一種新的強直性脊柱炎易感性檢測方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法和試劑盒，特別是涉及一種利用 基因型檢測強直性脊柱炎易感性的新方法和試劑盒。
【背景技術】
[0002] 強直性脊柱炎又名別赫捷列夫氏（VonBechterev)病或馬-施二氏 (Maritstrumpell)病，是一種慢性、進行性，中軸關節受累的慢性炎癥性疾病。主要影響 骨盆的骶髂關節、脊柱關節和椎旁組織。主要癥狀為下腰痛、脊椎僵硬及運動范圍受限、 X線顯示兩側骶髂關節炎（sacroilitis)為其特征。由于該病一般先侵犯骶髂關節，并重 點累及脊柱，最終導致脊柱骨性強直，故目前國內外多稱之為強直性脊柱炎（Ankglosing Spondytitis, AS)〇
[0003] 強直性脊柱炎有明顯的種族性，在不同民族中發病率的差異很大。印第安人發病 率最高，北美印第安人發病率為2. 7%~6. 3%。其次為白種人，白種人中發病率為0. 1%~ 1.4%。黃種人低于白種人，我國約為0.3%。而黑人發病率最低，約為白人的1/4,在非洲 僅為0. 2%。
[0004] 強直性脊柱炎好發于20至40歲的成年人，尤其是20~30歲的青年男性。
[0005] 強直性脊柱炎呈常染色體顯性遺傳，有明顯的家族遺傳傾向，遺傳因素>90%。 據調查，強直性脊柱炎病人親屬發病率比一般人高一倍左右，同胞復發風險比為82. 90%以 上的AS病人具有HLA-B27陽性，在正常人群中陽性率為8%;子女HLA-B27陽性占50%，發 生強直性脊柱炎的占25%。目前基本上已有定論，HLA-B27作為獨立的致病基因在AS的發 病中起作用。因為在HLA-B27陽性個體中只有1 %~5%發展成為AS，提示還有其他基因參 與AS的發病。
[0006] MIR146A基因編碼的產物屬于一種microRNA，可以在信使RNA水平調節其下游目 的基因的表達和翻譯。已有的大量研究證明，MIR146A參與了人體炎癥通路的調控，是多個 前炎癥反應的調控關鍵基因。MIR146A基因的多態性位點也被發現與多種自身免疫性疾病， 包括銀屑病，系統性紅斑狼瘡，硬化癥等相關。本發明所述的rs57095329位點與強直性脊 柱炎發病的相關性尚未有人提及。

【發明內容】

[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種新的強直性脊柱炎易感性檢測方法和試劑 盒，為輔助診斷（尤其是早期診斷）強直性脊柱炎和治療強直性脊柱炎提供基礎。
[0008] 在本發明的第一方面，提供了一種對個體的利用基因型檢測強直性脊柱炎易感性 的方法，包括步驟：
[0009] 檢測該個體的MIR146A基因和/或轉錄本，并與正常的MIR146A基因和/或轉錄 本相比較，存在差異就表明該個體患強直性脊柱炎的可能性高于正常人群。
[0010] 在另一優選例中，所述的方法中檢測的是MIR146A的基因或轉錄本，并與正常 MIR146A核苷酸序列比較差異。
[0011] 在另一優選例中，所述的差異是以下的單核苷酸多態性（SNP):
[0012] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID N0. 1。
[0013] 在本發明的第二方面，提供了一種檢測樣品是否存在MIR146A基因的單核苷酸多 態性的方法，包括步驟：
[0014] 1)用MIR146A基因特異性引物擴增樣品的MIR146A基因，得到擴增產物；
[0015] 2)檢測擴增產物中是否存在以下的單核苷酸多態性：
[0016] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID N0. 1。
[0017] 在另一優選例中，所述MIR146A基因特異性引物具有SEQ ID NO. 2和3的序列。
[0018] 在另一優選例中，所述的擴增產物的長度為100_2000bp，且含有SEQ ID NO. 1中第 659 位。
[0019] 在本發明的第三方面，提供了一種利用基因型檢測強直性脊柱炎（強直性脊柱炎 易感性）的試劑盒，其包括：特異性擴增MIR146A基因或轉錄本的引物，更佳地，所述的引物 擴增出長度為100-2000bp且含有SEQ ID NO. 1中第659位的擴增產物。
[0020] 在另一優選例中，所述試劑盒還含有選自下組的試劑：
[0021] 1)與SEQ ID NO. 1中第659位的突變結合的探針；
[0022] 2)識別SEQ ID NO. 1中第659位的突變限制性內切酶。
[0023] 在另一優選例中，所述的突變選自以下的單核苷酸多態性：
[0024] 第659位A - G ;其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID N0. 1。
[0025] 所述引物的序列，可如SEQ ID NO. 2和3所示。
[0026] 所述擴增產物的長度為100-2000bp且含有SEQ ID Ν(λ 1中第659位。
[0027] 所述試劑盒還包括：Taq酶、dNTPs、鎂離子、常規的PCR反應緩沖液。
[0028] 本發明經過深入而廣泛的研究，對大量候選基因的SNP進行了測定和分析。發 現和證明了 MIR146A的基因組序列與強直性脊柱炎密切相關，其中關聯研究結果顯示，在 MIR146A 基因的 SEQ ID NO. 1 中第 659 位的 SNP (第 659 位 A - G)(記為 rs57095329)在對 照組和病例組中的分布存在顯著性差異（P < 0. 05)，因此，可作為輔助性檢測強直性脊柱 炎（或其易感性）的特異性SNP。在此基礎上完成了本發明。
[0029] 具體而言，本發明揭示了 MIR146A基因一種單核苷酸多態性（SNP)以及該多態性 與強直性脊柱炎的相關性。本發明的SNP是SEQ ID NO. 1所示序列的第659位的G/A多態， 基因型GG在強直性脊柱炎病人群中的頻率，要低于在正常對照人群中的頻率。
[0030] 最方便的檢測本發明SNP的方法，是通過用MIR146A基因特異性引物擴增樣品的 MIR146A基因，得到擴增產物；然后檢測擴增產物中是否存在以下單核苷酸多態性：第659 位A -G，其中，核苷酸位置編號基于SEQ ID N0. 1。
[0031] 應理解，在本發明揭示了 MIR146A基因的SNP與強直性脊柱炎的相關性之后，本領 域技術人員可以方便地設計出可特異性擴增出含該SNP位置的擴增產物，然后通過測序等 方法確定是否存在第659位A -G。通常，引物的長度為15-50bp，較佳地為20-30bp。雖 然引物與模板序列完全互補是優選的，但是本領域技術人員知道，在引物與模板存在一定 的不互補（尤其是引物的5'端）的情況下，也能夠特異性地擴增（即僅擴增出所需的片 段）。
[0032] 含有這些引物的試劑盒和使用這些引物的方法都在本發明范圍之內，只要該引物 擴增出的擴增產物含有本發明SNP的對應位置。一種優選的引物對具有SEQ ID N0. 2和3 的序列。
[0033] 雖然擴增產物的長度沒有特別限制，但是通常擴增產物的長度為100_2000bp，較 佳地為150-1500bp，更佳地為200-1000bp。這些擴增產物都應含有SEQ ID NO. 1中第659 位。
[0034] 由于本發明的SNP與強直性脊柱炎具有非常高的關聯性，因而可用于早期輔助性 診斷強直性脊柱炎，而且可以未雨綢繆地使一些攜帶者在未發病前就采取合理的預防措 施，從而提高攜帶者的生存期和生存質量，因此，具有極其重大的應用價值和社會效益。
【具體實施方式】
[0035] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條 件如 Sambrook 等人，分子克隆：實驗室手冊（New York :ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0036] 實施例1
[0037] 一、研究對象
[0038] 病例樣本全部采集自門診病人，患者的診斷由仁濟醫院富有臨床經驗的風濕病科 醫師根據1984年提出修訂的紐約標準作出，并通過多次隨訪確診。對照樣本選自南方中心 樣本庫中病例組年齡、性別匹配、無關節炎病史的個體。
[0039] 在知情同意的基礎上，隨機收集了 96例AS病人和95例健康的正常對照個體的外 周血樣本。
[0040] 二、實驗方法和結果
[0041] 1、DNA 提取
[0042] 用常規酚氯仿法從人的外周血樣本中提取DNA(也可采用商業化的試劑盒，提取 DNA)，濃度校正至20ng/ μ 1后，用于常規PCR擴增。
[0043] 2、用于PCR和測序中的引物設計
[0044] 根據GenBank中MIR146A的基因組序列，設計和合成以下引物：
[0045] 有義引物 PI :5 ' -accgcagaaccaaattaacg-3 ' （SEQ ID N0. 2 所不）
[0046] 反義引物 P2 :5' -aatgaatcctcccaccatca-3 ' （SEQ ID Ν0· 3 所不）。
[0047] 3、MIR146A 基因的 PCR 擴增
[0048] 以提取的DNA為模板，用Taq酶，在GeneAmp 9700PCR儀上以Touchdown程序進行 PCR擴增。反應條件為：94°C預變性2分鐘，94°C變性30秒，63°C退火40秒，72°C延伸40 秒，共10個循環，每個循環退火溫度遞減0. 5°C;以后94°C變性30秒，58°C退火40秒，72°C 延伸40秒，共30個循環；最后72°C延伸7分鐘。
[0049] PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證。結果，獲得MIR146A基因的擴增產物。
[0050] 4、SNP的發現和檢測
[0051] PCR產物經Resin樹脂純化后，用ABI-3730DNA測序儀（美國應用生物系統公司 appl