一種大腸桿菌 o26、o45、o121血清型三重pcr檢測試劑盒及其引物組的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種大腸桿菌O26、O45、O121血清型檢測試劑盒及其檢測方法。本發明所述試劑盒3對引物組能在同一反應體系能進行有效擴增。實驗表明，本發明所述含該引物組的檢測試劑盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前大腸桿菌O26、O45、O121血清分型檢測方法上的不足，可以滿足當前大腸桿菌O26、O45 O121血清型分型的檢測需求，易于大范圍推廣應用，適用于食源性致病菌的初篩選，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。
【專利說明】
一種大腸桿菌〇26、045、0121血清型三重PCR檢測試劑盒及其 引物組
技術領域
[0001]本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種大腸桿菌026、045、0121血清型檢測 試劑盒及其引物組。
【背景技術】
[0002] 大腸埃希氏菌(Escherichia coli)通常被稱為大腸桿菌，是Escherich在1885年 發現的，在相當長的一段時間內，一直被當作正常腸道菌群的組成部分，認為是非致病菌。 直到20世紀中葉，才認識到一些特殊血清型的大腸桿菌對人和動物有病原性，尤其對嬰兒 和幼畜（禽），常引起嚴重腹瀉和敗血癥。產志賀氏毒素大腸桿菌是重要的食源性致病源，嚴 重危害公共健康。〇157:H7可以導致腹瀉、出血性腸炎，尿毒血癥等臨床癥狀。近年來，產志 賀毒素而非0157的大腸桿菌，尤其是被美國農業部稱為"the Big Six"的6種大腸桿菌在諸 多國家及地區暴發流行，嚴重威脅人類的健康，越來越受到世界各國的關注。"the Big Six"包括大腸桿菌026、045、0103、0111、0121、0145等6種血清型。
[0003] 據統計，在美國由non-0157 STEC引起的患病病例中，有71%是由026、045、0103、 0111、0121、0145血清型引起的。為了保障人類的健康和牛肉市場的正常供應，2011年9月， 美國農業部頒布了一項禁止出售帶有大腸桿菌"the Big Six"（026、045、0103、0111、0121、 0145)牛肉制品的法令。基于我國目前掌握的食源性疾病和風險監測資料，對高危食品（牛 肉制品和即食果蔬)和高致病性血清型(〇157:H7)進行了嚴格的規定和限量要求，但未對其 他血清型的STEC作明確的要求。有助于開展大腸桿菌026,045,0103,0111,0121,0145血清 型風險監測和風險評估的檢測技術相對滯后。
[0004] 大腸桿菌抗原復雜，主要有菌體抗原(0)、莢膜抗原(K)、鞭毛抗原(H)和菌毛抗原 (F)等，大腸桿菌表面抗原0-抗原是刺激機體產生先天性免疫和獲得性免疫的重要毒力因 子，在大腸桿菌的致病性過程中起著重要的作用。針對于〇抗原的傳統血凝試驗是檢測血清 型的主要方法，該方法費時、費力，PCR檢測技術在大腸桿菌血清型檢測過程得到發展和應 用，目前國內，針對〇26、045、0121血清型多重PCR檢測方法還未見報道，因此，本發明研究人 員研究一種多重PCR檢測方法應用于026、045、0121血清型的檢測，該方法省時、省力、特異 性和敏感性高，適用于推廣應用。
[0005] 本發明公開了一種大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒及其檢測方法。本發 明所述試劑盒3對引物組能在同一反應體系能進行有效擴增。現有技術中雖然也有其它檢 測試劑盒，但實驗表明，本發明所述含該引物組的檢測試劑盒及其檢測方具有快速、敏感、 特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前大腸桿菌〇26、045、0121血清分型檢測 方法上的不足，可以滿足當前大腸桿菌026、045、0121血清型分型的檢測需求，易于大范圍 推廣應用，適用于食源性致病菌的初篩選，具有廣闊的市場前景和較大的經濟效益。

【發明內容】

[0006] 本發明要解決的技術問題尋找一種能夠快速、準確、特異性和靈敏性高的大腸桿 菌026、045、0121血清型的引物組，實現對026、045、0121血清型的高通量檢測，并組裝成試 劑盒，便于推廣應用。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明提供一種用于檢測大腸桿菌026、045、0121血清型的 引物組，包括以下引物，其核苷酸序列分別為:026-F: 5 '-ITCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3 '， 026-R:5 '-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3 '；045-F:5 '-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '，045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '；012 卜F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '， 0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '；
[0008] 其特異性擴增的目的片段大小分別為:若電泳結果出現159bp條帶為大腸桿菌026 血清型；出現241bp條帶為大腸桿菌045血清型；出現632bp條帶為大腸桿菌0121血清型。
[0009] 所述引物組在制備檢測大腸桿菌026、045、0121血清型試劑盒中的應用。
[0010] 4.在一些實施例中，所述大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒還含有商品化 的2XPCR反應液試劑。
[0011]另一方面，本發明還提供所述試劑盒在用于檢測大腸桿菌026、045、0121血清型的 檢測方法，大腸桿菌菌液或其DNA提取物作為模板，用所述的0抗原特異性引物進行PCR擴 增，對擴增產物進行檢測，電泳結果出現159bp條帶為大腸桿菌026血清型；出現241bp條帶 為大腸桿菌045血清型；出現632bp條帶為大腸桿菌0121血清型。
[0012] 所述PCR反應體系為50yL時含有：2XPCRBuffer 25此、終濃度為10uM引物混合液5 此、模板1 yL、超純水19uL。
[0013] PCR反應參數：95°C預變性 15min;95°C30s，55°Clmin 30s，72°Clmin 30s，30個循 環；72°C10min。
[0014]本發明所述試劑盒在用于檢測大腸桿菌026、045、0121血清型的方法，包括下列步 驟：
[0015] 1)大腸桿菌模板的制備
[0016] 將待測大腸桿菌菌株菌液接種至商品化的VIB液體培養基，37°C過夜搖菌，取lmL 菌液，分別用煮沸法和商品化細菌基因組提取試劑盒，進行模板制備；
[0017] 2)特異性引物的制備所述的0抗原特異性引物026-F、026-R、045-F、045-R、0121-F 和0121-R的使用濃度為10uM;引物稀釋液置于-20°C保存備用，避免反復凍融；
[0018] 3)PCR反應體系的建立和擴增
[0019] 取PCR管，分別加2XPCR反應混合液25yL、引物026-F、026-R、045-F、045-R、0121-F 和0121-R混合液5yL、模板1. OyL、超純水19. OyL，混勻;PCR反應參數:95 °C預變性15min; 95 °C 30s，55 °C lmin30s，72 °C lmin30s，30 個循環；72 °C lOmin;
[0020] 4)PCR檢測結果判定
[0021] 取lOyLPCR產物，點樣于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳板孔中，120V電壓，電泳20min，于凝 膠成像系統下拍照判定，判定前提條件為陰性對照無任何條帶出現，具體判定方法：電泳結 果出現159bp條帶為大腸桿菌026血清型；出現241bp條帶為大腸桿菌045血清型；出現632bp 條帶為大腸桿菌0121血清型。
[0022]大腸桿菌經典檢測技術是血清凝集試驗，缺點是交叉反應多，敏感性低。本發明基 于大腸桿菌0抗原基因，設計可以在同一檢測體系進行以026、045、0121血清型大腸桿菌0抗 原基因的特異性引物，采用聚合酶鏈反應(PCR)判定該菌大腸桿菌的血清型。所述檢測試劑 盒及其檢測方法具有快速、敏感、特異、成本低和操作簡單的特點，能較好的彌補當前大腸 桿菌血清型檢測方法上的不足，易于大范圍推廣應用，具有廣闊的市場前景和較大的經濟 效益。
【附圖說明】
[0023] 圖1大腸桿菌026、045、0121血清型PCR檢測
[0024] 圖2大腸桿菌026、045、0121血清型PCR檢測試劑盒特異性測試
[0025] 圖3以大腸桿菌培養物為模板的PCR檢測試劑盒靈敏度測試
[0026] 圖4以大腸桿菌基因組DNA為模板的PCR檢測試劑盒靈敏度測試
【具體實施方式】
[0027] 下列實施例中所有的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法;所用的材料、試劑 等，如無特殊說明，均可從商業化途徑得到。
[0028] 實施例1
[0029] 大腸桿菌026、045、0121血清型檢測引物組的設計
[0030] 設計的3對血清型特異性引物。根據設計的引物組分別擴增159bp、241bp和632bp 的026、045、0121血清型特異性片段。
[0031] 2.大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒的制備
[0032] (1)大腸桿菌模板的制備
[0033]將大腸桿菌菌株接種至VIB液體培養基，37 °C增菌過夜。各取lmL菌液，制成模板備 用。
[0034] (2)特異性引物的制備
[0035]本試劑盒檢測的大腸桿菌026、045、0121血清型特異性引物擴增的目的片段大小 分別為：15%?(026)、241&?(045)和632&?(0121)。各條引物使用濃度為10碰，引物稀釋液置 于-20°C保存備用，避免反復凍融；可根據如下引物序列人工合成。：026-?:5'-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3'，026-R:5'-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3' ；045-F:5'_ CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '，045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '；0121-F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '，0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '；
[0036] (3)PCR反應體系的建立和擴增
[0037]取PCR管，取PCR管，分別加2 X PCR反應混合液25yL、引物0264、026-1?、0454、045-R、0121-F和0121-R混合液5yL、模板1. OyL、超純水19. OyL，混勻;PCR反應參數:95 °C預變性 151^11;951€3〇8,55。(：11111113〇8,72。(：11111113〇8,30個循環 ；72。(：1〇111111;
[0038] (4)PCR檢測結果判定
[0039] 取10yL PCR產物，點樣于1.5 %瓊脂糖凝膠電泳板孔中，120V電壓，電泳20min，于 凝膠成像系統下拍照判定，判定前提條件為陰性對照無任何條帶出現。
[0040]具體判定方法：電泳結果出現159bp條帶為大腸桿菌026血清型（圖1第1泳道）；出 現241bp條帶為大腸桿菌045血清型（圖1第2泳道）；出現632bp條帶為大腸桿菌0121血清型 (圖1第3泳道)。
[0041 ] 3.大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒的特異性和敏感性評價
[0042]本實施例中對實施例1中制備的大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒特異 性、敏感性和重復性等主要特征分別進行了測評。
[0043] (1)試劑盒特異性試驗
[0044] 選取大腸桿菌026、045、0121、0103、0145、0113、0111、0157、078、0101、鼠傷寒沙門 氏菌（CVCC3384)、腸炎沙門氏菌（CVCC1805)、雞白痢沙門氏菌（CVCC519)、鴨沙門氏菌 (CAU0118)、禽巴氏桿菌(CVCC493)、雞毒支原體(CVCC1651)、禽支原體(CVCC274)、金黃色葡 萄球菌(CVCC543)、禽波氏菌(ATCC菌株IPDH591-77)、豬2型鏈球菌。按照試劑盒使用說明操 作進行PCR，產物于1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。大腸桿菌026、045、0121可擴增到特異性 條帶，其它菌株的PCR結果均為陰性(如圖2)，泳道1-20分別為:026、045、0121、0103、0145、 0113、0111、0157、078、0101、鼠傷寒沙門氏菌((^0：3384)、腸炎沙門氏菌((^0：1805)、雞白 痢沙門氏菌（CVCC519)、鴨沙門氏菌（CAU0118)、禽巴氏桿菌（CVCC493)、雞毒支原體 (CVCC1651)、禽支原體（CVCC274)、金黃色葡萄球菌（CVCC543)、禽波氏菌（ATCC菌株 IPDH591-77)、豬2型鏈球菌。
[0045] (2)以細菌培養物為模板的試劑盒靈敏度試驗
[0046] 分別接種大腸桿菌026、045、0121至VIB液體培養基中，37°C增菌過夜，各取lmL菌 液，分別制備菌液，濃度為 1 〇6CFU/yL、105CFU/yL、104CFU/yL、10 3CFU/yL、102CFU/yL、1OCFU/y L、lCFU/yL。各吸取lyL加入PCR反應體系，按照試劑盒操作說明進行PCR，根據試驗結果測定 試劑盒的靈敏度。結果表明，本發明建立的大腸桿菌〇26、045、0121血清型檢測方法可以檢 測出100CFU的026和0121血清型大腸桿菌，能檢測出10CFU的045血清型大腸桿菌(如圖3)。
[0047] (3)以細菌基因組DNA為模板的試劑盒靈敏度試驗
[0048] 分別接種大腸桿菌026、045、0121至VIB液體培養基中，37°C增菌過夜，各取lmL菌 液提取細菌基因組 DNA，分別稀釋濃度為 100ngAiL、10ngAiL、lng/yL、500pgAiL、100pgAiL、 10pgAiL、lpg/yL。各吸取lyL加入PCR反應體系，按照試劑盒操作說明進行PCR，根據試驗結 果測定試劑盒的靈敏度。結果表明，本發明建立的大腸桿菌〇26、045、0121血清型檢測方法 可以檢測出l〇pg的026、045、0121血清型大腸桿菌基因組DNA(如圖4)
[0049] 通過條件優化，確定了最佳的PCR反應體系和反應參數，組裝了大腸桿菌026、045、 0121血清型檢測試劑盒。對實驗室已保存的陽性菌株進行擴增，均可擴增到特異性條帶，而 其他細菌標準菌株等對照樣品均未擴增到，說明該試劑盒具有很好的特異性。靈敏性檢測 表明，試劑盒具有較高的靈敏性，其最低檢測靈敏度可達到10CFU細菌菌液及10pg細菌基因 組DNA。研究結果表明，本發明研制的大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒具有靈敏、 特異、快速的優點，為大腸桿菌〇26、045、0121血清型檢測及流行病學調查提供了新的技術 手段。
[0050] 以上所述是本發明的優選實施例，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來 說，在不脫離本發明所述原理的前提下，還可以作出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應 視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種用于檢測大腸桿菌〇26、045、0121血清型的引物組，其特征在于，包括以下引物， 其核苷酸序列分別為： 026-F:5 '-TTCAATGGGCGGAAATTTTAGAATA-3 '， 026-R:5 '-TAATAATTTTCTCTGCCGTCGCG-3 '； 045-F:5 '-CTTGCAGTAACCTGCACGGGCGC-3 '， 045-R:5 '-TAGCAGGCACAACAGCCACTACTAGGC-3 '； 0121-F:5 '-ACTCCAACAATTGGTCGTGAAAC-3 '， 0121-R:5 '-ACAGAAAGTGTGAAATGCCCGTA-3 '； 任選的，含有或者不含有其它引物。2. 根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，大腸桿菌026、045、0121血清型特異性引 物擴增的目的片段大小分別為：159bp、241bp和632bp。3. 權利要求1或2所述引物組在制備檢測大腸桿菌026、045、0121血清型試劑盒中的應 用。4. 一種含權利要求1或2所述引物組的大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒。5. 根據權利要求4所述的大腸桿菌026、045、0121血清型檢測試劑盒，其特征在于，其還 含有商品化的2 XPCR反應液。6. 權利要求4-5任意一項所述試劑盒在檢測大腸桿菌026、045、0121血清型中的應用， 其特征在于，所述應用中，采用先將待測大腸桿菌菌液或待測大腸桿菌的DNA提取物作為模 板，用所述引物進行PCR擴增，對擴增產物進行檢測，若電泳結果出現159bp條帶為大腸桿菌 026血清型；出現241bp條帶為大腸桿菌045血清型；出現632bp條帶為大腸桿菌0121血清型； 優選的，所述的檢測是非診斷目的的。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，PCR反應體系為50yL時含有：2XPCR Buffer 25yL、各條引物終濃度為1 OuM引物混合液5yL、模板lyL、超純水19yL。8. 根據權利要求6或7所述的應用，其特征在于，PCR反應參數:95°C預變性15min;95°C 30s，55°Clmin 30s，72°Clmin 3〇8,30個循環；72。(：1〇11^11。
【文檔編號】C12Q1/68GK105821124SQ201610208130
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月6日
【發明人】王金良, 沈志強, 陳金龍
【申請人】山東省濱州畜牧獸醫研究院