肺炎衣原體熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種采用實時熒光PCR方法特異性檢測樣品中肺炎衣原體核酸的試劑 盒，屬于肺炎衣原體的體外診斷領域。
【背景技術】
[0002] 肺炎衣原體(chlamydia pneumoniae)是衣原體屬中的一個新種，只有一個血清 型，98kDa蛋白為其特異性抗原，代表株是TWAR，是80年代發現的一種新的能引起人類急性 呼吸道感染的病原體，比如青少年及成人的非典型肺炎，以及支氣管炎、咽炎及扁桃體炎 等，并且與動脈粥樣硬化、冠心病、心肌梗塞等疾病有密切關系。肺炎衣原體已是繼肺炎鏈 球菌和流感嗜血桿菌之后引起社區獲得性肺炎的主要病原體，其傳播源是患病者或無癥狀 攜帶者的呼吸道分泌物和飛沫，與嗜肺軍團菌和肺炎支原體一起成為社區獲得性肺炎的三 種非典型病原體。人感染肺炎衣原體一年四季均可發生，不存在季節性差異，其流行傳播可 呈散發性或者爆發性，尤其是在空間較封閉、人群聚集較多、空氣不太流通的公共場所。在 檢測中，PCR法由于其快速簡便的特點逐漸呈現出要替代以細菌培養和血清學檢測為主的 傳統檢測方法的趨勢。而對于PCR方法來說，引物的特異性是其檢測的特異性和敏感性的基 礎。
[0003] 本發明針對肺炎衣原體基因序列的保守區域特異的靶序列設計引物和Taqman探 針，利用real-time PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在肺炎衣原體的核酸。

【發明內容】

[0004] 本發明主要解決的技術問題是快速準確地檢測樣品中是否存在肺炎衣原體，提供 一種特異性檢測肺炎衣原體的熒光PCR試劑盒。
[0005] 本發明所要解決的技術問題是通過以下技術方案來實現的： 一種特異性檢測樣品中肺炎衣原體核酸的試劑盒，其組分包括PCR反應液、酶混合液、 陰性質控品和陽性質控品，其中PCR反應液主要含有相關的引物和探針、反應緩沖液、Mg2+和 dNTP等，酶混合液主要含有熱啟動Taq酶，陰性質控品為無 RNase和DNase水，陽性質控品為 含有肺炎衣原體檢測靶序列的重組質粒。
[0006] 其中PCR反應液中用于核酸擴增的引物為P1和P2，P1和P2為針對肺炎衣原體基因 組群特異性保守序列設計并經預實驗篩選出的特異性引物;PCR反應液中用于熒光信號監 測的寡核苷酸探針為ProbeUProbel為針對肺炎衣原體基因組群特異性保守序列設計并經 預實驗篩選出的特異性探針，其中熒光報告基團Χι為FAM，熒光淬滅基團YiSEclipse(見表 1) 〇
[0007] 表1檢測肺炎衣原體的引物和探針序列_

' 本發明的另一個目的是提供本熒光PCR檢測試劑盒在檢測肺炎衣原體的應用方法，包胃 括： 試劑盒選用的PCR反應體系為20 μL，包括2XPCR緩沖液10 yUlOmmol/L dNTP 1.0 μ ?、25μπιο1/1 引物各0.5 yUlOymol/L 探針0.2 yL、熱啟動Taq酶混合液0.4 yL、樣品DNA 2 yL，加滅菌水至終體系20 yL。
[0008] 試劑盒的PCR反應循環參數為94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s，56°C退火 50s，72°C延伸15s，共反應40個循環。
[0009] 質量控制:每次實驗應設立陰、陽性對照，陰性對照無 Ct值(或Ct值為0)，陽性對照 Ct值< 30，否則實驗結果不成立。
[0010] 結果判讀： 陽性：出現"S"型擴增曲線，Ct值< 35;可疑：出現"S"型擴增曲線，但Ct值> 35;陰性:沒 有出現"S"型擴增曲線，或者曲線雖然超過了閾值，但不呈"S"型;對可疑結果，應重復實驗， 如果重復實驗還是出現"S"型擴增曲線，陰性對照沒有污染，可判斷為陽性。
[0011] 樣本要求:臨床樣本類型包括咽拭子;臨床樣本采集后應帶冰運輸，_20°C保存，不 能反復凍融;從臨床樣本提取DNA，建議采用性能穩定可靠的商品化試劑盒，具體方法參見 相應商品化試劑盒說明書，提取的DNA應立即檢測，否則，應將DNA分裝后-80°C~_20°C保 存。
[0012] 本發明提供的試劑盒具有很好的特異性，可以檢出肺炎衣原體，但不能檢出非肺 炎衣原體的核酸;對肺炎衣原體核酸的檢測下限為10拷貝每反應體系；只需要2小時即可完 成檢測，可為肺炎衣原體的疾病監測和臨床診斷提供實驗依據。
【附圖說明】
[0013] 圖1為單重實時熒光PCR檢測肺炎衣原體陽性標準品的擴增曲線圖。從左至右的每 組曲線對應濃度依次為2 X 106-2 X 102copiesAiL，試劑盒對肺炎衣原體的檢測限均為10拷 貝每反應體系。橫坐標為反應循環數，縱坐標為不同循環數熒光檢測信號的ARn值。
[0014] 圖2為單重實時熒光PCR檢測體系檢測10種細菌基因組DNA的擴增曲線圖。10種細 菌包括:肺炎衣原體和9種陰性對照微生物。肺炎衣原體出現S型擴增曲線，而其他9種病原 微生物未出現S型擴增曲線。
【具體實施方式】
[0015] 下面結合具體實施例詳細說明本發明的優選實施方式。需要指出的是，這里列出 的實施例僅僅為示例性說明的目的，而不應將其解釋為對本發明范圍的任何限制。其中使 用的試劑盒、緩沖液等試劑僅僅為該具體實施例中具體選擇的試劑，應理解，本領域技術人 員可根據需要選擇其他公司的相應試劑以實現本發明的目的。
[0016] 引物和TaqMan探針的設計與合成 利用Blast工具對Genbank和國內外文獻中的肺炎衣原體基因組序列進行分析，分別選 擇其穩定的保守區域作為檢測靶序列。肺炎衣原體檢測靶序列來源于主要的外膜蛋白基 因；并針對檢測靶序列設計和合成引物和探針(見表1)。引物和探針均由日本TaKaRa大連寶 生物公司合成，肺炎衣原體的檢測探針5 '端標記FAM焚光基團；3 '端標記Eel ipse焚光淬滅 基團。
[0017] 檢測菌種的準備 本實施例中所使用的肺炎衣原體以及其他陰性對照菌株(潰瘍棒狀桿菌，假白喉棒狀 桿菌，溶血棒狀桿菌，金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌，大腸桿菌，微小棒狀桿菌，白喉棒狀桿 菌，炭疽芽孢桿菌)均購買于中國藥品生物制品檢定所。
[0018] 菌株DNA的抽提 選用Qiagen公司QIAamp DNA Mini Kit(貨號：51306)提取菌株DNA。具體步驟試劑盒參 考操作說明書。
[0019] 引物和探針的篩選 采用設計的引物和探針檢測提取的肺炎衣原體和陰性對照菌株的基因組DNA，經反復 實驗，篩選出靈敏度、特異性和重復性最佳的引物探針組合。（見序列表，肺炎衣原體(正向 弓丨物P1、反向引物P2和探針Probe 1)。
[0020] 標準品的構建與制備 利用P1和P2引物擴增肺炎衣原體基因組DNA，將PCR產物克隆至PMD-18T載體，轉化DH5a 大腸桿菌，利用堿裂解法提取陽性克隆質粒，利用紫外可見分光光度計分別測定在波長 260nm處、280nm處DNA的吸光率，然后計算質粒濃度與純度。然后10倍梯度稀釋至200拷貝每 微升，制備肺炎衣原體的陽性標準品。
[0021] 反應條件優化 對引物、探針、酶等要素逐一優化，確定的反應體系為:2 X PCR緩沖液10 nL、1 Ommo 1 /L dNTP 1.0yL、25ymol/L引物各0.5 yL、10ymol/L 探針0.2 yL、Takara聚合酶混合物0.4 yL、 模板2 uL，加滅菌水至終體系20 yL。
[0022] 根據擴增片段長短、引物和探針的退火溫度以及酶的特性，主要對反應的退火溫 度和延伸時間進行了優化，最終確定循環參數為:94°C，2min;進入循環階段:94°C變性10s， 56°C退火50s，72°C延伸15s，40個循環，每個循環在退火階段采集熒光信號。
[0023]在擴增結束后按同一條件分析數據，確定各樣品的Ct值。
[0024]檢測限的評價 以上述的陽性標準品評價本發明提供的試劑盒的檢測限，陽性標準品濃度為：2X lC^copies/yL、〗X lC^copies/yL、〗X 104copies/yL、2 X lC^copies/yL、〗X 102copies/yL，本 發明提供的試劑盒對肺炎衣原體核酸的檢測下限為10拷貝每反應體系。
[0025] 檢測特異性的評價 以上述菌株DNA為模板評價了本試劑盒的特異性。對肺炎衣原體DNA進行檢測時均可見 明確擴增曲線，對上述9種其他咽部常見病原微生物DNA檢測時，未產生陽性擴增曲線，說明 我們使用的探針和引物與我們選定的其他菌株之間不存在交叉反應。
[0026] 盡管上文中以優選的方式，通過具體實施例示例性說明了本發明的某些實施方 式，但是本領域技術人員應了解，本發明并不限于上面所公開的實施方式，而是可以根據本 發明所屬技術領域的知識對其進行修改，所作修改不會超出本發明要求保護的范圍。例如， 本發明所使用的熒光實時PCR也可以根據需要采用說明書中所列出的實施例中指出的熒光 報告基團和熒光淬滅基團以外的標記物質，如 物;或使用Taqman技術之外的其他標記體系，例如MGB探針、分子信標MB探針、蝎形探針、熒 光雙雜交探針等熒光探針標記技術;或使用染料嵌合法如SYBR Green I等不飽和染料與LC Green等飽和染料，只要其使用了本發明所述的特異性引物序列，即可定性或定量檢測目的 基因的存在，進而特異性地檢測肺炎衣原體的存在。所以，這些本領域技術人員所了解的改 變和慣用手段的替換也落入本發明的保護范圍內。本發明的保護范圍應由所附的權利要求 書限定。
【主權項】
1. 一種用于特異性檢測樣品中肺炎衣原體核酸的試劑盒，其中包括PCR反應液、酶混合 液、陰性質控品和陽性質控品，PCR反應液中用于核酸擴增反應的引物序列如下： PI:5'-GCGCAATAATGGCCTTGCATT-3'， P2:5'-AGTCATTGATGCACTAGCTGTTGCT-3'， PCR反應液中用于熒光信號監測的寡核苷酸探針的序列如下： Probe: 5' -Xi-CGTTGGCAACTGAGGCTCGCG-Yi -3'， Probe熒光報告基團X^FAM，焚光淬滅基團Y^Eclipse。2. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應體系為20 uL，包括2 XPCR緩沖液 10 yL、10mmol/L dNTP 1.0yL、25ymol/L引物各0.5 yL、10ymol/L 探針0.2 yL、熱啟動Taq 酶混合液〇.4yL、樣品DNA 2yL，加滅菌水至終體系20 yL。3. 如權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于PCR反應循環參數為： 94°C，2min;進入循環階段：94°C變性10s，56°C退火50s，72°C延伸15s，共反應40個循 環。
【專利摘要】本發明名稱為肺炎衣原體熒光PCR檢測試劑盒，屬于肺炎衣原體的體外診斷領域。本發明針對肺炎衣原體基因序列保守區域特異的靶序列設計引物和Taqman探針，利用real-time？PCR的方法，用來快速檢測樣品中是否存在肺炎衣原體的核酸。該試劑盒對肺炎衣原體核酸的檢測限為10拷貝每反應體系，整個反應可在2小時內完成，在疾病監測、臨床診斷等領域具有重要的應用價值。
【IPC分類】C12Q1/04, C12Q1/68
【公開號】CN105567802
【申請號】CN201510884130
【發明人】不公告發明人
【申請人】江蘇和創生物科技有限公司
【公開日】2016年5月11日
【申請日】2015年12月7日