靶核酸特異性地通過堿基互補結合，并且能夠自其3'端開始延伸。在某些實施方式 中，引物中至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%或 100%的堿基與靶核 酸通過堿基互補配對。在一些實施方式中，在本申請的方法中引物與病毒核酸的發生回復 突變的區域的至少一部分或其相鄰的區域通過堿基互補結合。本領域技術人員可以根據回 復突變的具體情況設計引物，使其與發生回復突變的核酸通過堿基互補結合。
[0073] 舉例來說，當回復突變涉及將原本被插入的核酸序列部分或全部缺失時，所述引 物可以與原本位于所述被缺失的序列兩側但由于發生缺失而被融合在一起的序列通過堿 基互補結合，該融合序列存在于發生缺失（即回復突變）的病毒核酸中，但在沒有回復突變 的病毒核酸中則不存在。
[0074] 當回復突變涉及在原本被缺失的核酸序列的位置插入其他的核酸，或原本被缺失 的核酸序列部分或全部恢復成缺失以前的核酸序列時，所述引物可以與所述插入序列（或 恢復的序列）或其至少一部分通過堿基互補結合，或者與所述插入序列與其插入點的某一 側或兩側序列融合在一起的融合序列通過堿基互補結合，該插入序列（或恢復的序列）或 其融合序列存在于發生插入（即回復突變）的病毒核酸中，但在沒有回復突變的病毒核酸 中則不存在。
[0075] 當回復突變涉及將原本被取代的核酸序列部分或全部恢復成取代以前的核酸序 列時，所述引物可以與恢復的序列或者該恢復的序列與其某一側或兩側序列融合在一起的 融合序列通過堿基互補結合，該恢復的序列或其融合序列存在于發生取代（即回復突變） 的病毒核酸中，但在沒有回復突變的病毒核酸中則不存在。
[0076] 在一些實施方式中，所述回復突變涉及病毒樣品中的核酸中的缺失被恢復。在某 些實施方式中，被缺失的核酸序列可以部分或全部恢復成缺失以前的核酸序列。在某些實 施方式中，所述回復突變涉及腺病毒的基因（例如Ela、Elb、El、E3、E4、Ll、L2、L3、L4和 L5)中的缺失被全部或部分恢復。對于這樣的回復突變，可以使用與被恢復的核酸序列或其 片段（例如￡1 &3113 313334、11乂2乂3、14和15中被恢復的序列或其片段）通過堿基 互補結合，或者與所述被恢復的核酸序列與其某一側或兩側序列融合在一起的序列通過堿 基互補結合的引物。
[0077] 在一些實施方式中，所述回復突變涉及腺病毒中的如SEQ ID NO: 1所示的序列被 至少部分或全部恢復。在一些實施方式中，所述引物能夠特異性地與具有如SEQ ID NO: 1 所示的序列通過堿基互補結合。在一些實施方式中，所述引物可以具有SEQ ID N0:3或4 所示的序列。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中具有引物對，該引物對包括SEQ ID N0:3和4的組合。
[0078] 在一些實施方式中，所述回復突變涉及腺病毒中的如SEQ ID N0:2所示的序列被 至少部分或全部恢復。在一些實施方式中，所述引物能夠特異性地與具有如SEQ ID N0:2 所示的序列通過堿基互補結合。在一些實施方式中，所述引物可以具有SEQ ID N0:5或6 所示的序列。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中具有引物對，該引物對包括SEQ ID N0:5和6的組合。
[0079] 在某些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的核酸摩爾濃度 (以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計）的比值大于或等 于1/1080、1/360或1/108。在一些實施方式中，所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品 的核酸摩爾濃度（以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計） 的比值在 1/1080-100/108、1/1080-10/108、1/1080-1/108、1/360-100/108、1/360-10/108、 1/360-1/108、1/108-10/108、或 1/108-100/108。
[0080] 在某些實施方式中，所述PCR反應混合物的總體積可以是0. 05-5000 y 1、 5-3500 y l、5-1000 y l、5-500 y l、10-350 y 1 或 10-30y 1。在一些實施方式中，PCR 反應混 合物的總體積為20 y 1。在某些實施方式中，可以通過調整引物和病毒樣品分別占所述PCR 反應混合物的體積來優化PCR反應混合物的配置。
[0081] 核苷酸單體混合物可以是脫氧核苷三磷酸混合物。脫氧核苷三磷酸混合物包括脫 氧核苷三磷酸單體，包括但不限于dATP、dTTP、dGTP和dCTP。
[0082] "核酸聚合酶"在本申請中是指任何具有使用存在的多核苷酸作為模板催化多核 苷酸合成功能的多肽。本領域公知的任何適合DNA合成或復制的聚合酶都可以使用。核酸 聚合酶的例子包括，但不限于，Taq DNA聚合酶（例如，野生型酶、Stoffel片段和FastStart 聚合酶等）、Pfu DNA聚合酶、S-Tbr聚合酶、Tth聚合酶、Vent聚合酶、或其組合。在一些實 施方式中，可以使用一種或多種耐熱的聚合酶來完成PCR，例如Taq DNA聚合酶（例如，野生 型酶、Stoffel片段和FastStart聚合酶等）、Pfu DNA聚合酶、S_Tbr聚合酶、Tth聚合酶、 Vent聚合酶、或其組合。
[0083] 在某些實施方式中，所述PCR混合物中還可進一步包含能夠檢測PCR擴增產物的 檢測分子。在一些實施方式中，所述檢測分子能夠特異性地顯示含有所述突變的核酸的PCR 擴增產物。本領域公知的任何適合的檢測分子都可以使用，例如能夠特異性與PCR擴增區 域結合的核酸探針、或能夠檢測核酸雙鏈的染料分子等。染料分子的例子包括，但不限于， SYBR 1' Green、LC Green、Eva Green、BEB0、B0XT0、BYT09。核酸探針是指帶有可檢測標記 的寡核苷酸分子。可檢測標記可以是熒光分子、同位素標記等。可檢測標記可以與探針的 寡核苷酸分子共價連接，例如，共價連接在寡核苷酸的5'端和/或3'段端。
[0084] 在一些實施方式中，核酸探針可以特異性地結合靶區域，例如病毒核酸中的待擴 增區域。在一些實施方式中，核酸探針具有熒光分子和淬滅分子，在探針完整時，即使熒光 分子被激發，由于熒光分子的附近具有淬滅分子，因此不發出熒光。當核酸探針與病毒核 酸中的待擴增區域結合時，隨著靶序列被擴增，核酸聚合酶由3'-5'方向延伸引物并合成 新生鏈，在核酸聚合酶遇到與模板結合的核酸探針時，核酸聚合酶的5' -3'的外切酶活性 會切斷探針，從而使熒光分子和淬滅分子分離，此時如果熒光分子被激發，則會發出熒光。 隨著擴增循環的增加，被剪切的核酸探針也隨之增加，熒光也會相應地增強，熒光信號與被 剪切的探針的數量基本上成正比（即，與由引物延伸產生的PCR擴增產物的量基本上成正 比）。
[0085] 熒光分子例子可以包括，但不限于，6-羧基熒光素（FAM)、四氯熒光素（TET)、 Alexa、CF、HEX、VIC、R0X、德克薩斯紅（Texas Red)、CY5、Quasar。淬滅分子的例子可以 包括，但不限于，四甲基羅丹明（TAMRA)、小溝結合非焚光淬滅劑（Minor groove binding non-fluorescent quencher (MGBNFQ))、Eclipse、BHQ。在某些實施方式中，所述焚光分子是 FAM、所述淬滅分子是MGBNFQ。在一些實施方式中，所述探針在5'端具有FAM，在3'段具有 MGBNFQ。檢測分子的示例還可以參見美國專利號5, 723, 591和5, 928, 907 ;W02011066476 和 W02012149042;www. idahotech.com ;Gudnason 等人，NucleicAcids Res.，35(19): el27 (2007)，其全文通過引用并入本申請。
[0086] 在一些實施方式中，所述核酸探針中的寡核苷酸分子可以特異性地與PCR擴增產 物的非引物部分的區域結合。所述核酸探針中的寡核苷酸分子可以特異性地與Ela基因或 Elb基因中的序列結合。在一些實施方式中，所述探針具有如SEQ ID N0:7所示的序列。
[0087] 在一些實施方式中，所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于或等于30nM、 100nM或200nM。在一些實施方式中，所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度范圍為 30nM-500nM、100nM-400nM 或 200nM-300nM。
[0088] 將所沭PCR反應混合物分散
[0089] 本申請的方法還包括將所述PCR反應混合物分散成多個微滴。
[0090] "微滴"在本申請中是指PCR反應混合物被分散后形成的具有微小體積的液體。所 述多個微滴中至少有50% (例如至少60%、70%、80% )的微滴的體積，和/或所述多個微 滴的平均體積，可以是例如小于約1微升（或在約1微升與1納升之間或在約1微升與1皮 升之間）、小于約1納升（或在約1納升與約1皮升之間）、或小于約1皮升（或在約1皮 升與1飛升之間）等。微滴可以是球形的或非球形的。微滴可以是單相的（例如水相），或 者是多相的液滴（例如油包水或者水包油的液滴）。
[0091] 在一些實施方式中，將所述PCR反應混合物分散成多個微滴的步驟包括將所述 PCR反應混合物和油相混合以形成含有所述油相和水相的乳液，并將所述乳液分散成多個 微滴。油相是指與水不互溶的液體，水相是指具有親水性的液體（例如水或緩沖溶液）。油 相可以具有高含量的碳，在一些實例中，還可以具有高含量的氫、氟、硅、氧、或其任何組合。 油相可以是一種水不互溶液體，或者兩種或以上水不互溶液體的混合物。例如，所述油相可 以包括至少一種硅油、礦物油、氟烷油、植物油或其組合。在一些實施方式中，所述油相可形 成用于數字PCR的穩定乳液。在一些實施方式中，所述油相是硅油和含氟化合物的混合物。 油相的示例性配方可參見W02010036352A1、W02011066476和US20140170736,其全文通過 引用并入本申請。
[0092] 在某些實施方式中，所述乳液是油包水的乳液，即被連續油相包裹的水相，其中所 述PCR反應混合物存在于水相中。
[0093] 在某些實施方式中，所述乳液中還可以包含至少一種表面活性劑。表面活性劑的 例子包括，但不限于，聚乙二醇、聚丙二醇、Tween20、Krytox?、Pluronic F-68、Tetronics、 Zonyl FSN或其組合。
[0094] 可以使用本領域已知的適合的方法將PCR反應混合物分散成多個微滴。在一些 實施方式中，先將存在于PCR反應混合物與油相混合，之后再形成微滴。在一些實施方式 中，存在于水相中的PCR反應混合物和油相混合與微滴的形成同時發生。在一些實施方 式中，通過機械剪切力完成PCR反應混合物與油相的混合。在一些實施方式中，通過微孔 通道完成PCR反應混合物與油相的混合。在一些實施方式中，使用QX100?微滴發生器 (BI0-RAD)或其后續更新產品形成微滴。形成微滴的示例性方法可以參見US20110092376、 US20110311978、W02011120006、W02011120020、W0 2007091230、W0 2008038259、 W02010018465、W02012061444、W02010036352、Pohl 等人，Expert Rev. Mol. Diagn.，4(1): 41-7 (2004)、Pinheiro 等人，Anal. Chem. 84 (2) : 1003-1011 (2012)、Hindson 等人，Anal. Chem. 83 (22) :8604-10 (2011)、Chen 等人，Celll48 (6) : 1293-1307 (2012)和 Porensky 等 人，Hum. Mol. Genet. 21 (7) : 1625-1638 (2012)，其全文通過引用并入本申請。
[0095] 在一些實施方式中，所述多個液滴可以是，例如1,000-100, 000個、5, 000-50, 000 個或10, 000-30, 000個微滴。
[0096] 對微滴分別講行PCR擴增
[0097] 本申請的方法還包括對所述多個微滴分別進行PCR擴增。在某些實施方式中，所 述多個微滴中的每一個被分隔在單獨的空間里進行PCR擴增。例如，多個微滴中的每一個 可以位于單獨的微孔中，并且在所述微孔中進行PCR擴增。可以使用本領域公知的方法將 多個微滴分隔在單獨的空間。例如，可以將多個微滴分隔在微孔板（例如96孔板、384孔板 等）的單獨的微孔中，集成流體通路（IFC)芯片的單獨的反應板上，或者_你.?.11^1^?平板的 單獨的反應孔中。
[0098] 可以使用交替加熱和冷卻的循環以進行PCR擴增。一個循環的PCR擴增通常包括 在變性溫度下使模板核酸分子解鏈成單鏈、在退火溫度下使引物與單鏈的模板核酸分子通 過堿基互補結合、和在延伸溫度下使核酸聚合酶延伸引物。根據具體的情況不同，退火溫度 和延伸溫度可以相同或不同。
[0099] 檢測在所沭多個微滴中的PCR擴增產物
[0100] 本申請的方法還包括檢測所述多個微滴中的PCR擴增產物。在某些實施方 式中，通過計算含有PCR擴增產物的微滴的數量來確定所述病毒樣品中回復突變的數 量。在某些實施方式中，含有PCR擴增產物的微滴具有可檢測的信號，例如熒光信號。通 過檢測該信號，可確定被檢測的微滴中是否存在PCR擴增產物，和/或PCR擴增產物的 量。可以通過本領域公知的方法檢測微滴中的可檢測信號。例如，可以使用檢測器對每 個微滴進行成像，并將成像結果進行分析。示例的檢測/成像裝置例如W02007091228、 TO2007091230、TO2008038259、W02010036352、Zhang 等人 Nucleic Acids Res.，35(13): 4223-4237 (2007)、Wang 等人，J. Micromech. Microeng.，15 :1369-1377 (2005) ;Jia 等人， 38 :2143-2149 (2005) ;Kim 等人，Biochem. Eng. J.，29 :91-97 ;Chen 等人，Anal. Chem.， 77 :658_666 ;Chen 等人，Analyst，130 :931_940 (2005) ;Munchow 等人，Expert Rev. Mol. Diagn.，5 :613-620(2005) ;Charbert 等人，Anal. Chem.，78 :7722-7728(2006);和 Dorfman 等人，Anal. Chem，77:3700-3704(2005)中所描述的那些，其全文通過引用并入本申請。可 以對流動的或靜態的微滴進行檢測。
[0101] 在一些實施方式中，本申請的檢測方法還包括通過記錄含有PCR擴增產物的微滴 的數量來確定所述病毒樣品中回復突變的數量。在一些實施方式中，根據泊松分布原理或 其它適用的統計學方法對陽性微滴進行計算，從而確定所述病毒樣品中回復突變的量。示 例性的統計學方法可以參見W02010036352,其全文通過引用并入本申請。
[0102] 在一些實施方式中，所述病毒樣品中回復突變的數量為在每3 X 101(]個拷貝的病 毒樣品中大于或等于1個拷貝。在一些實施方式中，病毒樣品中回復突變的數量為在每 3 X 101(]個拷貝的病毒樣品中為0-10, 000個拷貝、0-1，000個拷貝、0-100個拷貝或0-10個 拷貝。
[0103] 試劑盒
[0104] 本申請的另一方面提供了一種用于本申請所述檢測病毒樣品中回復突變的方法 的試劑盒，其包括引物和探針。
[0105] 在一些實施方式中，所述試劑盒包括具有如SEQ ID NOs: 3-6任一所示的核苷酸序 列的引物。在一些實施方式中，所述試劑盒包括具有如SEQ ID NOs: 3-4所示的核苷酸序列 的引物組合。在一些實施方式中，所述試劑盒包括具有如SEQ ID NOs: 5-6所示的核苷酸序 列的引物組合。在一些實施方式中，所述的試劑盒包括連接有第一標記和第二標記的具有 如SEQ ID勵:7所示核苷酸序列的核酸探針。第一標記可以是了411狀、1?^即〇、￡(311口86或 BHQ，第二標記可以是 FAM、TET、Alexa、CF、HEX、VIC、ROX、Texas Red、CY5 或 Quasar。
[0106] 在某些實施方式中，所述試劑盒還可以包含微滴生成油。在某些實施方式中，微滴 生成油可以包括至少一種硅油、礦物油、氟烷油、植物油或其組合。在一些實施方式中，微滴 生成油是硅油和含氟化合物的混合物。微滴生成油的示例性配方可參見W02010036352A1、 W02011066476和US20140170736,其全文通過引用并入本申請。
[0107] 該試劑盒還可包含一種或多種限制酶、內切核酸酶、外切核酸酶、連接酶、聚合酶、 RNA聚合酶、DNA聚合酶、逆轉錄酶、拓撲異構酶、激酶、磷酸酶、緩沖液、鹽、金屬離子、還原 劑、BSA、精胺、亞精胺、甘油、和/或核苷酸單體混合物。該試劑盒還可以包含一套或多套說 明書。
[0108] 本申請的應用
[0109] 由于病毒樣品中具有的回復突變的病毒拷貝數可能只占總的病毒拷貝數的極少 數，在絕對數量上更可能僅有個位數的拷貝，而且具有回復突變與不具有回復突變的病毒 基因差異較小。因此，要準確定量檢測如此痕量的回復突變非常困難，在技術上面臨巨大的 挑戰。
[0110] 現有技術中尚無使用數字PCR檢測重組病毒回復突變的報道，而且基于現有數字 PCR對模板核酸量的上限要求，現有的數字PCR顯然無法根據監管部門的要求檢測重組病 毒回復突變。而本申請的發明人通過對數字PCR的改進，成功檢測出了在高背景下的低拷 貝數（例如1個拷貝）的回復突變。因此，本申請的方法可用于檢測病毒樣品中存在的潛 在的回復突變，特別是能夠應用于回復突變率極低（例如不超過三百億分之一）的病毒樣 品，而這樣的病毒樣品通過現有技術的方法往往不能被準確檢測或者由于回復突變低于檢 測限而被誤檢為假陰性。本申請的方法可以提高重組病毒制品及類似產品用于人體的安全 性，還可用于檢測高核酸濃度和/或高拷貝濃度的病毒樣品，使得原本可能需要分成多個 亞體積分別進行檢測的樣品能夠在一個反應中直接檢測，這大大提高了反應效率和反應準 確性，并且顯著減少了誤差。
[0111] 實施例
[0112] 下文列出實施例的目的是用于幫助對本申請中所述發明的理解，其不會通過任何 方式構成對本申請保護范圍的限制。
[0113] 實施例1常規PCR方法檢測
[0114] 使用的試劑：2XBenchTop Taq MasterMix(SinoBio)、病毒 DNA 抽提試劑盒 (GenerayBio)、鮭魚精DNA(Invitrogen)、pFG140質粒（Admax公司）、Ela基因的檢測引物對 (Pl^' -GGCGGAAGTGTGATGTTGC-3r (SEQ ID NO:3) ；P2 ：5r -AACATCCGCCTAAAACCGC-3r (SEQ ID N0:4))〇
[0115] 使用的主要設備及耗材：普通PCR儀、微量核酸蛋白定量儀（Themofisher)、帶濾 芯的Tip (200 y 1，20 y 1)、0? 2ml凸蓋EP管、Parafilm膜、水平電泳儀（天能）、凝膠成像系 統（天能）。
[0116] 陰、陽件樽板的制備
[0117] 將含有待擴增序列（即：野生型Ad5病毒的Ela基因的463-530堿基，含包裝信號 的5個堿基）的pFG140 (Admax公司）作為陽性模板，不含有待擴增序列的鮭魚精DNA作為 陰性模板。待擴增序列如SEQ ID N0:8所示。
[0118] 堿裂解法抽提PFG140質粒，酚氯仿抽提數次以提高質粒的純度，用無菌水將 PFG140分別稀釋為每y 1含量為1 X 10°到1 X 10 5拷貝的6個濃度梯度，每個梯度配置各 100 y 1的溶液。將100 y 1溶液分裝成10等分，凍于-70度，用時取出一管，用完丟棄。
[0119] 鮭魚精DNA配制成濃度為每y 1含3 X 1〇10拷貝鮭魚精DNA的溶液，配制100 y 1， 同樣分裝成10等分，凍于-7〇度。
[0120] 常規PCR的方法檢測
[0121] 按照表1配置PCR反應體系。以pFG140為陽性模板，濃度分別為lXIO'lXlO1、 1\10 2、1\103、1\104、或1父105拷貝/111，每個濃度做2個重復。
[0122] 以鮭魚精DNA為陰性模板，濃度為3X 1〇10拷貝/ y 1，做2個重復。
[0123] 以無菌水為空白模板，做2個重復。
[0124] 含有空白模板和陰性模板的PCR反應混合物在密閉無陽性模板污染的區域配制， 避免與陽性模板的反應混合物發生交叉污染。
[0125] 表1 :PCR反應的混合物（共20 y 1)
[0126]
[0127] PCR的反應程序為：94°C預變性5分鐘；94°C 10秒，55°C 30秒，共40個循環。
[0128] 檢測
[0129] 使用水平電泳儀對樣品進行檢測。每個泳道的上樣量為1 y 1。檢測結果請參見圖 1，其中1-6泳道為無菌水空白模板的PCR擴增產物，7-8泳道為鮭魚精DNA陰性模板的PCR 擴增產物，9-10泳道為含有1 X 10°個拷貝的pFG140陽性模板的PCR擴增產物，11-12泳道 為含有1 X 101個拷貝的pFG140陽性模板的PCR擴增產物，13-14泳道為含有1 X 10 2個拷 貝的PFG140陽性模板的PCR擴增產物，15-16泳道為含有1 X 103個拷貝的pFG140陽性模 板的PCR擴增產物，17-18泳道為含有1 X 104個拷貝的pFG140陽性模板的PCR擴增產物， 19-20泳道為含有1 X 105個拷貝的pFG140陽性模板的PCR擴增產物。
[0130] 結果與討論
[0131] 如圖1所示，無菌水空白模板（1-6泳道）未見有擴增產物；鮭魚精DNA陰性模板 (7-8泳道）也未有擴增產物，說明防交叉污染效果好，靈敏度檢測結果可靠；pFG140陽性模 板在低于1 X 102個拷貝時（9-12泳道）未檢測到擴增產物，從1 X 10 2個拷貝開始（13-20 泳道）能夠檢測到擴增產物。實驗結果說明，常規PCR對目標核酸的最低檢測限在1 X 102 個拷貝左右，當目標核酸的初始含量低于1 X 102個拷貝時，常規PCR難以準確檢測出其擴 增產物的存在。
[0132] 由此可見，當病毒樣品中發生的回復突變的絕對拷貝數較低時（例如低于1X102 個拷貝），常規PCR難以對其進行準確的檢測。由于美國食品藥品監督管理局要求回復突變 率應低于每3 X 101(]個拷貝的病毒中不超過1個回復突變，如此低的絕對拷貝數是常規PCR 無法準確檢測的。而且，考慮到序列相似的其他3X10 1(]個拷貝的未回復突變的病毒核酸對 該檢測可能造成的潛在的干擾，常規PCR更難以對其進行檢測。
[0133] 實施例2熒光定量PCR方法檢測
[0134] 使用的試劑：標準質粒抽提試劑盒：TIANpr印Midi Plasmid Kit (TIANGEN， DP106);熒光定量 PCR 試劑盒：SYBR Green Realtime PCR Master mix(T0Y0B0，QPK-212)、 pFG140質粒（Admax公司）、Ela基因的檢測引物對SEQ ID N0s:3和4。
[0135] 使用的主要設備及耗材：生物安全工作臺、分光光度計、ABI熒光定量PCR儀（復 旦研發平臺）、96孔板及封板膜。
[0136] 陽件樽板和陰件樽板的制備
[0137] 為模擬對病毒樣品的回復突變的檢測，將含有待擴增序列（即：SEQ ID N0:8) 的PFG140質粒作為陽性模板（即，模擬回復突變的病毒拷貝），將不含有待擴增序列的 pAdEasy-1質粒作為陰性模板（即，模擬不具有回復突變的病毒拷貝）。pFG140質粒含有野 生型Ad5的部分基因組序列，并且含有Ela基因。pAdEasy-1質粒也含有野生型Ad5的部分 基因組序列，但不含有E1 a基因。
[0138] 將pFG140質粒和pAdEasy-1質粒分別轉化E. coli感受態細胞，挑斑接菌12ml， 用TIANpr印Midi Plasmid Kit抽取質粒，取少量質粒用Pme I線性化完全，加入2. 5倍體 積的無水乙醇，混勻，-20°C放置10分鐘，12, OOOrpm離心10分鐘，棄上清，然后用75 %的乙 醇洗沉淀2次，室溫晾干，加適量TE溶解，分光光度計檢測DNA的濃度，并用下面公式計算 dsDNA的單位體積中的拷貝數。
[0139]
[0140] 病毒核酸分子量=喊基對數X660道爾頓。
[0141] 熒光宙量PCR標準曲線的測宙
[0142] 按照表3配置PCR反應體系。
[0143] 為確定熒光定量PCR對目標核酸拷貝數的檢測限，配置以下PCR反應體系：以1、 3、10、100、1 X 103、1 X 104、1 X 105、或1 X 106個拷貝的pFG140質粒用Pmel線性化后得到的 片段作為陽性模板，做2個重復，P1和P2(如下表2)為引物。同時以無菌水作為空白模板 進行對照試驗。按照以下PCR反應程序進行PCR反應，并檢測PCR擴增產物。
[0144] 為確定在回復突變的檢測中，大量的未回復突變的病毒核酸對回復突變檢測的潛 在干擾，配置以下PCR反應體系：在1. 8X 109個pAdEasy-1質粒用Pmel線性化后得到的片 段中按濃度梯度摻入1、3、10、100、1 X 103、1 X 104、1 X 105、或1 X 106個拷貝的pFG140質粒， 每個濃度做2個重復，以P1和P2(如下表2)為引物。同時以無菌水作為空白模板進行對 照試驗。按照以下PCR反應程序進行PCR反應，并檢測PCR擴增產物。
[0145] 表2 :熒光定量PCR的引物
[0147] 表3 :PCR反應的混合物（共20 y 1)
[0149] PCR的反應程序為：95°C預變性60秒；95°C 15秒，45°C 15秒，72°C 45秒，共40個 循環。熔解曲線分析程序為：95°C 15秒；60°C 30秒，95°C 15秒。
[0150] 結果與討論
[0151] 熒光PCR的實驗數據顯示，當只含有空白模板或陰性模板時，檢測不到擴增產物， 也無法計算閾值循環（Ct值）。當陽性模板的含量為1個拷貝時，也檢測不到擴增產物，無 法計算Ct值。當陽性模板的含量為10個拷貝或更多時，不管是否摻入陰性模板，都能夠檢 測并計算Ct值。
[0152] 使用BIO-RAD iQ5軟件及自帶數據處理方法，對檢測到的Ct值進行數據分析，對 只有陽性模板的PCR擴增結果繪制標準曲線，結果請參見圖2A ;另外對摻入了陰性模板的 陽性模板的PCR擴增結果繪制標準曲線，結果請參見圖2B。
[0153] 實驗結果表明，熒光定量PCR對目標核酸的最低檢測限在10個拷貝左右，當目標 核酸的初始含量低于10個拷貝時，熒光定量PCR難以直接檢測出其擴增產物的存在，進而 需要通過標準曲線外推的方式推測目標核酸的初始含量（見圖2A和2B)。由此可見，當病 毒樣品中發生的回復突變的絕對拷貝數較低時（例如低于10個拷貝），熒光定量PCR難以 對其進行準確的檢測。由于美國食品藥品監督管理局要求回復突變率應低于每3X10 1(]個 拷貝的病毒中不超過1個回復突變，如此低的絕對拷貝數用熒光定量PCR也難以準確檢測。
[0154] 此外，在檢測回復突變時，熒光定量PCR還會受到未回復突變的核酸拷貝的干擾。 如圖2A和2B所示，摻入陰性模板后的標準曲線的E值（E = 306. 1 %，請參見圖2B)明顯大 于未摻入陰性模板的標準曲線的E值（E = 257. 3%，請參見圖2A)，而E值大于100%時提 示PCR反應體系中存在PCR的抑制物，E值越大，表明抑制作用越強，這說明摻入陰性模板 后干擾了熒光定量PCR的效率。
[0155] 實施例3數字PCR方法檢測
[0156] 使用的試劑：微滴分析專用油（Droplet reader oil)，含2個1L瓶裝微滴分析 專用油（BI0-RAD，1863004);微滴生成油（Droplet generation oil)，含 10 個 7mL 瓶裝微 滴生成油（BI0-RAD，1863005);探針用2X ddPCR supermix，含5個lmL管裝PCR預混液 (BI0-RAD，1863005) ;QIAfilter Plasmid Maxi Kits (QIAGEN，12262)、pFG140 質粒（Admax 公司）；Elb的檢測引物對（SEQ ID N0s:5-6) ;Elb的檢測探針SEQ ID N0:7。
[0157] 使用的主要設備及耗材：QX100?微滴式數字PCR系統（QX100 ?微滴發生器， QX100?微滴分析儀，BI0-RAD);生物安全工作臺；分光光度計；ddPCR用DG8微滴發生卡， 含一包24個微滴發生卡（BI0-RAD，1863008) ;ddPCR用DG8密封墊，含一包24個密封墊 (BI0-RAD，1863009) ;96 孔半裙邊板（Twin Tec Semi-Skirted96Plate)，25 板（Eppendorf， 30128605) ;PCR 板易穿孔熱封鋁膜（Easy Pierce Foil PCR Plate Seals, Thermo)，100 片 (Thermo Fisher, AB-0757) ；Pipet RT-L200F(Mettler Toledo, RT-L200F)〇
[0158] 陽件樽板和陰件樽板的制備
[0159] 為模擬對病毒樣品的回復突變的檢測，將含有待擴增序列（即：野生型Ad5病毒的 Elb基因的1712-1811堿基）的pFG140質粒作為陽性模板，含有野生型Ad5的部分基因組 序列但不含有Elb基因的質粒（在本實施例中稱為陰性質粒）作為陰性模板。待擴增序列 如 SEQ ID N0:9 所示。
[0160] 將pFG140質粒和陰性質粒轉化E. coli感受態細胞，挑斑接菌200ml，用QIAfilter Plasmid Maxi Kits抽提質粒，取少量質粒用Pme I線性化完全，加入2. 5倍體積的無水乙 醇，混勻，-20°(：放置101^11，12000印111離心101^11，棄上清，然后用75%的乙醇洗沉淀2次， 室溫晾干，加適量TE溶解，分光光度計檢測DNA的濃度，并用下面公式計算dsDNA的單位體 積中的拷貝數。
[0161]
[0162] 病毒核酸分子量=喊基對數X660道爾頓。
[0163] 微滴式數字PCR的測宙
[0164] 按照表5配置PCR反應體系。
[0165] 為確定微滴式數字PCR對目標核酸拷貝數的檢測限，配置以下PCR反應體系：以 1、10、100、1000個拷貝的口?6140質粒線性化片段為模板，？3和？4(如下表4)為引物。同 時以無菌水作為空白模板進行對照試驗。按照以下PCR反應程序進行PCR反應，并檢測PCR 擴增產物。
[0166] 為確定在回復突變的檢測中，大量的未回復突變的病毒核酸對回復突變檢測是否 存在潛在干擾，配置以下PCR反應體系：在1.8X10 9個陰性質粒線性化片段中按濃度梯度 摻入1、10、100、1000個拷貝的PFG140線性化片段DNA為模板，以P3和P4(如下表4)為引 物。同時以無菌水作為空白模板進行對照試驗。按照以下PCR反應程序進行PCR反應，并 檢測PCR擴增產物。
[0167] 表4 :微滴式數字PCR的引物與探針
[0169] 表5 :PCR反應的混合物（共20 y 1)
[0170]
[0171] PCR的反應程序為：95°C預變性10分鐘；95°C 30秒，60°C 1分鐘，共40個循環； 98 °C 10 分鐘。
[0172] 結果與討論
[0173] 表6 :數字PCR檢測結果
[0174]

[0176] 微滴式數字PCR的實驗結果如表6所示。使用Excel軟件以表6的數據進行作圖， 以陽性模板的理論拷貝數為橫坐標，實際檢測到的陽性微滴數為縱坐標。只有陽性模板的 PCR擴增結果請參見圖3A，摻入了陰性模板的陽性模板的PCR擴增結果請參見圖3B。
[0177] 由表6、圖3A和3B所示，微滴式數字PCR對目標核酸的最低檢測限甚至可以達到 1個拷貝。由此可見，即使當病毒樣品中發生的回復突變的絕對拷貝數極低時（例如個位數 的拷貝），微滴式數字PCR也能夠對其進行準確的檢測。
[0178] 此外，實驗數據還表明，微滴式數字PCR在檢測回復突變時不會受到未回復突變 的核酸拷貝的干擾。如圖3A和3B所示，摻入陰性模板后，陽性模板的理論值與實測值仍然 保持了良好的線性相關性，其R 2值和斜率（R2= 〇. 999,斜率=0. 969,請參見圖3B)與未摻 入陰性模板的曲線的R2值和斜率（R2= 〇. 999,斜率=0. 959請參見圖3A)保持高度一致， 這表明陰性模板的摻入并未影響數字PCR檢測的準確性。即使在摻有1. 8X 109個拷貝的陰 性模板的情況下，微滴式數字PCR仍能夠準確檢測出低至1個拷貝的陽性模板。因此，微滴 式數字PCR的檢測方法有潛力能夠滿足美國食品藥品監督管理局對檢測回復突變的要求， 即準確檢測出每3X10 1(]拷貝中不多于1個拷貝的回復突變。
[0179] 考慮到病毒核酸中發生回復突變的絕對數量通常比較低，這就要求檢測方法的檢 測限足夠低，而且在接近檢測限時仍然能夠準確地檢測。而且由于發生回復突變的核酸摻 雜在大量的且極其相似的未回復突變的病毒核酸中，就如同在數以百萬計的幾乎完全相同 的分子中要準確找出具有細微差異的那一個或幾個目標分子，這就要求檢測方法能夠排除 未回復突變的核酸的巨大干擾，準確地找到其中混雜的極少數的目標分子。本申請的發明 人發現，常規PCR和熒光定量PCR在檢測回復突變的方面都具有明顯的缺陷，難以提供準 確的檢測結果，而本申請的數字PCR卻能夠在檢測限和排除干擾這兩方面都提供巨大的優 勢，從而為回復突變的準確檢測提供可靠的技術保障。
[0180] 實施例4數字PCR的條件優化
[0181] 本實施例中的微滴式數字PCR的實驗方法同實施例3。簡單地說，為模擬對病毒 樣品的回復突變的檢測，將含有待擴增序列（即：SEQ ID N0:9)的pFG140質粒作為陽性模 板，含有野生型Ad5的部分基因組序列但不含有Elb基因的質粒（在本實施例中稱為陰性 質粒）作為陰性模板。單個引物在PCR反應混合物中的終濃度為900nM。
[0182] 探針濃度的優化
[0183] 發明人首先對探針濃度進行了優化。微滴式數字PCR的實驗方法同實施例3，區別 僅在于PCR反應混合物的組分濃度進行了調整。在本實驗中，在1.8X10 9個陰性質粒線性 化片段中按濃度梯度摻入1、10、100、1000個拷貝的PFG140線性化片段DNA為模板。
[0184] 按照以下的配方，配置得到探針終濃度為25nM或探針終濃度為250nM的PCR反應 混合物。
[0185] 含25nM終濃度探針的反應混合物1 :
[0186] 無菌水 4.35 2 x super Mix 10 引物P3 1,8 (終濃度為900 nM) 引物P4 1,8 (終濃度為900 nM) 探針 0.05 (終濃度為25nM) 模板_2_ 20 (.d
[0187] 含250nM終濃度探針的反應混合物2 :
[0188] 無菌水 3.9 2xsupcr Mix 10 引物P3 1.8 (終濃度為900 nM) 引物P4 1.8 (終濃度為900 nM) 探針 0.5 (終濃度為250nM) 模板_2 20 (^1
[0189] 將上述反應混合物1和2分別進行微滴式數字PCR反應，得到的結果請分別參 見圖4A(探針濃度25nM)和圖4B(探針濃度250nM)。如圖4A所示，陽性信號幾乎都在 1000-2000之間，距離264的閾值線較近；而提高探針濃度后，如圖4B所示，陽性信號普遍 提高，達到8000以上甚至到12000,遠遠超過1336的閾值線。這表明，探針濃度的提高顯著 提高了陽性信號的強度，使得原本可能由于探針不足而未能檢測到的陽性微滴被準確地檢 測，從而大大提高了檢測的準確性。
[0190] 樽板量
[0191] 發明人對模板量也進行了優化。根據微滴式數字PCR的儀器廠家Bio-rad的要求， 在20 y 1的PCR反應混合物中，每y 1最多可加3. 3ng模板，也就是說一個20 y 1的反應混 合物最多可加66ng模板，按照這個要求，每個20 y 1的反應混合物最多只能檢測1. 8 X 109 個拷貝的腺病毒模板。FDA的要求是在3X 101(]個拷貝的病毒分子中不能超過1個回復突 變。如果按照廠家的要求，則需要將3 X 101(]個拷貝的病毒樣品分成17份，每份進行單獨的 反應，并將17個反應的結果加在一起才能得出最終的結果。但是，這樣操作會大大增加工 作量，而且分割的反應個數越多則會導致誤差越大，影響檢測結果的準確性。
[0192] 本申請在20 y 1反應混合物中加入5. 67 y g的陰性模板（相當于1. 57X 1011個拷 貝腺病毒DNA分子），在這個反應混合物中摻入5個拷貝的陽性模板（這也符合FDA的要 求），并進行微滴式數字PCR檢測。為了能夠加入如此大量的模板，本申請調整了 PCR反應 混合物的配比，還同時提高了探針的濃度。該反應混合物稱為反應混合物4,具體配置如下 所示。
[0193] 反應混合物4:
[0194] 無菌水 0 2'super Mix 10 引物P3 0.18 (終濃度為900 nM) 引物P4 0.18 (終濃度為900 nM) 探針 0:,5 (終濃度為250nM) 模板_9,14 20 p.l
[0195] 將實施例3中的模板量為1. 8 X 109個拷貝的反應混合物（在此稱為反應混合物 3)的實驗結果作為對比。反應混合物4的實驗方法和程序與實施例3相同，區別僅在于反 應混合物的組分不同。在反應混合物3和4中，探針終濃度都為250nM，但反應混合物3中 的模板量為1. 8X 109個拷貝，反應混合物4中的模板量為1. 57X 10 11個拷貝。
[0196] 實驗結果：
[0197] 常規模板量（即1. 8 X 109個拷貝）的反應混合物3的實驗結果請參見實施例3中 的表6。高模板量（即1. 57 X 1011個拷貝）的反應混合物4的實驗結果參見表7。
[0198] 表7 :反應混合物4的數字PCR檢測結果
[0199]
[0201] ，樣品是指每個20 y 1的PCR反應體系中所含的模板。
[0202] 結果表明，在本申請的優化條件下，微滴式數字PCR能夠在遠超出廠家要求的上 限的樣品拷貝數中，準確檢測出不同濃度的目標分子，其檢測結果與在廠家推薦的常規模 板量時的檢測結果相當。
[0203] 圖5A表示常規模板量（即1.8X109個拷貝）的反應混合物3的數字PCR結果圖， 圖5B表示高模板量（即1. 57X 1011個拷貝）的反應混合物4的數字PCR結果圖。從圖中 可以看出，數字PCR對兩者均可以檢驗出信號，而且兩者的信號強度相似，都在8000左右甚 至達到12000,遠遠超過閾值線。
[0204] 本實驗的結果表明，在本申請的優化的微滴式數字PCR的條件下，可以在一個反 應中直接對高拷貝的病毒樣品進行回復突變的檢測，而無需將病毒樣品分成多個單獨的反 應。本申請的方法大大簡化了實驗操作，在節省人力物力的同時還避免了不必要的誤差，大 大提高了檢測的準確度。
[0205] 盡管本申請已公開了所述發明的多個方面和實施方式，但是其它方面和實施方式 對本領域技術人員而言將是顯而易見的。本申請公開的多個方面和實施方式僅用于舉例說 明，其并非旨在限制本申請的實際保護范圍。
【主權項】
1. 一種檢測病毒樣品中回復突變的方法，其包括： 獲得所述病毒樣品中的核酸； 獲得PCR反應混合物，所述PCR反應混合物包含所述核酸、引物、核苷酸單體混合物和 核酸聚合酶，其中所述引物能夠特異性地與發生回復突變的核酸通過堿基互補結合； 將所述PCR反應混合物分散成多個微滴； 對所述多個微滴分別進行PCR擴增；及 檢測在所述多個微滴中的PCR擴增產物。2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述將所述PCR反應混合物分散成多個微滴的步 驟包括將所述PCR反應混合物和油相混合以形成含有油相和水相的乳液，并將所述乳液分 散成多個微滴。3. 根據權利要求1-2中任一項所述的方法，所述病毒樣品含有具有突變的病毒，且所 述回復突變涉及在所述具有突變的病毒的基因組中原本缺失的核酸被至少部分或全部恢 復。4. 根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中所述病毒樣品含有具有突變的腺病 毒。5. 根據權利要求4所述的方法，其中所述具有突變的腺病毒是溶瘤性腺病毒。6. 根據權利要求4-5任一所述的方法，所述具有突變的腺病毒在Ela基因和/或Elb 基因缺失了至少部分的核酸。7. 根據權利要求6所述的方法，所述具有突變的腺病毒與Ad5相比，缺失對應于Ad5的 Ela基因的SEQ ID NO: 1所示區域的全長或者其片段。8. 根據權利要求6所述的方法，所述具有突變的腺病毒與Ad5相比，缺失對應于Ad5的 Elb基因的SEQ ID N0:2所示區域的全長或者其片段。9. 根據權利要求7所述的方法，所述回復突變涉及在所述具有突變的病毒的基因組中 原本缺失的SEQ ID NO: 1的全長或者其片段被至少部分或全部恢復。10. 根據權利要求8所述的方法，所述回復突變涉及在所述具有突變的病毒的基因組 中原本缺失的SEQ ID NO:2的全長或者其片段被至少部分或全部恢復。11. 根據權利要求3-5中任一項所述的方法，其中所述引物能夠特異性結合于被部分 或全部恢復的所述缺失的核酸。12. 根據權利要求11所述的方法，其中所述引物能夠特異性結合于具有如序列SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO:2所示的序列。13. 根據權利要求12所述的方法，其中所述引物具有序列SEQ ID NOs :3-6任一所述的 序列。14. 根據權利要求1-13中任一項所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的病毒 核酸拷貝數大于或等于1X 10'15. 根據權利要求14所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的 核酸拷貝數大于或等于3X 10'16. 根據權利要求15所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的 核酸拷貝數大于或等于IX 1011。17. 根據權利要求1-16中任一項所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述 病毒樣品的核酸濃度大于或等于l〇ng/μ 1。18. 根據權利要求17所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的 核酸濃度大于或等于l〇〇ng/ μ 1。19. 根據權利要求18所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的 核酸濃度大于或等于200ng/ μ 1。20. 根據權利要求1-19中任一項所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述 病毒樣品的核酸摩爾濃度（以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以 nM計）的比值大于或等于1/1080。21. 根據權利要求20所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的 核酸摩爾濃度（以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計）的 比值大于或等于1/360。22. 根據權利要求21所述的方法，其中所述PCR反應混合物中含有的所述病毒樣品的 核酸摩爾濃度（以nM計）與所述PCR反應混合物中含有的所述引物的濃度（以nM計）的 比值大于或等于1/108。23. 根據權利要求1-22中任一項所述的方法，其中所述反應混合物進一步含有探針， 所述探針能夠特異性地顯示含有所述突變的核酸的PCR擴增。24. 根據權利要求23所述的方法，其中所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于 或等于30nM。25. 根據權利要求24所述的方法，其中所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于 或等于ΙΟΟηΜ。26. 根據權利要求25所述的方法，其中所述探針在所述PCR反應混合物中的濃度大于 或等于200nM。27. 根據權利要求23-26中任一項所述的方法，其中所述探針具有序列SEQ ID NO:7。28. 根據權利要求27所述的方法，其中所述探針在5'端具有FAM，在3'段具有MGBNFQ。29. 根據權利要求1-28中任一項所述的方法，其還包括通過計算含有PCR擴增產物的 微滴的數量來確定所述病毒樣品中回復突變的數量。30. 根據權利要求1-29中任一項所述的方法，其中所述病毒樣品中回復突變的數量為 在每3X 101°個拷貝的病毒樣品中大于或等于1個拷貝。31. 根據權利要求30所述的方法，其中病毒樣品中回復突變的數量為在每3 X 10 個 拷貝的病毒樣品中為0-10000個拷貝、0-1000個拷貝、0-100個拷貝或0-10個拷貝。32. -種用于權利要求1-31所述方法的試劑盒，其包括引物和探針。33. 根據權利要求32所述的試劑盒，其中所述引物具有SEQ ID NOs:3-6任一所述的核 苷酸序列，或SEQ ID N0s:3-4的組合，或SEQ ID N0s:5-6的組合。34. 根據權利要求32所述的試劑盒，其中所述探針具有核苷酸序列SEQ ID NO:7。
【文檔編號】C12R1/93GK106032551SQ201510115042
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發明人】梁旻, 劉波
【申請人】東源生物醫藥科技（上海）有限公司