一種抗人肺炎支原體p30蛋白抗體及應用該抗體的免疫層析試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗人肺炎支原體P30蛋白抗體及應用該抗體檢測人肺炎支原體的免疫層析試劑盒，抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是識別人肺炎支原體P30蛋白142?155位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體，人肺炎支原體P30蛋白在GenBank序列號是ABR09215.1；人肺炎支原體P30蛋白142?155位的氨基酸序列為AHAEAEVEPAPQPV。本發明所提供的兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體具有特異性好、純度高、效價高、制備成本低廉的特點。
【專利說明】
一種抗人肺炎支原體P30蛋白抗體及應用該抗體的免疫層析 試劑盒
技術領域
[0001 ]本發明屬于生物醫學技術領域，涉及一種抗人肺炎支原體P30蛋白抗體及應用該 抗體檢測人肺炎支原體的免疫層析試劑盒。
【背景技術】
[0002] 肺炎支原體(M. Pneumonia)是人類支原體肺炎的病原體。支原體肺炎的病理改變 以間質性肺炎為主，有時并發支氣管肺炎，稱為原發性非典型性肺炎。主要經飛沫傳染，潛 伏期2~3周，發病率以青少年最高。臨床癥狀為頭痛、咽痛、發熱、咳嗽等一般的呼吸道癥 狀，一年四季均可發生，但多在秋冬時節。Mp感染在小兒肺炎病原的發生率高達10-30%，近 年來逐漸成為小兒感染呼吸道疾病的主要病原體之一。該病極易引發咽炎、扁桃體炎等呼 吸道感染，甚至可能同時繼發腦膜炎、肝炎、心肌炎等多臟器損傷，嚴重時也可導致患兒死 亡。
[0003] 由于Mp感染與其它病原體引起的呼吸道感染癥狀類似，不做病原學檢查，很難將 Mp與其它病原體引起的呼吸道感染相區別。Mp無細胞壁，常用的β-內酰胺類藥物對其無效， 故其引起的感染的治療與其它細菌和病毒感染的治療方案完全不同，因此建立簡便、快速、 可行、能早期診斷肺炎支原體感染的方法非常必要。
[0004] 目前Mp的檢測方法主要有3類:一是分離培養法，其是證實感染的"金標準"，但由 于Mp的生長周期極為緩慢，培養周期長，導致該法在臨床上不能進行快速診斷;二是血清學 方法，即采用酶聯免疫法、膠體金免疫法、微量免疫熒光法和間接血凝試驗等，檢測被檢者 血清中Mp抗體水平，可間接提示Mp感染的存在。然而，血清學試驗只能提供一種回顧性的診 斷，而且有時需要雙份血清。另外，抗體出現的時機不易掌握，兒童、青少年與成人之間又存 在Mp特異性抗體的差異，并且，Mp細胞膜上的糖脂抗原與其他微生物及機體組織存在非特 異性交叉反應，故現有血清學方法的檢測質量受到一定限制;三是利用分子生物學技術檢 測Mp DNA的存在，其中最常用的是聚合酶鏈式反應(PCR)，該方法快速、靈敏、特異，是目前 研究Mp感染的重要手段，但由于PCR對實驗設備以及操作要求較高，且易出現假陽性，在我 國還不能作為常用的臨床診斷方法。因此，建立Mp特異性抗原診斷方法十分必要。目前，已 公開報道的檢測Mp抗原的方法主要為雙抗夾心ELISA法，間接免疫熒光法，量子點標記免疫 層析法等，但這些方法均不能實行床旁檢測，需要到特定的場合利用特定的儀器（如酶標 儀、熒光儀等)來檢測，不僅不夠方便快捷而且時間較長，臨床應用較為不便。
[0005] 因此，建立人肺炎支原體特異性抗原的快速診斷方法十分必要。由于人流感肺炎 支原體Ρ30蛋白序列上的高度保守性，使其成為了一個重要的檢測標的。因此獲得高特異性 的抗人肺炎支原體Ρ30蛋白抗體就是一個十分重要的工作。目前，關于抗人肺炎支原體Ρ30 蛋白抗體報道得最多的為相應的單克隆抗體及多克隆抗體。單克隆抗體最大的優點就是特 異性高，但是制備方法繁瑣，生產成本高，限制了其應用。多克隆抗體主要由基因工程表達 的Ρ30蛋白免疫家兔等動物制備而成。其制備方法簡單，成本低，但是基因工程表達的Ρ30蛋 白為包涵體結構，不具天然蛋白結構，用其制備的抗體其具有特異性低、效價低等缺陷。因 此，低成本的制備高特異性、高效價的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體就顯得十分重要。

【發明內容】

[0006] 針對【背景技術】中存在的這些技術問題，本發明的目的在于提供識別人肺炎支原體 P30蛋白142-155位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體及應用該抗體的免疫層析試劑盒。
[0007] 抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，其特征在于:所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是 識別人肺炎支原體P30蛋白142-155位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體，所述人肺炎支 原體P30蛋白在GenBank序列號是ABR09215.1;所述人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14個 氨基酸序列為AHAEAE VEPAPQPV;將人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14個氨基酸的序列命 名為P30Linear;所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是AbP30Linear。
[0008] 一種基于如前所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其 特征在于:所述試劑盒是基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒或基于膠體金標記技術的 免疫層析試劑盒。
[0009] 作為優選，本發明所提供的試劑盒是基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒時， 所述試劑盒的制備方法是：
[00?0] 1)量子點標記抗體AbP30Linear:
[0011] 向微量離心管中依次加入〇.4nmol羧基水溶性量子點和800nmol碳二亞胺EDC，以 MES緩沖液定容為lml，混合溶液，37°C反應5min后，再加入0.34mg的制備得到的抗體 AbP30Linear，避光反應2h，加入單端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為1 % (m/v)，封閉 未反應的活化羧基位點，繼續避光反應Ih;反應后的樣品用超濾管離心(截留分子量100k)， 6500g離心5min，至體積200ul，將超濾后樣品轉移至普通EP管內，離心除團聚，得到上部清 液以及下部沉淀，1000 Og條件下離心3min;將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待 上部清液自然流入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開 始從下部流出時開始收集，收集Iml后停止收集;將純化后的樣品用超濾管（截留分子量 100k)以6500g離心濃縮至200ul后轉移至普通EP管內離心除團聚，對普通EP管進行離心的 條件是10000g，3min;獲取上清后以磷酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存備用；至此制得含有 量子點標記抗體AbP30Linear的溶液；
[0012] 所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/L MES以及0.74g/L EDTA，所述MES 緩沖液的pH 7.4;
[0013] 所述磷酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、 〇.2g氯化鈉、Ig牛血清白蛋白BSA以及0. lgNaN3,溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH 調pH至7.3后用去離子水定容至100mL;
[0014] 2)制備結合墊
[0015] 將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有量子點標記抗體AbP30Linear的溶液中 Ih，取出，25 °C干燥后裁成后規格為4cm X 0 · 6cm/條后，4°C密封保存備用，至此制得結合墊；
[0016] 3)制備樣品塾
[0017] 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3h，再置于生 物安全柜內37°C通風干燥后，剪裁成規格為4cmX 2.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封保 存；
[0018] 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、 〇. 2g氯化鈉、2g牛血清白蛋白BSA、Iml吐溫-20、2g蔗糖以及0.5g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10，溶 解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100mL;
[0019] 4)制備檢測層
[0020] 以申請號為201410405275.3發明名稱為"人肺炎支原體金標銀染免疫層析檢測試 劑盒及其制備方法和應用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0021] 將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-HiS融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為 0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cmX4cm的規格，4°C密封干燥保存；至 此制得檢測層；
[0022] 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是：稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉以 及〇. 2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至 100ml；
[0023] 5)組裝檢測卡
[0024] 5 · 1)將底板裁剪成4cm X 7 · 3cm大小，備用；
[0025] 5 · 2)將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用；
[0026] 5.3)將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4)所述的檢測層即 帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面；
[0027] 5.4)將步驟5.2)準備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層右末端 有0.2cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結 合墊按0 · 3cm重疊于檢測層的左邊緣處，0 · 3cm粘于底板上；
[0028] 5.5)將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.3cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與 底板的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.Omm寬的檢測 卡，4°C密封干燥避光保存。
[0029] 作為優選，本發明所提供的試劑盒是基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒時， 所述試劑盒的制備方法是：
[0030] 1)膠體金標記抗體AbP30Linear:
[0031] 1 · 1)制備30nm膠體金溶液：
[0032] 取一個硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將Iml 1 % (m/v)HAuCl4溶液加入 250ml三角瓶中并與超純水混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰；向250ml三角瓶中快速加入2ml 1 % (m/v)檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼續沸騰IOmin，待250ml三角瓶中的溶液由藍色轉變為 紅色時停止加熱，將250ml三角瓶中的溶液自然冷卻至室溫，然后向250ml三角瓶中加入超 純水補齊至100ml;
[0033] 1 · 2)膠體金標記抗體 AbP30Linear:
[0034] 1.2.1)取一個硅化好的50ml三角瓶，加入IOml步驟1.1)所制備的膠體金溶液，向 膠體金液中加入240111 0.2111〇1/11(2〇)3調節?!1至8.5;
[0035] 1.2.2)在電磁攪拌器攪拌下，將抗體4&?301^11631'加入膠體金溶液中，至抗體終濃 度為10ug/ml，加入抗體時逐滴加入，加完后繼續攪拌45min~60min;
[0036] 1.2.3)反應完成加入5% (m/v)牛血清白蛋白BSA至終濃度為1 % (m/v)，攪拌15~ 30分鐘，4 °C保存備用；
[0037] l·2·4)將標記好的抗體AbP30Linear取出后裝入50ml離心管，2500g，4°C離心5分 鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉移至另一只50ml離心管，12000g， 4°C離心30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用IOml膠體金緩沖 液重懸沉淀，然后再12000g，4°C離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最 后用3ml膠體金緩沖液重懸，4°C保存備用，得到含有膠體金標記抗體AbP30Linear的溶液； [0038] 所述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、l%m/vBSA、l%v/v Tween- 20、5 %m/v蔗糖以及3%〇πι/ν聚乙烯吡咯烷酮PVP-IO，所述膠體金緩沖液的pH為10.5;
[0039] 2)制備結合墊
[0040]將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有膠體金標記抗體AbP30Linear的溶液中 Ih，取出，25 °C干燥后裁成后規格為4cm X 0 · 6cm/條后，4°C密封保存備用，至此制得結合墊； [0041] 3)制備樣品塾
[0042]取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少2h，再置于生 物安全柜內37°C通風干燥后，剪裁成規格為4cmX 1.5cm/條后，即制得樣品墊，25°C密封保 存；
[0043] 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.242g TrisUg牛血清白蛋白BSAUml吐 溫-20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-IO，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH 調pH至11后用去離子水定容至100mL;
[0044] 4)制備檢測層
[0045]以申請號為201410405275.3發明名稱為"人肺炎支原體金標銀染免疫層析檢測試 劑盒及其制備方法和應用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0046]將硝酸纖維素膜剪成4cmX 2cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-His融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為 0.5cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥18h，剪裁成4cmX2cm的規格，4°C密封干燥保存;至 此制得檢測層；
[0047] 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是：稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉以 及〇. 2g氯化鈉，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至 100ml；
[0048] 5)組裝檢測卡
[0049] 5 · 1)將底板裁剪成4cm X 6cm大小，備用；
[0050] 5 · 2)將吸水濾紙裁剪成4cm X 2 · 5cm大小，作為吸水墊，備用；
[0051] 5.3)將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4)所述的檢測層即 帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面；
[0052] 5.4)將步驟5.2)準備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層右末端 有0.2cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結 合墊按0 · 2cm重疊于檢測層的左邊緣處，0 · 4cm粘于底板上；
[0053] 5.5)將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.2cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與 底板的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.Omm寬的檢測 卡，4°C密封干燥避光保存。
[0054]本發明的優點是：
[0055] 本發明提供了抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，該抗人肺炎支原體P30蛋白抗體識別 人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14個氨基酸所組成的線性抗原表位，人肺炎支原體P30 蛋白在GenBank序列號是ABR09215.1;人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14個氨基酸的氨 基酸序列為AHAEAE VEPAPQPV;將人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14個氨基酸的序列命名 為P30Linear;抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是AbP30Linear。基于人肺炎支原體單一線性抗 原表位所制備的上述兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體具有特異性好、純度高、效價高、制備 成本低廉的特點，可用于生產各種基于抗原-抗體反應的原理的高靈敏度檢測人肺炎支原 體的檢測試劑盒。同時，基于該抗人肺炎支原體P30蛋白抗體還制備得到了兩種不同的免疫 層析試劑盒。兩種不同的免疫層析試劑盒能快速、準確檢測生物樣品中的人肺炎支原體，其 均包括本發明所述的抗體;兩種免疫層析試劑盒均可用于人肺炎支原體感染的輔助診斷， 具有更高的靈敏性與特異性，同時兼顧了簡單、快速、穩定以及制造成本低等優勢，適用于 臨床標本的檢查，而且由于可以進行大批量的快速檢查，也適合于流行病學調查。因此，本 發明所述的兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，兩種免疫層析試劑盒均具有廣泛的應用前景 和實用價值。
【具體實施方式】
[0056] 為了有助于本領域的普通技術人員進一步理解本發明，下文特舉較佳實施例詳細 說明本發明。
[0057] 本申請文件中濃度單位中的"m/v"，當m單位為g時，V單位為mL，屬于本領域的常 識。
[0058] 本發明使用或采用的各種材料的來源及相關試劑的配制
[0059] 1、樣品墊處理液:稱取0.242g Tris，Ig牛血清白蛋白（BSA)，Iml吐溫-20，5g蔗糖， 〇.3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP-10)，溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至11后用去 離子水定容至l〇〇ml。
[0060] 2、磷酸鹽保存液:稱取0.29g磷酸氫二鈉、0.0295g磷酸二氫鈉、0.2g氯化鈉、Ig牛 血清白蛋白BSA以及0.1gNaN3，溶解于90ml的去離子水中，用lmoI/L NaOH調pH至7.3后用去 離子水定容至100ml;
[0061 ] 3、磷酸鹽緩沖液(PBS):稱取0.29g磷酸氫二鈉，0.0295g磷酸二氫鈉，0.2g氯化鈉， 溶解于90ml的去離子水中，用lmol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100ml。
[0062] 4、樣品處理液:稱取0.0121g三羥甲基氨基甲烷，0.17g氯化鈉，0.025g溶菌酶溶解 于90ml去離子水中，用鹽酸調pH至8.0后用去離子水定容至100mL。
[0063] 5、抗體AbP30Linear:為本發明自制，用I3BS稀釋，搖勻，使溶液中抗體濃度為3mg/ ml 〇
[0064] 6、兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG:為本發明自制，用PBS稀釋，搖勻，使 溶液中抗體濃度為3mg/ml。
[0065] 7、羊抗兔IgG:為武漢博士德生物工程有限公司產品，用I3BS稀釋，搖勻，使溶液中 多克隆抗體濃度為lmg/ml。
[0066] 8、量子點:本發明中所用量子點為羧基化兩親聚合物修飾的水溶性CdSe/ZnS量子 點，其發射波長為565nm，購買自武漢珈源量子點技術開發有限公司，產品名稱為羧基水溶 性量子點_565。
[0067] 9、玻璃纖維素膜:厚度為0 · 4mm，吸水量為42mg/cm2，玻璃纖維直徑為0 · 6-3μπι，具 有良好的親水性，購買于上海金標生物科技有限公司（型號為ΒΤ40)。
[0068] 10、聚酯纖維膜:厚度為0.48mm，吸水速度為18s/4cm，具有極好的親水性，用于結 合墊的制備，購買于上海金標生物科技有限公司（型號為DL42)。
[0069] 11、硝酸纖維素膜：型號為Millipore Corp SHF135,有襯板，購買于Millipore公 司。
[0070] 12、吸水濾紙:厚度為0.95mm，吸水速度為60s/4cm，吸水量為700mg/cm2，具有良好 的吸水性，作為制作吸水墊的材料。購買于上海金標生物科技有限公司（型號為CH37K)。
[0071] 13、底板:為高白度PVC材質，表面涂布單層高聚合物壓敏膠SM31-40，購買于上海 金標生物科技有限公司。
[0072] 14、人肺炎支原體:購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)，編號為ATCC15531。
[0073] 15、本發明所用到的微生物樣品均購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。
[0074]下面結合實施例對本發明所提供的技術方案進行詳細說明：
[0075] 實施例1兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的制備
[0076] 兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的制備方法如下：
[0077] 1)經結構生物學分析及相關實驗研究后，選定人肺炎支原體P30蛋白（GenBank序 列號ABR09215.1)142-155位的14個氨基酸作為制備兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的線性 抗原表位，該段氨基酸序為AHAEAEVEPAPQPV，將此序列命名為P30Linear;
[0078] 2)將步驟1)所述的氨基酸序列P30Linear的N端添加一個半胱氨酸后，用多肽自動 合成儀合成多肽并純化，純化后的多肽與載體蛋白KLH偶聯，形成P30Linear-KLH復合蛋白；
[0079] 3)將步驟2)所合成的復合蛋白乳化，乳化后在兔腹部皮下多點注射，先后注射三 次，每次間隔7-10天；
[0080] 4)第三次注射10-12天后，收集、分離得到含有兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的 血清，ELISA檢測血清中兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的效價，所述的兔抗人肺炎支原體 P30蛋白抗體的效價均在1:60000以上；
[0081] 5)將步驟2)合成并純化的多肽與溴化氰活化的Sepharose 4B偶聯，形成多肽親和 層析柱；
[0082] 6)將步驟4)獲得的含有兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體的血清加入到步驟5)制備 的親和層析柱中，并在4°C孵育過夜后，洗脫抗體，得到兔抗人肺炎支原體P30蛋白抗體;經 SDS-PAGE鑒定其純度均在97%以上，將這種純化的抗體命名為AbP30Linear。
[0083] 本實施例中步驟2)-6)皆是現有成熟技術，多家生物科技公司都可以提供程序化 的技術服務。本實施例中上述步驟中相關實驗環節的具體實施，系委托南京金斯瑞生物科 技有限公司完成。
[0084] 本發明所述"抗體"應該解釋為涵蓋具有所需特異性的結合結構域的任意特異性 結合因子。因而，這個術語涵蓋了與之同源的抗體片段、衍生物、人源化抗體以及抗體的功 能同等物和同源物。抗體的實例是免疫球蛋白亞型（如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)及其亞型亞 類;也可以是包含抗原結合結構域的片段如?813、8〇?￥、？￥、(^13、？(1和雙鏈抗體。
[0085] 實施例2基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒的制備及應用
[0086] 1 ·量子點標記抗體AbP30Linear
[0087] 向微量離心管中依次加入0.4nm〇l羧基水溶性量子點和800nmol碳二亞胺(EDC)， 以MES緩沖液（10.66g/L MES，0.74g/L EDTA pH 7.4)定容為lml，不停地混合溶液，37°C反 應5min后，再加入0.34mg的實施例1所制備的抗體AbP30Linear，避光反應2h，加入單端氨基 聚乙二醇(PEG2000-NH2)至終濃度為l%(m/v)，封閉未反應的活化羧基位點，繼續避光反應 lh。反應后的樣品用超濾管離心（截留分子量100k)，6500g離心5min，至體積200ul，將超濾 后樣品轉移至普通EP管內，離心除團聚（1000 Og，3min)。將上部清液加到分離柱(Superdex-200)上純化，待其自然流入柱體中，然后用PBS沖洗(液體自然流下），用紫外光照射柱體隨 時觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流出時開始收集，收集Iml后停止收集。將純化后的 樣品用超濾管（截留分子量100k)以6500g離心濃縮至200ul后轉移至普通EP管內離心 (10000g，3min)除團聚。獲取上清后以磷酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存備用。至此制得含 有量子點標記抗體AbP30Linear的溶液。
[0088] 2.結合墊的制備
[0089] 將聚酯纖維膜浸入步驟1所得到的含有量子點標記抗體AbP30Linear的溶液中lh， 取出，25°C干燥后裁成后規格為4cmX 0.6cm/條后，4°C密封保存備用，至此制得結合墊。 [0090] 3.樣品墊的制備
[0091]取玻璃纖維素膜一張，將其在樣品墊處理液中浸泡至少3h，再置于生物安全柜內 37 °C通風干燥后，剪裁成規格為4cm X 2 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存。
[0092] 4.檢測層的制備
[0093]以申請號為201410405275.3發明名稱為"人肺炎支原體金標銀染免疫層析檢測試 劑盒及其制備方法和應用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0094]將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-His融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為 0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cmX4cm的規格，4°C密封干燥保存；至 此制得檢測層；
[0095] 5.檢測卡的組裝
[0096] 將底板裁剪成4cmX 7.3cm大小，備用。
[0097] 將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用。
[0098] 組裝工作于生物安全柜內操作，首先將底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4所述的 檢測層即帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并小心抹平膜面。其次，將事 先裁好的吸水墊組裝到底板上，使其左邊與檢測層右末端有〇. 2cm的重疊，其右邊緣則與底 板的右邊緣對齊粘好并小心抹平。再將步驟2所述的結合墊按0.3cm重疊于檢測層的左邊緣 處，0.3cm粘于底板7上。最后將步驟3所述的樣品墊則按一邊0.3cm重疊于結合墊的左邊緣 處，另一邊與底板的左邊緣對齊，粘于底板上并小心抹平。將組裝好的檢測板于切條機下裁 成4. Omm寬的檢測卡，4 °C密封干燥避光保存。
[00"] 6.基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒的組成
[0100] 基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒由步驟5所述的檢測卡及樣品處理液所組 成。
[0101] 7.基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒的使用方法
[0102] 按常規方法獲得待檢者的咽拭子，將其插入裝有500μ1樣品處理液的軟質塑料管 中，擠壓塑料管壁，使拭子上的樣品充分溶解后取出120yL滴于檢測卡的樣品墊上，15分鐘 后于紫外分析儀下（型號為WD-9403A，北京六一儀器廠生產，紫外激發波長365nm)觀察檢測 結果。若咽拭子中含有人肺炎支原體抗原，則與結合墊中的量子點標記的抗體AbP30Linear 結合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG結合 后在紫外線激發下在檢測線處會形成肉眼可見的一條熒光檢測線，未結合完的量子點標記 抗體繼續層析與羊抗兔IgG結合后在紫外線激發下形成肉眼可見的第二條熒光質控線;若 待檢咽拭子中無相關抗原，則僅出現一條熒光質控線。如果熒光質控線未出現，則該檢測卡 失效。
[0103] 8.基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒的應用效果舉例
[0104] 本實施例中所指的基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒的使用方法參照步驟7 所述的操作步驟。
[0105] 1)特異性試驗
[0106] 用呼吸道常見病原體如嗜肺軍團菌(ATCC 33152)、人III型副流感病毒病毒(ATCC VR-93)、人流感嗜血桿菌(ATCC 53781)、人肺炎衣原體(AR-39株，ATCC編號53592)、人腺病 毒3型（GB株，ATCC編號VR-3)、人腺病毒7型（Gomen株，ATCC編號VR-7)、人甲型流感病毒 (HlNl，ATCC編號VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC編號VR-790)、人呼吸道合胞病毒(ATCC編 號VR26)、人肺炎鏈球菌(ATCC編號700670)等代替人肺炎支原體進行檢測，試劑盒檢測含這 些微生物的磷酸鹽緩沖液稀釋液都為陰性。
[0107] 2)臨床測試例
[0108] 以人肺炎支原體檢測"金標準培養法作為參照，取100例呼吸科呼吸道感染者的 咽拭子標本用步驟6所述的試劑盒進行檢測，培養法陽性率為13% (13/100)，本試劑盒為 12% (12/100)，2種方法的符合率為97% (97/100)。具體結果如表1所示。
[0109] 表1臨床標本的檢測結果
[0111] 實施例3基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒的制備及應用
[0112] 1 ·膠體金標記抗體AbP30Linear
[0113] a.30nm膠體金的制備
[0114] 取一硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將Iml 1 % (m/v)HAuC14溶液加入其 中混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰。向其中快速加入2ml 1 % (m/v)檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼 續沸騰IOmin(這個過程中溶液由藍色轉變為紅色）。停止加熱，讓溶液自然冷卻至室溫，然 后向其中加入超純水補齊至l〇〇ml。
[0115] b ·膠體金標記抗體AbP30Linear
[0116] 1)取一硅化好的50ml三角瓶，加入IOml步驟a所制備的膠體金金液，向金液中加入 24〇1110.2111〇1/11(2〇)3調節?11至8.5;
[0117] 2)在電磁攪拌器攪拌下，將抗體AbP30Linear加入膠體金溶液中，至抗體終濃度為 10ug/ml，加入抗體時應逐滴加入，加完后繼續攪拌45min~60min;
[0118] 3)反應完成加入5% (m/v)牛血清白蛋白（BSA)至終濃度為1 % (m/v)，攪拌15~30 分鐘，4°C保存備用。
[0119] 4)將標記好的抗體AbP30Linear取出后裝入50ml離心管，2500g，4°C離心5分鐘，得 到下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉移至另一只50ml離心管，12000g，4°C離 心30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用IOml膠體金緩沖液重懸 沉淀，然后再12000g，4°C離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最后用 3ml膠體金緩沖液重懸，4°C保存備用，得到含有膠體金標記抗體AbP30Linear的溶液；
[0120] 上述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、l%(m/V)BSA、l%(V/v) 1'冊〇11-20、5%(111八)蔗糖以及3%。(111八)聚乙烯吡咯烷酮?￥?-10，所述膠體金緩沖液的？!1為 10.5〇
[0121] 2.結合墊的制備
[0122] 將聚酯纖維膜浸入步驟1所得到的含有膠體金標記抗體AbP30Linear的溶液中lh， 取出，25°C干燥后裁成后規格為4cmX 0.6cm/條后，4°C密封保存備用，至此制得結合墊。
[0123] 3.樣品墊的制備
[0124] 取玻璃纖維素膜一張，將其在樣品墊處理液中浸泡至少2h，再置于生物安全柜內 37 °C通風干燥后，剪裁成規格為4cm X 2 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存。
[0125] 4.檢測層的制備
[0126] 以申請號為201410405275.3發明名稱為"人肺炎支原體金標銀染免疫層析檢測試 劑盒及其制備方法和應用"的說明書中第【0134】段至【0158】段所公開的內容制備兔抗重組 Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG。
[0127] 將硝酸纖維素膜剪成4cmX4cm大小;將按上述方法制備得到的兔抗重組Pl-His融 合蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2. Omg/mL及 1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中， 設置1. ΟμL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設置Ι.ΟμΙ/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為 0.7cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2h，剪裁成4cmX4cm的規格，4°C密封干燥保存；至 此制得檢測層。
[0128] 5.檢測卡的組裝
[0129] 將底板裁剪成4cm X 6cm大小，備用。
[0130]將吸水濾紙裁剪成4cm X 2 · 5cm大小，作為吸水墊，備用。
[0131] 組裝工作于生物安全柜內操作，首先將底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4所述的 檢測層即帶有質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并小心抹平膜面。其次，將事 先裁好的吸水墊組裝到底板上，使其左邊與檢測層右末端有〇. 2cm的重疊，其右邊緣則與底 板的右邊緣對齊粘好并小心抹平。再將步驟2所述的結合墊按0.2cm重疊于檢測層3的左邊 緣處，0.4cm粘于底板上。最后將步驟3所述的樣品墊則按一邊0.2cm重疊于結合墊的左邊緣 處，另一邊與底板的左邊緣對齊，粘于底板上并小心抹平。將組裝好的檢測板于切條機下裁 成4. Omm寬的檢測卡，4 °C密封干燥避光保存。
[0132] 6.基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒的組成
[0133] 基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒由步驟5所述的檢測卡及樣品處理液所組 成。
[0134] 7.基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒的使用方法
[0135] 按常規方法獲得待檢者的咽拭子，將其插入裝有500μ1樣品處理液的軟質塑料管 中，擠壓塑料管壁，使拭子上的樣品充分溶解并50°C水浴20min后，后取出120yL滴于檢測卡 的樣品墊上，（15)分鐘后肉眼觀察檢測結果。若咽拭子中含有人肺炎支原體抗原，則與結合 墊中的膠體金標記的抗體AbP30Linear結合，通過層析作用先與硝酸纖維素膜上的兔抗重 組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG結合后在在檢測線處會形成肉眼可見的一條紅色檢測 線，未結合完的膠體金標記抗體繼續層析與羊抗兔IgG結合后形成肉眼可見的第二條紅色 質控線;若待檢咽拭子中無相關抗原，則僅出現一條紅色質控線。如果紅色質控線未出現， 則該檢測卡失效。
[0136] 8.基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒的應用效果舉例
[0137] 本實施例中所指的基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒的使用方法參照步驟7 所述的操作步驟。
[0138] 1)特異性試驗
[0139] 用呼吸道常見病原體如嗜肺軍團菌(ATCC 33152)、I型人副流感病毒(ATCC VR-94)、II型人副流感病毒(ATCC VR-92)、III型人副流感病毒病毒(ATCC VR-93)、人流感嗜血 桿菌(ATCC 53781)、人肺炎衣原體(AR-39株，ATCC編號53592)、人腺病毒3型(GB株，ATCC編 號VR-3)、人腺病毒7型（Gomen株，ATCC編號VR-7)、人甲型流感病毒(H1N1，ATCC編號VR-1743)、人乙型流感病毒(ATCC編號VR-790)、人呼吸道合胞病毒(ATCC編號VR26)、人肺炎鏈 球菌(ATCC編號700670)等代替人肺炎支原體進行檢測，試劑盒檢測含這些微生物的磷酸鹽 緩沖液稀釋液都為陰性。
[0140] 2)臨床測試例
[0141] 以人肺炎支原體檢測"金標準培養法作為參照，取100例呼吸科呼吸道感染者的 咽拭子標本用步驟6所述的試劑盒進行檢測，培養法陽性率為13% (13/100)，本試劑盒為 13% (13/100)，2種方法的符合率為96% (96/100)。具體結果如表1所示。
[0142] 表1臨床標本的檢測結果
[0144]需要指出的是，以上所述僅為本發明的較佳實施例而已，并不用以限制本發明，凡 在本發明精神和原則之內所做的任何修改、等同替換等均應包含在本發明的保護范圍之 內。
【主權項】
1. 一種抗人肺炎支原體P30蛋白抗體，其特征在于:所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體 是識別人肺炎支原體P30蛋白142-155位氨基酸所組成的線性抗原表位的抗體，所述人肺炎 支原體P30蛋白在GenBank序列號是ABR09215.1;所述人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14 個氨基酸序列為AHAEAEVEPAPQPV ;將人肺炎支原體P30蛋白142-155位的14個氨基酸的序 列命名為P30Linear;所述抗人肺炎支原體P30蛋白抗體是AbP30Linear。2. -種基于如權利要求1所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑 盒，其特征在于:所述試劑盒是基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒或基于膠體金標記 技術的免疫層析試劑盒。3. 根據權利要求2所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其特 征在于:所述試劑盒是基于量子點標記技術的免疫層析試劑盒時，所述試劑盒的制備方法 是： 1) 量子點標記抗體AbP30Linear: 向微量離心管中依次加入0.4 nmol羧基水溶性量子點和800 nmol碳二亞胺EDC，以MES 緩沖液定容為1 ml，混合溶液，37 °C反應5 min后，再加入0.34 mg的制備得到的抗體 AbP30Linear，避光反應2 h，加入單端氨基聚乙二醇PEG2000-NH2至終濃度為l%m/v，封閉未 反應的活化羧基位點，繼續避光反應1 h;反應后的樣品用超濾管離心，6500g離心5min，至 體積200ul，將超濾后樣品轉移至普通EP管內，離心除團聚，得到上部清液以及下部沉淀， 10000g條件下離心3min;將上部清液加到分離柱Superdex-200上純化，待上部清液自然流 入柱體中，然后用PBS沖洗，用紫外光照射柱體觀察樣品的位置，待樣品開始從下部流出時 開始收集，收集1 ml后停止收集;將純化后的樣品用超濾管以6500g離心濃縮至200ul后轉 移至普通EP管內離心除團聚，對普通EP管進行離心的條件是10000g，3min;獲取上清后以磷 酸鹽保存液稀釋200倍，4°C保存備用;至此制得含有量子點標記抗體AbP30Linear的溶液； 所述MES緩沖液中各組分含量分別是：10.66g/LMES以及0.74g/LEDTA，所述MES緩 沖液的pH 7.4; 所述磷酸鹽保存液的制備方式是稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉、0.2 g 氯化鈉、1 g牛血清白蛋白BSA以及0.1 gNaN3,溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH 調pH至7.3后用去離子水定容至100 ml; 2) 制備結合墊 將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有量子點標記抗體AbP30Linear的溶液中1 h，取 出，25°C干燥后裁成后規格為4cm X 0 · 6cm/條后，4°C密封保存備用，至此制得結合墊； 3) 制備樣品墊 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少3 h，再置于生物安 全柜內37 °C通風干燥后，剪裁成規格為4cm X 2 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存； 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉、0.2 g 氯化鈉、2 g牛血清白蛋白BSA、1 ml吐溫-20、2 g蔗糖以及0.5 g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10， 溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至100 ml; 4) 制備檢測層 4.1) 制備兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG; 4.2) 將硝酸纖維素膜剪成4(^\4(^大小;將步驟4.1)制備得到的兔抗重組？1-把8融合 蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2.0 mg/mL及1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BIODOT劃膜儀噴頭中，設 置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BIODOT劃膜 儀噴頭中，設置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為 0.7 cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥2 h，剪裁成4cmX4cm的規格，4°C密封干燥保存； 至此制得檢測層； 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是:稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉以及 0.2 g氯化鈉，溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至 100 ml； 5)組裝檢測卡 5.1) 將底板裁剪成4cm X 7.3cm大小，備用； 5.2 )將吸水濾紙裁剪成4cm X 3cm大小，作為吸水墊，備用； 5.3) 將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4)所述的檢測層即帶有 質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面； 5.4) 將步驟5.2)準備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層右末端有 0.2 cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結 合墊按0.3 cm重疊于檢測層的左邊緣處，0.3 cm粘于底板上； 5.5) 將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.3 cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與底板 的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.0 mm寬的檢測卡， 4 °C密封干燥避光保存。4.根據權利要求2所述的抗人肺炎支原體P30蛋白抗體所形成的免疫層析試劑盒，其特 征在于:所述試劑盒是基于膠體金標記技術的免疫層析試劑盒時，所述試劑盒的制備方法 是： 1)膠體金標記抗體AbP30Linear: 1.1) 制備30 nm膠體金溶液： 取一個硅化好的250ml三角瓶，加入99ml超純水，將1 ml l%m/v HAuCl4溶液加入250ml 三角瓶中并與超純水混勻，油浴加熱并攪拌至沸騰；向250ml三角瓶中快速加入2ml l%m/v 檸檬酸三鈉水溶液，溶液繼續沸騰l〇min，待250ml三角瓶中的溶液由藍色轉變為紅色時停 止加熱，將250ml三角瓶中的溶液自然冷卻至室溫，然后向250ml三角瓶中加入超純水補齊 至100ml; 1 · 2)膠體金標記抗體AbP30Linear: 1.2.1) 取一個硅化好的50ml三角瓶，加入10 ml步驟1.1)所制備的膠體金溶液，向膠體 金液中加入240111 0.2 111〇1/11(2〇)3調節?!1至8.5; 1.2.2) 在電磁攪拌器攪拌下，將抗體AbP30Linear加入膠體金溶液中，至抗體終濃度為 10 ug/ml，加入抗體時逐滴加入，加完后繼續攪拌45 min~60 min; 1.2.3) 反應完成加入5%111八牛血清白蛋白85厶至終濃度為1%111八，攪拌15~30分鐘，41€ 保存備用； 1.2.4) 將標記好的抗體AbP30Linear取出后裝入50ml離心管，2500g，4°C離心5分鐘，得 到下層沉淀及上層清液，棄掉下層沉淀，上層清液轉移至另一只50ml離心管，12000g，4°C離 心30分鐘，得到下層沉淀及上層清液，棄掉上層清液，將下層沉淀用10 ml膠體金緩沖液重 懸沉淀，然后再12000g，4°C離心30分鐘，再次得到下層沉淀及上層清液，將下層沉淀最后用 3ml膠體金緩沖液重懸，4°C保存備用，得到含有膠體金標記抗體AbP30Linear的溶液； 所述膠體金緩沖液中各組分含量分別是：10mM Tris、l%m/vBSA、l% v/v Tween-20、5% 111八蔗糖以及3%。111八聚乙烯吡咯烷酮?￥?-10，所述膠體金緩沖液的?!1為10.5; 2) 制備結合墊 將聚酯纖維膜浸入步驟1)所得到的含有膠體金標記抗體AbP30Linear的溶液中1 h，取 出，25°C干燥后裁成后規格為4cm X 0 · 6cm/條后，4°C密封保存備用，至此制得結合墊； 3) 制備樣品墊 取玻璃纖維素膜一張，將玻璃纖維素膜在樣品墊處理液中浸泡至少2 h，再置于生物安 全柜內37 °C通風干燥后，剪裁成規格為4cm X 1 · 5cm/條后，即制得樣品墊，25 °C密封保存； 所述樣品墊處理液的制備方式是稱取〇.242g Tris、lg牛血清白蛋白BSA、1 ml吐溫-20、5g蔗糖以及0.3g聚乙烯吡咯烷酮PVP-10,溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH 調pH至11后用去離子水定容至100 ml; 4) 制備檢測層 4.1) 制備兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG; 4.2) 將硝酸纖維素膜剪成4cmX 2cm大小;將步驟4.1)制備得到的兔抗重組Pl-His融合 蛋白多克隆抗體IgG和羊抗兔IgG用磷酸鹽緩沖液調整至終濃度分別為2.0 mg/mL及1.0 mg/mL;將稀釋好的兔抗重組Pl-His融合蛋白多克隆抗體IgG裝入BI0D0T劃膜儀噴頭中，設 置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測線;將稀釋好的抗兔IgG裝入BI0D0T劃膜 儀噴頭中，設置1.0 μL/cm的量噴于硝酸纖維素膜上作為質控線，質控線與檢測線間距為 0.5cm;將噴好的硝酸纖維素膜37°C干燥18h，剪裁成4cmX2cm的規格，4°C密封干燥保存;至 此制得檢測層； 所述磷酸鹽緩沖液的制備方式是:稱取0.29 g磷酸氫二鈉、0.0295 g磷酸二氫鈉以及 0.2 g氯化鈉，溶解于90 ml的去離子水中，用1 mol/L NaOH調pH至7.3后用去離子水定容至 100 ml； 5) 組裝檢測卡 5.1)將底板裁剪成4cm X 6cm大小，備用； 5.2 )將吸水濾紙裁剪成4cm X 2.5cm大小，作為吸水墊，備用； 5.3) 將步驟5.1)制備得到的底板上的粘性保護膜揭掉，將步驟4)所述的檢測層即帶有 質控線和檢測線的硝酸纖維素膜粘貼到底板上，并抹平膜面； 5.4) 將步驟5.2)準備好的吸水墊組裝到底板上，使吸水墊的左邊與檢測層右末端有 0.2 cm的重疊，吸水墊的右邊緣則與底板的右邊緣對齊粘好并抹平;再將步驟2)所述的結 合墊按0 · 2cm重疊于檢測層的左邊緣處，0 · 4 cm粘于底板上； 5.5) 將步驟3)所述的樣品墊則按一邊0.2 cm重疊于結合墊的左邊緣處，另一邊與底板 的左邊緣對齊，粘于底板上并抹平;將組裝好的檢測板于切條機下裁成4.0 mm寬的檢測卡， 4 °C密封干燥避光保存。
【文檔編號】C07K16/12GK105859885SQ201610317422
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年5月13日
【發明人】胡征, 董俊, 楊波
【申請人】湖北工業大學, 湖北華龍生物制藥有限公司