一種真菌種屬pcr鑒定方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物物種鑒定，具體涉及真菌種屬。
【背景技術】
[0002] 真菌的分類鑒定過去一般采用的是形態學方法，主要按照真菌的形態特征、生長 特征、生理生化特點、抗原構造等特征加以區分，尤其是以有性態的形態特征為主要依據。 目前世界上使用最廣泛的真菌分類系統是Ainsworth分類系統，它按真菌孢子的類型和有 性態的有無，把真菌分為鞭毛菌、接合菌、子囊菌、擔子菌和半知菌5個亞門。但真菌的種類 多，形態和解剖結構復雜多變，少數形態特征和生理生化指標隨著環境的變化而不穩定，且 要獲得其有性或無性器官需很長時間(某些真菌如半知菌亞門甚至不能形成有性態），常會 得出假陽性或假陰性結果，因此鑒定結果不是很準確。近年來，隨著分子生物學的發展，其 在真菌分類學中發揮了越來越大的作用，其中rDNA(核糖體DNA)序列分析被廣泛使用。
[0003] 真核生物的核糖體是80S型，包含大亞基60S與小亞基40S。大亞基60S是由25-28S rRNA、5.8S rRNA和5S rRNA及核糖體蛋白構成;小亞基40S則由18S rRNA與相關核糖蛋白構 成。真核生物細胞中的25-28S rRNA、5.8S rRNA和18S rRNA基因串聯構成一個轉錄本，初 始轉錄的產物為35S-45S rRNA前體，35S-45S rDNA與5S rDNA串聯形成一個重復單位， 150-200個重復單位構成了 rDNA簇。5.8S、25S和18S之間的內轉錄基因間隔序列為基因內 部轉錄間隔序列（ITS)。
[0004] rDNA用以進行物種分類鑒定原理，主要是基于其獨特的保守性和適當的進化速 率，使得不同物種間產生相應的堿基差異，這些堿基差異可以通過相應的技術方法來分析， 從而進行菌株的分類鑒定。序列分析、限制性片段長度多態性RFLP、單鏈構象多態性SSCP和 末端限制性片段長度多態性T-RFLP等
[0005] 為主要的技術方法，并且有日益完善的Internet數據庫和序列分析軟件作為支 持。
[0006] 研究表明26S rRNA可應用于系統發育分析和菌種鑒定。在大亞基的多態性研究 中，其序列可為12個區域，其中D1和D2兩個區域主要用于系統發育研究和菌種鑒定。26S rDNA的D1/D2區域位于大亞基的5'端，序列長度在600bp左右。種內序列變異< 1%，而種間 序列差異 >1%。擴增常用通用引物為NL1: 5 ' -GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ' 和NL4: 5 ' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 '，擴增出的序列結合序列分析、限制性片段多態性RFLP或單鏈構 象多態性分析，對待測菌株進行分析。
[0007] 內轉錄間隔區ITS與5.8S rDNA(internal transcribed spacer, ITS)是rDNA上的 一個非編碼區域，由位于18SrDNA和5.8S rDNA之間的ITS1區及5.8S rDNA和28S rDNA之間 的ITS2區構成，長度約為500bp。該區域受外界環境因素的影響較小，與編碼區域相比具有 進化速度快的特點，在種內的不同菌株之間高度保守，而在真菌種間存在極大的變化，表現 出極大的序列多態性，可以為真菌學的研究提供豐富的遺傳信息。研究時，通常采用ITS序 列的通用引物ITS1 (5 ' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3 '）和ITS4(5 ' -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3'），擴增出包括ITS1、5.8S和ITS2的全長ITS區域序列，長度400~870bp，然后結合DNA序列 測定分析和RFLP分析，對物種進行分類鑒定。由于ITS區不加入成熟核糖體，所以受到的選 擇壓力較小，進化快，在絕大多數的真核生物中表現出很高的序列多態性，Renske等認為， 真菌通過ITS區域比對，序列相似性大于99%，鑒別為同種。ITS序列間的趨異已經用于真菌 中很多屬的系統發育研究，已證明該序列在研究屬內和關系較近的屬間關系時是十分有價 值的，尤其在近似種的區別中。
[0008] 雖然種內26S D1/D2區堿基差異小于1%的標準已被普遍接受，然而此數值仍是一 個試驗的經驗值。但真菌的種類非常復雜，不同種真菌的基因組的進化速率各不相同，跨物 種的基因交流(重組、染色體重排、水平轉移、基因滲透)可能會造成核糖體基因簇的某一區 段適用于大多數的物種鑒定，卻不能將親緣關系較近的物種加以區分的現象，或者依賴于 單一標記的分類結果可能無法正確反映該菌株的真實分類地位。有時具有相同D1/D2區序 列的菌株，雜交遺傳學和標準特征卻表明它們不屬于同一個種。
[0009] 同時由于不同真菌的內轉錄間隔區ITS與5.8S rDNA序列存在差異，使用ITS序列 的通用引物ITS1和ITS4有時無法擴增到ITS1、5.8S和ITS2的全長ITS區域序列，無法用于菌 種鑒定。

【發明內容】

[0010] 本發明的目的在于，提供一種真菌種屬PCR鑒定方法，解決以上技術問題。
[0011] 本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現：
[0012] -種真菌種屬PCR鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0013] 步驟一，菌株的培養與收集；
[0014] 步驟二，DNA提取；
[0015] 步驟三，DNA樣品的檢測；
[0016] 步驟四，PCR擴增；
[0017] 步驟五，測序；
[0018] 步驟六，序列分析。
[0019] 本發明通過步驟一~步驟六實現了對真菌種屬的鑒定。
[0020] 所述步驟一中，作為一種方案，所述菌株在一土豆培養基中進行培養，培養環境在 25°C~30°C，光照12h，黑暗12h，培養2~5天后，所述菌株的菌絲長滿所述土豆培養基的表 面，直接從所述土豆培養基表面刮取所述菌絲作為樣品；
[0021] 所述土豆培養基是一固體培養基。
[0022] 本發明通過在固體培養基上培養菌種能夠便于觀察菌落和便于分離菌絲。
[0023]所述步驟一中，作為一種方案，所述菌株在一土豆培養基中進行培養，培養環境在 25°C~30°C，光照12h，黑暗12h，培養2~5天后，所述菌株的菌絲長滿所述土豆培養基的表 面；
[0024]將菌絲置于一液體土豆培養基中，保持所述液體土豆培養基內的環境在25°C~30 °C，將所述液體土豆培養基以180r/min的速度進行高速離心5~10天，再收集菌絲作為樣 品。
[0025]本發明通過液體培養基高速離心能夠使菌絲內的活性增強，擴大培養，增加溶解 氧含量。
[0026] 步驟2-1，將所述樣品溶解在錐形瓶中形成菌液，抽取lml~2ml菌液于一第一離心 管中，將所述第一離心管以12000r/min離心3min~5min。
[0027] 步驟2-2，在所述第一離心管中加入500yL十六烷基三甲基溴化銨，將所述第一離 心管放入液氮中迅速制冷30s~40s，在將所述第一離心管迅速放入60°C~70°C溫水中30s ~40s，重復步驟2-2三~五次。
[0028] 本發明通過十六烷基三甲基溴化銨能夠對第一離心管內的核酸進行沉淀，便于收 集 DNA。
[0029] 步驟2-3,在所述第一離心管中再加入所述第一離心管體積1/3的玻璃珠，將所述 第一離心管放置在一漩渦振蕩器進行高速震蕩3min~8min。
[0030] 本發明通過玻璃珠能夠更好的將細胞壓碎，便于收集DNA。
[0031]步驟2-4在所述第一離心管中再加入蛋白酶K，將所述第一離心管在60°C~65°C的 水中保溫30min并且每隔lOmin搖勻1次。
[0032]本發明通過蛋白酶K能對第一離心管內的蛋白質進行降解。
[0033] 步驟2-5在所述第一離心管中加入體積比在20~30: 20~25 :0.5~1之間的酚、氯 仿和異戊醇。
[0034]本發明通過酚、氯仿和異戊醇能夠抽取DNA，苯酚的作用是使蛋白質變性，氯仿的 作用是克服酚的缺點；加速有機相與液相分層.最后用氯仿抽提:去除核酸溶液中的跡量 酚.（酚易溶于氯仿中）。本發明通過這三者的結合能夠使提取DNA的方法變得簡單方便。 [0035]作為一種優選方案，步驟2-5在所述第一離心管中加入體積比25:24:1的酚、氯仿 和異戊醇。
[0036]步驟2-6將所述第一離心管中的上清液移入到第二離心管中，在所述第二離心管 中加入體積比24:1的