一種克柔念珠菌熒光pcr檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種克柔念珠菌熒光PCR檢測試劑盒，包括CD?PCR反應液，所述CD?PCR反應液包括引物和熒光探針A，所述引物分為引物F和引物R，所述引物F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述引物R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述熒光探針A的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。本發明還涉及一種檢測克柔念珠菌的方法。本發明的試劑盒具有抗干擾能力強、靈敏度高、特異性強且檢測速度快、操作方便等優點。
【專利說明】
-種克柔念珠菌黃光PCR檢測試劑盒
技術領域
[0001] 本發明設及念珠菌的檢測領域，具體設及一種克柔念珠菌巧光PCR檢測試劑盒及 其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 克柔念珠菌（Candida krusei)，屬于酵母亞口芽抱菌綱，酵母目，酵母科念珠菌 屬。念珠菌屬(Candida species)是一種典型的條件致病真菌，是侵襲性真菌病（invasive 化ngal disease, IFD)的首位致病菌。念珠菌病可累及人體皮膚、黏膜及各內臟器官。侵襲 性念珠菌病更可危及生命，其中念珠菌血流感染(BSI)占醫院獲得BSI中的第4位，其粗病死 率可高達39.2% (ICU 47.1 % )。念珠菌病，尤其是侵襲性念珠菌病的早期診斷常很困難，很 容易導致延誤抗真菌治療，并影響患者預后。
[0003] 此外，念珠菌菌屬還可導致念珠菌性陰道炎，又稱外陰陰道念珠菌病 (vulvovaginal candidiasis，VVC)是在育齡婦女中普遍存在的一種由念珠菌感染引起的 外陰陰道感染。目前，念珠菌性陰道炎患病率達40%，在各種陰道炎中位居第2位，并且約 75%的健康婦女一生中也會出現念珠菌感染癥狀。對致病菌未做出明確鑒定前，若盲目使 用外用藥物，包括抗真菌制劑的濫用，會增加念珠菌的耐藥性，使生殖道內菌群素亂，致使 一些對藥物不敏感的菌群乘機大量繁殖，易誘發二重感染，提高治愈難度。因此，致病念珠 菌菌譜的準確鑒定與分型是制定高效治愈念珠菌性陰道炎方案的必要前提。
[0004] 侵襲性真菌感染主要是由念珠菌引起，白念珠菌仍占優勢，但由于預防性使用挫 類抗真菌藥物，使得住院患者念珠菌感染的流行病學發生變化，白念珠菌感染呈下降趨勢， 而對氣康挫敏感性差的非白念珠菌，尤其是對氣康挫天然耐藥的克柔念珠菌的感染則出現 升高趨勢。克柔念珠菌的毒力雖比白念珠菌弱，但它憑借對非生命物質強大的黏附力，在其 表面附著并繁殖，引起口腔、陰道及全身多系統感染，從而對患者生命構成嚴重的威脅。
[0005] 目前，針對克柔念珠菌感染治療的主要藥物有兩性霉素 B、伏立康挫和伊曲康挫。 克柔念珠菌對氣康挫先天耐藥，兩性霉素 B不良反應較大，伊曲康挫可能屬劑量依賴性敏 感。上述原因的存在使克柔念珠菌感染藥物治療的選擇窗狹小。因此，對于克柔念珠菌感染 的高危患者，必須積極治療基礎疾病，糾正貧血、低白蛋白血癥及電解質素亂；疑診患者應 早期行侵襲性下呼吸道分泌物檢測或其他體液的培養，W提高早期診斷率；同時，通過臨床 藥敏監測，指導臨床早期合理、規范用藥，切實降低克柔念珠菌感染的發病率及病死率。
[0006] 念珠菌的檢測和鑒定方法主要W形態學為依據，即通過培養或直接鏡檢陽性為指 標。直接鏡檢的方法簡單、快速，但無法鑒定到菌種且陽性率低。目前，臨床上主要通過表型 鑒定克柔念珠菌和其他念珠菌，表型鑒定包括芽管試驗、厚膜抱子形成試驗、CHR0M agar顯 色、微生物自動鑒定系統API 20C AUX、同化試驗、45°C溫度試驗等，運些方法均可在一定程 度上鑒定克柔念珠菌和白念珠菌，但上述方法在敏感性和特異性方面都不理想。下面就針 對目前常用的念珠菌檢測方法作W下簡要闡明：
[0007] ( - )傳統檢測方法，包括常規涂片鏡檢法和培養法
[0008] 1.常規涂片鏡檢是最基本的細菌學檢查方法。其優點是簡便、快速和價廉，但它只 能區分白色念珠菌與其他球菌，無法將都克柔念珠菌和白色念珠菌區分開來。
[0009] 2 .培養法:是目前臨床上確定念珠菌診斷和治療方案的重要依據，但臨床上不同 的念珠菌在沙氏培養基上生長均呈現白色菌落，所W要區分克柔念珠菌和白念珠菌一般采 用科瑪嘉(C皿OMagar)培養基培養，該培養基含有特殊顯色物質，當致病菌種比較多時，菌 落顏色不好區分，容易導致漏診。
[0010] (二)儀器自動化分析鑒定系統
[0011] 隨著儀器分析技術的進步和計算機的廣泛應用，微生物菌種鑒定進入了基于生理 生化的儀器自動化分析的鑒定系統階段。近年來，相關的酵母菌快速鑒定系統不斷面市，如 Biolog微生物自動分析系統、API 20C、ATB 32C、VITEK T0C和API Candid系統等。運些快速 鑒定系統大多數是應用于臨床酵母菌的鑒定，能鑒定的酵母菌種類較少，只適合做基礎性 研究，不利于中小型醫院的推廣使用。
[001^ (S)免疫學測定
[0013] 乳膠凝集反應、放免測定W及酶聯免疫吸附測定，也可W作為念珠菌的輔助檢測 手段，但它們的敏感性和特異性均較差，無法準確鑒定克柔念珠菌。
[0014] (四）念珠菌的現代分子生物學檢測
[0015] 近年隨著分子生物學的發展。基因分型技術因具有良好的穩定性、重復性和準確 性已廣泛應用于病原微生物檢測，大致包括測定真菌染色體DNA中GC含量、染色體組型技 術、DNA探針雜交技術、多重PCR技術、隨機擴增多態DNA(Random amplified polymo;rphic DNA，RAPD)、限制性片段長度多態性分析(RFLP)、單鏈構象多態性分析(SSCP)、脈沖場凝膠 電泳(PFGE)、PCR反向線點雜交技術(PCR-化B)和DNA序列分析等。RAPD分型法，又稱任意引 物聚合酶鏈反應(Arbitrarily primed PCR)，AP_PCR)，是一種WPCR為基礎掲示基因組多 態性的方法。該方法目前在日常醫院感染的監測與預防控制中占主導地位，但存在分辨率 低、影響因素多、重復性較差等諸多不足。
[0016] 因此，有必要發明一種快速、準確鑒別克柔念珠菌的方法，便于臨床上快速的檢測 出克柔念珠菌，從而及時有針對性地針對克柔念珠菌用藥。

【發明內容】

[0017] 本發明所要解決的技術問題是:提供一種靈敏度高、特異性強且檢測速度快的克 柔念珠菌巧光PCR檢測試劑盒，進一步提供其檢測方法，
[0018] 為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案為：
[0019] 本發明提供一種克柔念珠菌巧光PCR檢測試劑盒，包括CD-PCR反應液、人工構建的 內參照物、Taq DNA聚合酶及UNG酶，所述CD-PCR反應液包括引物和巧光探針A，所述引物分 為引物F和引物R:
[0020] 所述引物F的核巧酸序列為：
[0021] 5'-GCGGAAGGATCATTACTGTGATT-3'（沈Q ID N0.1);
[0022] 所述引物R的核巧酸序列為：
[0023] 5'-ACATTTTAGGTGTTGTTGTTTTCGTT-3'（沈Q ID N0.2);
[0024] 所述巧光探針A為：
[0025] FAM-5'-AGTACTACACTGCGTGAGC-3'-black-hole(沈Q ID N0.3);
[0026] 所述內參照物用于避免檢測結果假陰性，所述內參照物為含大腸桿菌基因 stx2A 片段的質粒，所述內參照物的引物分為內參引物F和內參引物R，所述內參照物的探針為內 參探針B:
[0027] 內參引物F的核巧酸序列為：
[002引 5'-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3'（SEQ ID N0.4);
[0029] 內參引物R的核巧酸序列為：
[0030] 5，-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3,（沈Q ID N0.5);
[0031] 內參探針B為：
[0032] Texas Red-5'-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3'-black-hole(沈Q ID N0.6)。
[0033] 進一步的，所述CD-PCR反應液還包括超純水、緩沖液、Mg2+、dATP、dGTP、dCTP及 加 TP。
[0034] 進一步的，還包括DM提取液、陰性對照W及陽性對照。
[0035] 進一步的，所述DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基酸、乙基苯基聚乙二醇W及正辛 酸，所述聚乙二醇辛基苯基酸的體積百分比為0.1-1%，所述乙基苯基聚乙二醇的體積百分 比為0.1-1 %，所述正辛酸的濃度為0.2M;所述化q DNA聚合酶的濃度為抓/化;所述UNG酶的 濃度為iu/化。
[0036] 進一步的，所述巧光探針A的5'端標記FAM巧光基團，所述巧光探針A的3'端標記 black-hole巧光澤滅基團。
[0037] 本發明還提供一種檢測克柔念珠菌的方法，W被檢測樣品的總DNA為模板，利用本 發明提供的克柔念珠菌巧光PCR檢測試劑盒進行PCR檢測。
[003引進一步的，所述PCR檢測的反應條件為：37。C-2min，94。C-2min，94。C-15sec，55。C- 45sec，循環次數為40次。
[0039] 進一步的，所述被檢測樣品可W是陰道分泌物、疲液、尿液、支氣管分泌物等拭子、 穿刺液或者胸腹水等臨床上常見的檢測樣品。
[0040] 本發明的有益效果在于：（1)利用含有與克柔念珠菌DNA祀序列結合特異性的巧光 探針及特異性擴增的引物的試劑盒對克柔念珠菌進行巧光PCR檢測，從而判斷克柔念珠菌 的存在；（2)試劑盒通過采用一管式反應，具有操作簡單、使用便利的優點；（3)本試劑盒使 用了人工構建的重組質粒作為內參照物，該重組質粒插入的DNA片段不含克柔念珠菌和人 類基因組同源DNA序列，因此可作為內參照物檢測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，加 之，lU/化的UNG酶能有效防止擴增產物的污染，避免假陽性實驗結果，從而確保PCR結果的 可信性；（4)濃度為抓/化的化q DNA聚合酶及lU/化的UNG酶同時用于試劑盒，一方面可W有 效防止擴增產物的污染，避免假陽性實驗結果，確保PCR快速擴增，同時使得試劑盒的干擾 能力增強，不易受其他細菌、真菌的影響，提高了試劑盒的靈敏，同時，該試劑盒還具有特異 性強及檢測速度快的優點，為臨床檢測克柔念珠菌并有針對性的用藥提供的新的途徑。
【附圖說明】
[0041] 圖1為本發明提供的試劑盒的特異性測試結果；
[0042] 圖2為本發明提供的試劑盒的靈敏性測試結果。
【具體實施方式】
[0043] 為詳細說明本發明的技術內容、所實現目的及效果，W下結合實施方式并配合附 圖予W說明。
[0044] 本發明最關鍵的構思在于:采用濃度為抓/化的化q DNA聚合酶及lU/化的UNG酶作 為反應試劑，對克柔念珠菌基因中特異性核巧酸序列進行PCR擴增檢測，W提高檢測的抗干 擾性及靈敏度，并人工構建特定的內參照物，準確反應檢測是否成功，從而判斷臨床采集的 樣本中是否存在克柔念珠菌。進而方便臨床醫生指導克柔念珠菌感染患者用藥及預后治 療。
[0045] 上述克柔念珠菌基因中特異性核巧酸序列為18S rRNA序列。
[0046] 本發明設計了一種利用巧光PCR方法檢測克柔念珠菌的試劑盒。本發明提供的試 劑盒包括與克柔念珠菌DNA祀序列結合特異性的巧光探針，特異性擴增的引物及各種試劑 成分。
[0047] 巧光PCR(Fluorescent PCR)是一種W核酸擴增技術為基礎的分子生物學診斷技 術，其原理是:探針的5'末端有巧光基團，而3'末端則有巧光澤滅基團（black-hole)。在未 進行延伸反應時巧光基團發射的巧光因與3'端的澤滅劑接近而被澤滅，在延伸反應時，聚 合酶的5'外切酶活性將探針切斷，使得巧光基團與澤滅劑分離，發射巧光。標記在探針上的 兩種巧光基團所發出巧光信號的變化可W反映 PCR擴增產物的數量變化，從而使得巧光PCR 技術可W起到實時檢測的目的。運樣，一分子的產物生成就伴隨著一分子的巧光信號的產 生。隨著擴增循環數的增加，釋放出來的巧光基團不斷積累，通過光電傳導系統直接探測 PCR擴增過程中巧光信號的變化，最后通過標準曲線對模板進行定量分析。該技術有耗時 短、全封閉反應、無污染、無需PCR后處理、特異性強、靈敏度高、實時檢測、重復性好等特點， 采用該技術檢測樣本無需進行真菌培養可直接進行臨床檢測，非常適合念珠菌運類生長緩 慢真菌的快速檢測診斷。
[0048] UNG酶防污染技術原理:在擴增過程中W脫氧尿巧(d-UTP)代替脫氧胸巧(d-TTP)， 從而得到含有d-UTP的擴增產物。由于擴增產物的量大且非常容易W氣溶膠的形式擴散，所 W實驗室即使嚴格分區，也難免會受到污染。尿巧酶(UNG)能特異地破壞含有d-UTP的核酸， 使之不能作為擴增模版，在擴增反應前加入UNG酶，破壞反應液中含有d-UTP的核酸。隨后將 UNG酶滅活，再進行擴增，從而有效地防止實驗室內擴增產物的污染，避免假陽性的出現。
[0049] 濃度為抓/化的化q DNA聚合酶及lU/化的UNG酶同時用于試劑盒，一方面可W有效 防止擴增產物的污染，避免假陽性實驗結果，確保PCR快速擴增，同時使得試劑盒的干擾能 力增強，不易受其他細菌真菌的影響，提高了試劑盒的靈敏度。
[0050] 內參照原理:試劑盒設置了內參照物，所述內參照物為人工構建的重組質粒，該重 組質粒插入的DNA片段不含克柔念珠菌和人類基因組同源DNA序列，因此可作為內參照物檢 測每次PCR反應中是否有PCR抑制物存在，從而確保PCR結果的可信性。當內參照結果為陽 時，表示PCR反應體系W及操作正常。因此當目的基因結果為陰時，內參照結果為陽就顯得 十分重要了。但當目的基因為陽時，內參照的擴增曲線較目的基因擴增曲線要推遲，或是內 參照結果為陰都是正常的。但是目的基因和內參照基因結果都為陰時，該實驗將無效，需再 重復。
[0化1]實施例1
[0052] 本發明提供的巧光PCR技術檢測克柔念珠菌的試劑盒，可用來檢測臨床采集的樣 本中是否存在克柔念珠菌，從而指導念珠菌感染病人的用藥及預后治療。下面將詳細闡述 本發明提供的試劑盒所采用的各個成分。
[0053] ( - )設計用于檢測克柔念珠菌的祀序列、引物及探針
[0054] 1.篩選用于檢測克柔念珠菌的祀序列
[0055] 本發明人選取得到特異性針對克柔念珠菌的祀序列，該祀序列所處基因片段位置 如569 10^.7所示（位于第54-74堿基）。克柔念珠菌188'3難序列的直接來源為 GeneBank，該數據庫記載著來自于70000多種生物的核巧酸序列的數據庫。每條紀錄都有編 碼區（CDS)特征的注釋，還包括氨基酸的翻譯。GeneBank數據庫中的數據來源有S種：1.直 接來源于測序工作者提交的序列；2.與其它數據機構協作交換的數據;3 .美國專利局提供 的專利數據，由于存在運=種途徑，GeneBank數據庫也未對其數據的來源途徑進行過公開 發表，所W發明人無法了解到該序列的原始來源。SEQ ID NO.7中第27-49個堿基對應正義 引物的核酸序列，第77-101個堿基對應反義引物的核酸序列，第54-74個堿基對應探針的核 酸序列。
[0056] 2.設計用于檢測克柔念珠菌的特異引物
[0057] 方法如下:根據上述克柔念珠菌18S rRNA序列中特異的基因片段W及篩選出來的 祀序列，利用DNAMAN軟件及Premier 5根據設計好的條件如退火溫度等設計出檢測克柔念 珠菌的特異性引物，并委托sigma公司合成而得：
[0化引 引物F: 5 ' -GCGGAAGGATCATTACTGTGATT-3 '（沈Q No. 1)
[0059] 引物R: 5 ' -ACATTTTAGGTGTTGTTGTTTTCGTT-3 '（沈Q No. 2)
[0060] 3.設計用于檢測克柔念珠菌的探針
[0061] 針對上述引物W及祀基因，設計出與克柔念珠菌祀基因特異性結合的探針，其序 列如下：
[0062] 探針序列：5'-AGTACTACACTGCGTGAGC-3'（SEQ No.3)
[0063] 探針:FAM-5 ' -AGTACTACACTGCGTGAGC-3 ' -black-hole
[0064] 在該序列的5'端具有FAM巧光基團，FAM是-6-簇基巧光素，其激發波長為492皿，在 518nm處具有最大吸收光波。在該序列的3'末端裝備有巧光澤滅基團black-hole。
[0065] (二)試劑盒的組成及制備
[0066] 表1試劑盒的各組成成分 「mA7l

[0068] 1.所用材料的制備：
[0069] (1)清洗液A的配制（10X濃縮）（1L):清洗液A的濃度可W在0.1-0.5mol/L的范圍 內。在本發明提供的【具體實施方式】中，NaOH的濃度為0.3mol/L，具體制備方式是用精密電子 天平準確稱取12.000g NaOH完全溶解于900mL純化水中，容量瓶定容至1L，制得。
[0070] (2)清洗液B的配制（10 X濃縮）（1L):向800mL純化水中加入1M化iS-HC1 (抑值為 8.0) 100血，0.5M邸TA(pH值為8.0)20mL，充分混勻，調節抑值至8.0。加水至lOOOmL，高壓滅 菌或0.22WI1膜過濾處理。
[0071] (3)DNA提取液的配制（1L): DNA提取液包括聚乙二醇辛基苯基酸(Tri ton X-100)、 乙基苯基聚乙二醇(NP-40)W及正辛酸。聚乙二醇辛基苯基酸(Triton X-100)是一種非離 子型表面活性劑，屬于市售產品。乙基苯基聚乙二醇(NP-40)是生物領域中常用的裂解液， 也屬于市售產品。Triton X-100在DNA提取液中所占體積百分比為0.1-1 %，NP-40所占體積 百分比為0.1-1%，正辛酸的濃度為0.2111〇1/1。表2示出本發明提供的【具體實施方式】中的0魁 提取液的組成成份、配比及其制備方法：
[0072] 表 2
[0073]
LOOM」其中，正辛酸的配制：用精密電子天平準確稱取正辛酸28.8480g，完全溶解于 900mL純化水中，加入5mL Triton X-100及3mL NP-40后，容量瓶定容至1L。
[0075] 提取固形物的配制:取直徑為0.5mm和1.0mm兩種玻璃珠，按質量配比約為:0.5mm: 1.0mm = 9:1的比例配制出提取固形物，每管約0.15g分裝。
[0076] (4)內參照物
[0077] 運里所指內參照物為人工構建的重組質粒，該重組質粒插入的DNA片段不含克柔 念珠菌和人類基因組同源DNA序列，因此可作為內參照物檢測每次PCR反應中是否有PCR抑 制物存在，從而確保PCR結果的可信性。
[0078] 當內參照結果為陽時，表示PCR反應體系W及操作正常。因此，當目的基因結果為 陰時，內參照結果為陽就顯得十分重要了。但當目的基因為陽時，內參照的擴增曲線較目的 基因擴增曲線要推遲，或是內參照結果為陰都是正常的。
[0079] 但是目的基因和內參照基因結果都為陰時，該實驗將無效，需再重復。
[0080] 本發明提供的【具體實施方式】中的內參照物質粒插入DNA序列為含大腸桿菌基因 stx2A 片段，核酸序列為:GGGACCACATCGGTGTCTGTTATTAACCACACCCCACCGGGCAGTTATTTTGCTGT GGATATACGAGGGCTTGATGTC。該序列信息來自 GeneBank 數據庫。
[0081 ]內參引物F:
[0082] 5 '-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3 '（SEQ No.4)
[0083] 內參引物R:
[0084] 5 '，-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3 '（沈Q No. 5)
[00化]內參探針序列：
[0086] 5 '-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3 '（SEQ No.6)
[0087] 內參探針：
[0088] Texas Red-5'-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3'-black-hole
[0089] 在該序列的5'端具有Texas Red巧光基團，其激發波長為595皿，在615皿處具有最 大吸收光波。
[0090] (5)陽性對照：陽性對照為含目的片段的質粒。
[0091] (6)陰性對照:濃度為lOmM Tris-肥l，lmM邸TA且抑=8.0的溶液。
[0092] 2.擴增反應用材料的制備
[0093] 首先依據表3的配比和配制量，計算并按序號依次加入相應的下列組份物質制得 CD-PCR反應液。
[0094] 表3 (4) -PCR反應液的組成成份及比例 「nn〇f；1
[0096] 其中的（4)-引物F、（4)-引物R、（4)-探針是指本發明提供的引物F、引物R及探針。 然后按照0.扣L/管的濃度取化q DNA酶加入(4)-PCR反應液中，混勻；按0.化L/管的濃度將 尿喀晚-N-糖基化酶(UNG酶)加入到(4)-PCR反應液中，充分混勻。Mg2可W用MgCl2來引入。 化q DNA聚合酶購于化kara寶生物工程(大連)有限公司，其中附帶10 X緩沖溶液及MgCl2; UNG酶購于promega普洛麥格生物技術有限公司。
[0097] (=)利用本發明提供的試劑盒檢測樣品中的克柔念珠菌
[0098] 1.處理生物樣品
[0099] 疲液:取疲液1.5mL向玻璃管中加入4倍體積的1 X清洗液A，搖勻，室溫放置15~ 30min待液化;取液化后的標本ImL至1.5血離屯、管，13000;r/min離屯、5min;棄上清液，沉淀加 清洗液B 1血混勻，1300化/min離屯、5min;棄上清液，沉淀加清洗液B ImL混勻，13 00化/min 離屯、5min;棄上清液，沉淀中加入10化L DM提取液，備用。
[0100] 尿液:搖勻尿液，取1. OmL于1.5mL離屯、管，13000;r/min離屯、5min;棄上清液，沉淀 (沉淀如不明顯，可再加入尿液樣本重復前步驟）加清洗液B ImL混勻，13000r/min離屯、 5min;棄上清液，沉淀中加入10化L DNA提取液，備用。
[0101] 血液:從血培養瓶取1(K)化于1.5mL離屯、管中加入ImL清洗液A，顛倒管子混勻后室 溫靜置5min，13000;r/min離屯、5min;棄上清液，沉淀加清洗液BlmL混勻，13000;r/min離屯、 5min;棄上清液，沉淀(如沉淀呈現紅色，重復上述步驟)加清洗液B 1血混勻，13000;r/min離 屯、5min;棄上清液，沉淀中加入10化L DNA提取液，備用。
[0102]陰道分泌物等拭子：加入ImL清洗液B ImU保證清洗液能沒過無菌拭子取樣部 位），將標本管用振蕩器高速振蕩2min制成標本懸浮液。取出全部懸浮液放入1.5mL離屯、管 中，13000;r/min離屯、5min棄上清液，加入ImL清洗液B振蕩重懸，13000;r/min離屯、5min;棄上 清液，加入10化L DNA提取液將沉淀重懸。
[01 03] 穿刺液、胸腹水:搖勻，取1. OmL至1.5mL離屯、管，13000;r/min離屯、5min;棄上清液， 沉淀加清洗液B ImL混勻，13000;r/min離屯、5min;棄上清液，沉淀中加入10化L DNA提取液， 備用。
[0104] 2. DNA的提取
[0105] 2.1檢測樣本的制備：向上述處理好的各樣本管中分別加入1管提取固形物(輕彈 管底盡量將固形物倒凈），用強力振蕩器（如美國BioSpec Mini-Bea化eater-ie或Vo;rtex- Genie)高速滿旋振蕩5min，瞬時離屯、，加入20化內參照。
[0106] 2.2陰性對照樣本的制備：取出陰性對照aXTE，即濃度為10mM化is-HCl，lmM 抓TA且PH=8.0的溶液），800化/min離屯、數秒，吸取100化至1.5mL滅菌離屯、管中，加入20化 內參照。
[0107] 2.3陽性對照樣本的制備:取出含目的片段的質粒作為陽性對照，80(K)r/min離屯、 數秒，吸取1(K)化至1.5mL滅菌離屯、管中，加入20化內參照。陽性對照為含目的片段的質粒。
[0108] 內參照和陽性對照均為本公司自制，方法是分別用內參和陽性對照的引物擴增出 內參stx2A及克柔念珠菌的目的基因，通過重組DNA方法將stx2A及克柔目的基因導入質粒， 將該質粒經轉化導入大腸桿菌，提取重組菌的質粒，經測序鑒定導入序列無誤后，標定并定 量后即為內參及陽性對照。
[0109] 3.將待測樣本、陽性對照樣本和陰性對照樣本瞬時離屯、后95 °C干浴2min，立即放 置冰浴中2-5min，然后13000r/min離屯、Imin;取上清液用于PCR擴增。
[0110] 4.加樣：向準備好的PCR反應管中分別加入扣L待測樣本或陰性對照樣本或陽性對 照樣本，蓋緊管蓋后瞬時離屯、，用于PCR擴增。
[01川 5. PCR擴增:將準備好的PCR反應管放置于PCR儀上，編輯樣本信息并按下列條件 進行擴增反應：
[0112]
[0113] 眾所周知，PCR反應中反應條件的設置對擴增效率、巧光值等對檢測結果的判讀的 影響很大，本試劑盒PCR反應條件的最佳反應條件如上所述，循環可W進行40次，也可根據 實踐需求，設置不同的循環次數。
[0114] 6.參考值(參考范圍）的確定:利用儀器配套軟件進行自動分析，得到各樣品的Ct 值，結果如表4所示：
[0115] 表4參考范圍的測定
[0116]
[0117] 7.檢驗結果的解釋
[0118] 7.1結果分析條件設定
[0119] STRATAGE肥基線設定:選擇"適合基線(Adaptive baseline)"設定時的巧光信號。 闊值(threshold)設定原則W闊值線剛好超過正常陰性對照品擴增曲線(無規則的噪音線） 的最高點，即Ct劇觸韶1=40或者"No Ct"為準。
[0120] 7.2.檢測結果的質量標準
[0121 ]利用本試劑盒對樣品進行檢測時，陰性對照（陰性質控品）、陽性對照（陽性質控 品)應同時滿足W下條件，否則視為檢測結果無效：
[0122] 陰性對照（陰性質控品）：克柔念珠菌(FAM)Ct值=40或者"No Ct"(Mx3000P)且內 參照(Texas RecOCt值<40,且具有較好的對數增長曲線。
[0123] 陽性對照（陽性質控品）：克柔念珠菌(FAM)Ct值《30,且有較好的對數增長曲線； 內參照（Texas Red)Ct值《40。
[0124] 8.結果判定
[0125] 克柔念珠菌陰性：克柔念珠菌（FAM)Ct值=40或"No Ct"()Mx3000P)且內參照 (Texas RecOCt值<40,且有較好的對數增長曲線，則克柔念珠菌的DNA含量小于檢測下限。 [01%]克柔念珠菌陽性：克柔念珠菌(FAM)Ct值<40,且有較好的對數增長曲線；內參照 (Texas Red)Ct值<40。
[0127] 反應無效：克柔念珠菌（FAM)Ct值=40或者"No Cf'（Mx3000P);且內參照（Texas Red)Ct值=40或者"No Ct"(Mx3000P)。
[0128] (四）試劑盒的特異性測試
[0129] 1.采用的材料
[0130] 用于檢測的菌株直接購自于中國生物制品檢定所(簡稱中檢所），其原始來源為中 國醫學微生物菌種保藏管理中屯、(CMCC)。
[0131] 假絲酵母菌菌株參比品部分購自中國醫學微生物菌種保藏管理中屯、(CMCG)或美 國典型菌種保藏中屯、(ATCC)，每次取一管進行實驗來驗證本試劑盒的檢測特異性，如表5.1 和5.2所示；
[0132] 實驗所用焚光PCR儀的型號為STRATAGENE Mx3000P，振蕩器的型號為Vortex Genie 2〇
[0133] 表5.1細菌類參比品：（購于中檢所） 「ni
[013引2.試劑盒特異性的檢測：
[0139] 利用本發明提供的試劑盒檢測表5.1和5.2所列菌種，檢測該試劑盒的特異性，具 體方法步驟如下：
[0140] 試劑準備:將化q DNA聚合酶和尿喀晚N-糖基化酶(UNG酶)進行瞬時離屯、后，放于- 20°C冰箱中備用，按表6配制反應試劑；
[0141] 表6 「01421
[0143] 樣本處理:將各樣本菌液分別用加樣器吸取1(K)化加入1.5mL離屯、管，離屯、去上清；
[0144] 向上述樣品管中加入ImL清洗液A，顛倒管子混勻后室溫靜置5min，13000r/min離 屯、5min，小屯、吸棄全部上清。加 ImL清洗液B，振蕩懸浮細菌，在13000;r/min離屯、3min，小屯、吸 棄全部上清。如沉淀呈現渾濁，需重復該步驟。
[0145] 各加入10化L DNA提取液后振蕩懸浮沉淀；各加入1管提取固形物(輕彈管底盡量 將固形物倒凈），用強力振蕩器高速旋滿振蕩lOmin，瞬時離屯、后在95°C干浴5min，冰浴 2min，瞬時離屯、;吸取上清液用于PCR擴增；
[0146] 加樣:如下表7所示，按樣本量配制試劑后均勻分裝于PCR反應管然后用石蠟封液， 向準備好的PCR反應管中分別加入扣L待測樣品或陰性對照樣品或陽性對照樣品或僅將反 應液分裝作為NTC，蓋緊管蓋后瞬時低速離屯、。
[0147] PCR擴增:將準備好的PCR反應管放置于PCR儀上，編輯樣本信息并按后附反應條件 設置參數，進行擴增反應。
[014引表7
[0152] 3.實驗結果:從圖1的檢測結果可W看出，利用本發明提供的試劑盒檢測9個細菌 類參比品及14個真菌類參比品均未顯示有擴增曲線，而陽性對照出現明顯的擴增曲線，說
[0149] 0150 0151
[0150]
[0151] 明本發明提供的試劑盒具有非常好的特異性。
[0153] (五)試劑盒的靈敏性測試
[0154] 靈敏性測試中具體操作與特異性實驗的樣品處理步驟相同，靈敏性測試的標準品 為含目的片段的質粒（即含有克柔念珠菌祀序列的質粒），其濃度標定方法是:取提純的質 粒，紫外分光光度法測定其0D值，根據所測0D值計算其含有目的片段的拷貝數，然后按照實 驗梯度稀釋成 1〇6、1〇5、1〇4、1〇3、l〇2copies/血。
[0155] W光學顯微鏡血球計數板詳細定量后的質粒標準品稀釋梯度，W克柔念珠菌檢測 試劑盒進行提取檢測，實驗結果如下：
[0156] 圖2是MX3000PPCR儀擴增曲線圖：分別為1〇6、1〇5、1〇4、1〇3、1〇2(3〇口163/血，為確保實 驗的準確性，每個濃度都做了復管（即一個濃度下分別準備=個測試管），由實驗結果可W 看出該試劑盒可W確保5xl02copies/mLW上的標本被檢出。
[0157]從W上實驗結果中可W看出，本試劑盒的靈敏度能達到5xl02copies/mL。探針5' 端FAM巧光標記，3'端black-hole標記，用核酸擴增儀檢測巧光強度，提高了檢測靈敏度。
[0158] (六)試劑盒的快速性檢測
[0159] 采用本發明提供的試劑盒進行檢測，從樣本DNA提取到巧光PCR實驗結果分析僅需 要2.5個小時就能完成，運是本試劑盒的一大優勢。而且整個試劑盒檢測過程中采用了一管 式反應，與其他生化、分子檢測方法相比具有很大的技術優勢。
[0160] 本試劑盒具有的特點：
[0161] 1、DNA提取效果好；
[0162] 2、抗干擾能力強，不易受其他細菌、真菌的干擾，具有很高的靈敏度與特異性；
[0163] 3、操作簡單方便、快速檢測(耗時2.化）；
[0164] 4、結果客觀可靠，儀器自動收集和分析數據。
[0165] W上所述僅為本發明的實施例，并非因此限制本發明的專利范圍，凡是利用本發 明說明書及附圖內容所作的等同變換，或直接或間接運用在相關的技術領域，均同理包括 在本發明的專利保護范圍內。
【主權項】
1. 一種克柔念珠菌熒光PCR檢測試劑盒，包括⑶-PCR反應液、人工構建的內參照物、Taq DNA聚合酶及UNG酶，其特征在于，所述CD-PCR反應液包括引物和熒光探針A，所述引物分為 弓丨物F和引物R: 所述引物F的核苷酸序列為:5 ' -GCGGAAGGATCATTACTGTGATT-3 ' ； 所述引物R的核苷酸序列為:5'-ACATTTTAGGTGTTGTTGTTTTCGTT-3' ； 所述熒光探針 A為:FAM-5 ' -AGTACTACACTGCGTGAGC-3 ' -black-hole; 所述內參照物用于避免檢測結果假陰性，所述內參照物為含大腸桿菌基因 stx2A片段 的質粒，所述內參照物的引物分為內參引物F和內參引物R，所述內參照物的探針為內參探 針B: 內參引物F的核苷酸序列為:5'-GGGACCACATCGGTGTCTGT-3' ； 內參引物R的核苷酸序列為:5'-GACATCAAGCCCTCGTATATCCA-3' ； 內參探針B為：Texas Red-5 '-ATTAACCACACCCCACCGGGCAGT-3 '-black-hole〇2. 根據權利要求1所述的一種克柔念珠菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述CD-PCR反應液還包括超純水、緩沖液、Mg2+、dATP、dGTP、dCTP及dUTP。3. 根據權利要求1所述的一種克柔念珠菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，還包括DNA 提取液、陰性對照以及陽性對照。4. 根據權利要求1所述的一種克柔念珠菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA提 取液包括聚乙二醇辛基苯基醚、乙基苯基聚乙二醇以及正辛酸，所述聚乙二醇辛基苯基醚 的體積百分比為0.1-1%，所述乙基苯基聚乙二醇的體積百分比為0.1-1%，所述正辛酸的 濃度為〇. 2M;所述Taq DNA聚合酶的濃度為5U/yL;所述UNG酶的濃度為lU/yL。5. 根據權利要求1所述的一種克柔念珠菌熒光PCR檢測試劑盒，其特征在于，所述熒光 探針A的5 '端標記FAM熒光基團，所述熒光探針A的3 '端標記black-hole熒光淬滅基團。
【文檔編號】C12Q1/68GK106048051SQ201610589461
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月25日 公開號201610589461.6, CN 106048051 A, CN 106048051A, CN 201610589461, CN-A-106048051, CN106048051 A, CN106048051A, CN201610589461, CN201610589461.6
【發明人】蔡曉沂, 翟燕紅, 王校, 趙娜, 鐘鎬鎬
【申請人】泰普生物科學（中國）有限公司