專利名稱：腫瘤相關基因檢測方法
技術領域：
本發明涉及核酸的檢測，更具體而言涉及利用生物芯片檢測腫瘤相關基因的方法。
背景技術：
惡性腫瘤—癌癥是一種常見且嚴重威脅人類生命的疾病。國內外近年的統計資料顯示，腫瘤疾病已成為僅次于心血管疾病的世界第二號“殺手”，且腫瘤發病率仍有逐年增加的趨勢。據國家衛生部門統計，九十年代我國腫瘤發病率已上升為0.127％。近幾年來每年新增腫瘤病人200萬人，死亡130萬人左右，目前全國腫瘤患者總數估計在450萬人左右。雖然近年來世界各國在腫瘤疾病研究方面已取得較大的進展，但總體上對腫瘤細胞的病變和轉移以及藥物對腫瘤細胞的作用機理等還不十分清楚，所以到目前為止仍以預防和早期診斷、早期治療為主。因此，本領域迫切需要一種對腫瘤疾病進行早期診斷和研究的方法和工具。
生物芯片技術是20世紀90年代發展起來的一項高新技術，其高通量、快速、高效地分析生物信息的能力使其在揭示腫瘤發生、發展的規律，在腫瘤早期診斷、個體化治療及預后判定等方面具有其他方法不可比擬的優勢，因而也被視為人類攻克癌癥等惡性疾病的新希望。同時可望使惡性腫瘤的早期診斷、藥物篩選、基因突變確認，以及及時、快速、準確地預測腫瘤的轉移復發等醫學研究領域發生革命性進步，從根本上提高腫瘤診斷和治療水平。
采用生物芯片檢測腫瘤相關基因，從而實現對惡性腫瘤的早期診斷，這是提高惡性腫瘤的治療效果和預后的行之有效的途徑。目前利用生物芯片檢測腫瘤相關基因一般包括以下四個步驟①芯片構建 目前構建的用于腫瘤研究的生物芯片的主要類型有表達譜cDNA芯片、蛋白質芯片等。方法是分別采用基因的隨機克隆片段及選擇特定的蛋白質分子(如腫瘤標志物)，并使DNA片段或蛋白質分子按一定順序固定在固相支持物上形成的陣列。
②樣品制備 生物樣品一般不能直接與芯片反應。必須將樣品進行提取、擴增，獲取其中的DNA或RNA，然后進行標記。目前常用的標記物為放射性物質或熒光物質。
③分子雜交反應 標記的樣品與芯片上的探針進行反應并產生生物信息的過程。芯片的分子雜交反應是關鍵一步，選擇合適的反應條件能使分子雜交反應處于最佳狀態，以減少生物分子之間的錯配率和提高雜交反應的特異性。
④信號檢測和分析 將芯片置入掃描儀中，通過采集各反應點的信號位置、強弱，再經相關軟件分析圖像，將信號轉換成數據，獲得有關生物信息。
目前，利用生物芯片檢測腫瘤相關基因的方法存在以下缺點。
●表達譜cDNA芯片可用于研究致腫瘤疾病的新基因或基因突變確認，但對于多基因影響的腫瘤疾病的早期診斷、藥物篩選、以及及時、快速、準確地預測腫瘤的轉移復發等還缺乏現實意義。而蛋白質芯片測定的是相關的腫瘤標志物，往往在獲得確定的結果時，腫瘤已發展到中晚期。
●用于探針標記的放射性物質或熒光物質對人體和環境均具有一定的危害性。標記的模板RNA為mRNA，mRNA的分離純化過程較煩瑣，且mRNA本身在此過程中易被降解。
●探針與芯片的雜交結果需要用昂貴的激光共聚焦掃描儀進行判讀，較高的成本影響了芯片的實際應用。

發明內容
針對現有技術的上述缺點，本發明的目的是提供一種新的利用生物芯片檢測腫瘤相關基因的方法。
為達成上述目的，發明人進行了深入廣泛的研究，最終完成了本發明。本發明以Genebank等公用數據庫為基礎，從中篩選出特定的腫瘤相關基因CDS序列，人工合成其特異性的cDNA片段為探針，大量集成固定在固相支持物上形成腫瘤相關基因DNA陣列，然后從樣品中提取RNA，通過逆轉錄反應一步完成逆轉錄和標記，將地高辛標記到樣品cDNA片段上，再使標記的樣品cDNA片段與腫瘤相關基因DNA陣列在適宜的條件下雜交，芯片雜交結果可直接用肉眼觀察或用掃描儀進行定量分析。
本發明的檢測方法包括三個步驟將選定的腫瘤相關基因片段固定在固相載體上制備檢測用芯片；由樣品中提取總RNA并一步完成逆轉錄和標記；使標記的樣品cDNA片段與檢測芯片在適宜條件下雜交并讀出雜交結果。
本發明的方法中用一次逆轉錄反應標記多個腫瘤基因探針，并以樣品總RNA作為檢測樣本，可方便有效地檢測樣品中是否存在腫瘤相關基因，從而實現腫瘤疾病的早期診斷，揭示腫瘤發生、發展的規律。而且，反應結果可用肉眼判斷，可極大地降低腫瘤疾病研究和分析診斷的成本。
具體實施例方式
實施本發明方法時首先要制備檢測用芯片。本發明中所使用的芯片是在固相載體上固定腫瘤相關基因片段形成的。本發明的檢測用芯片可以使用本領域技術人員熟知的常規載體制備，例如玻璃片、尼龍膜、硅片等均可用作本發明檢測用芯片的載體。載體上固定的腫瘤相關基因可以是已知的任何腫瘤相關基因，這些腫瘤相關基因可以從諸如Genebank等公共數據庫中獲得。
在本發明的一個實施方案中，從Genebank等人類基因組公用數據庫中篩選出一系列腫瘤相關基因，以其特異的編碼序列(CDS)為對象，通過計算機輔助搜索，以編碼序列中最后的100個堿基的5’端起，向3’端方向人工合成一段80nt的堿基序列，用作腫瘤基因檢測芯片的cDNA探針，連同看家基因一起固定在固相載體上，制備成腫瘤基因芯片。選擇最后的100個堿基主要考慮到逆轉錄反應的起始效應，逆轉錄反應的5’端向3’端延伸時，先合成的cDNA片段即是與固定在膜上的80nt的堿基序列互補的一段，因此，這樣的選擇有利于后面的雜交步驟。
在本發明的優選實施方案中，本發明的檢測用芯片上固定有80個腫瘤相關基因和2個看家基因，這些基因及其5’端向3’端的80個核苷酸序列見以下表1。表1本發明的芯片中使用的腫瘤相關基因、看家基因及其5’端80nt序列腫瘤相關基因名稱序列號5’-80nt序列AAACACACCAAGCTTTTGAAACCATGTTCCATGACTCCAGCATTTCTGAAGAGGTAGCAbl-2SD01 TGAGGAGCTTGGGAGAGCCGCCCGGCCCAGATGATCACCATCACACCACCTGACCAAGATGACAGCATGGAGTGTGTGGAkt1 SD02 ACAGCGAGCGCAGGCCCCACTTCTAACAACACAAAGAAGCGAGATTCCAAAACTGACAGCACAGAATCCAGTGGAACCCAAPC SD03 AAGTCCTAAGCGCCATTCTGGGTBcl2 SD04 TATAAGCTGTCGCAGAGGGGCTACGAGTGGGATGCGGGAGATGTGGGCGCCGCGCC
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在本發明的優選實施方案中，腫瘤基因檢測芯片為多斑點的膜芯片，點樣直徑為0.15-0.2mm的斑點，膜芯片的大小為8.5cm長×5.5cm寬。腫瘤基因點樣為80個，以平行重復點樣，對照基因點樣為2個看家基因。共計167個點。
實施本發明的檢測方法中的第二個步驟是提取樣品總RNA，逆轉錄并同時進行地高辛標記。這里所述的樣品可以是任何生物樣品，包括血液、組織等。由樣品中提取總RNA可以使用本領域技術人員熟知的任何方法。
在本發明的檢測方法中，對樣品總RNA進行逆轉錄過程中同時完成標記。本發明中可以使用無污染、對人體無害的任何標記方法。在本發明的優選實施方案中使用的是地高辛標記。逆轉錄過程中所用的逆轉錄引物為針對上述腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物以及12-18nt的寡聚胸腺嘧啶(oligo dT)引物，其中12-18nt的寡核苷酸引物與20nt的反向引物聯合應用。20nt的引物可結合于腫瘤相關基因特異性片段上，從而引發DNA合成反應。12-18nt的寡核苷酸引物-oligodT可結合于腫瘤相關基因mRNA的polyA+區域，從而引發DNA合成反應。其聯合應用可提高逆轉錄反應的效率。20nt反向引物為編碼序列最后100個堿基的3’端起向5’端方向的20個堿基的互補序列。
事實上，一步完成逆轉錄和標記反應的關鍵在于調整各引物組合的反應濃度和避免各引物組合間的同源性即各引物組合間自身結合的可能性。通過計算機輔助篩選，可以使各引物成為特異性引物，從而僅對自身區域內的序列引發反應。
在本發明的優選實施方案中，使用的針對上述腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物見以下表2。
引物序腫瘤相關基因名稱 號 20nt的反向引物Abl-2 PN01GGAACAACAGATGACGAGGAAkt1 PN02GCCGAGTAGGAGAACTGGGGAPCPN03AACAGATGTCACAAGGTAAGBcl2 PN04CGGGCTGCGAGGAGAAGATGBcrPN05CCTGCTCGATGTCGCCCACTBmi1 PN06CAACCAGAAGAAGTTGCTGABRCA1 PN07AGTAGTGGCTGTGGGGGATCBRCA2 PN08TATTTTTTAGTTGTAATTGTc-abl PN09ACTCCTCGGCGGGGCCCTTGCBL(c-cbl) PN10CCTAGGCTGAGAATTCTCCTCdk4 PN11AGGCAGAGATTCGCTTGTGTCotPN12TCAGCCATATTCAAGCGTTGCyclin D3 PN13GCAGGCAGTCCACTTCAGTGdblPN14CATGAGGGGCCTATTTTCTTDCCPN15AAGGCTGAGCCTGTGATGGCEGFR PN16TGCTCCAATAAATTCACTGCEgr 1 PN17AGCAAATTTCAATTGTCCTGERbB2(c-erbB2) PN18GCACGTCCAGACCCAGGTACEts1 PN19TTTCAAAAGAGTCCTGGCCCEts2 PN20CCGCACCGTTCTCAGGGGAGFERPN21CTATGTGAGTTTTCTCTTGAFES(c-fes)PN22 GCTCCTGGTAGATGGTGCTGFLI-1 PN23 CTAGTAGTAGCTGCCTAAGTFLT-1 PN24 GGTGGGGTGGAGTACAGGACFMS(c-fms)PN25 CTGATAGTTGTTGGGCTGCAfos(c-fos)PN26 TGGGCTCAGGGTCATTGAGGgli PN27 TAGGCACTAGAGTTGAGGAAING1 PN28 CTATTTCTTCTTCCGTTCTTJun(c-jun)PN29 TGTTTGCAACTGCTGCGTTAJunB PN30 GGCCCAAGCCCAGCTGCGCCJunD PN31 ACGGCGGGCTCTCGCCGAAGKit(c-kit)PN32 CAGACATCGTCGTGCACAAGLCK(c-Lck)PN33 AGAGCCGAACCAGCCGCTGGMaf(c-maf)PN34 ATTTTGTGAACACACTGGTAMas(c-mas)PN35 GTTCCCAAAGGTCGACCAATMDM2 PN36 TATCTCCCTTATTACACACAMet(c-met)PN37 CCCAGCACATATTTCAGACTMos(c-mos)PN38 CAGCCGAGTTCAGCTTTCAAMpl(c-mpl)PN39 TCAAGGCTGCTGCCAATAGCMyb(b-myb)PN40 CAAGTCCAGGGCTTCAGAGAMyb(c-myb)PN41 GCAGAGATGGAGTGGAGTGGMyc(c-myc)PN42 TTACGCACAAGAGTTCCGTAMyc(L-myc)PN43 AGCCACTGAGGTATGCAATTMyc(n-myc)PN44 TAGCAAGTCCGAGCGTGTTCp107 PN45 GGGGATTCTGCATCACTATCp21 PN46 CCGTTTTCGACCCTGAGAGTp53 PN47 CAGCTCTCGGAACATCTCGAp57 PN48 GCGCTTGGAGAGGGACACGGp73 PN49 TCAGTGGATCTCGGCCTCCGPDGF-b(c-sis) PN50 TCAGCATCTCATAAAGCTCCPim(c-Pim2) PN51 GGGAAGAAGGTTTGGGGGCCPim-1 PN52 ATTTGCTGGGCCCCGGCGACPTEN PN53 AGACTTTTGTAATTTGTGTARaf(A-Raf-1＝v-raf) PN54 ACACGCTGGCTGGGCTGGGGRaf(c-raf1) PN55 ACAGGGCTGAAGGTGAGGCTRaf-b PN56 AGGCAGGGGGGGTAGCAGACRal(c-ral A) PN57 AATCAAAAAATACCTTGTCARas(Ha-ras) PN58 TCAAGACAGAACGCATTTGCRas(Ki-ras) PN59 ATTACACACTTTGTCTTTGARas(N-ras)PN60 CTACATCACCACACATGGCARb(p110) PN61 TTCAATATCAAAGCGTAGTTRb2(p130) PN62 TCCCCTCTCCTCTTCTTCCARel(c-rel)PN63 TTATACTTGAAAAAATTCATRos(c-ros1) PN64 TCAGACCCATCTCCATATCCski(c-ski) PN65CGAAGCACGAGATGGTCTCGsrc(c-fyn) PN66CACCGAAGCTGGGGTAGTGCsrc(c-Lyn) PN67GCCTTTGCTGTTTATTGGACSrc(c-src) PN68TTCTGGACGTAGTTGGCTGGTimPN69TTAGGCTTGCTGTTCCACCATNFPN70ACAGGGCAATGATCCCAAAGvavPN71CCAGCTCATTCCTCTTTTTGv-src PN72CTACTCAGCGACCTCCAACAwnt-1 PN73CGCCGCTGTTTGCGGCTCAAWT PN74TCAAAGCGCCAGCTGGAGTTYes(c-yes) PN75ACGGACATGGTGACACTGTAAPCPN76AACAGATGTCACAAGGTAAGc-mer PN77TCACATCAGGACTTCTGAGCDCCPN78AAGGCTGAGCCTGTGATGGCFlt-1 PN79CTAGATGGGTGGGGTGGAGTING1L PN80CTACCTCGATCTTCTATCCTGAPDH PN81TTACTCCTTGGAGGCCATGTBeta-actin PN82CTAGAAGCATTTGCGGTGGA本發明的檢測方法中的第三個步驟是使標記的樣品總RNA與步驟1中制備的檢測芯片在適宜條件下雜交并讀出雜交結果。核酸雜交是本領域技術人員熟知的過程，可以使用任何合適的雜交方式。合適的核酸雜交條件取決于芯片所使用的載體和固定的核苷酸片段以及使用的探針，雜交條件的具體選擇在本領域技術人員能力范圍之內。
雜交完成后通過顯色反應顯示雜交結果。腫瘤基因顯色為不同濃度的斑點，對照基因點亦出現雜交斑點。雜交結果代表腫瘤基因在人體內的復制表達水平，能進行腫瘤發生、發展的診斷和預后。
雜交結果可以通過用肉眼觀察判斷，或者通過掃描儀檢測并定量。可以通過用肉眼觀察芯片上顯色斑點顏色來判斷腫瘤芯片中基因表達差異。半定量檢測是用掃描儀獲得數字圖像，軟件分析雜交條帶或斑點的相對光密度值。也可通過計算機檢測靶基因和內參照基因光密度比值，通過比值計算可得出腫瘤基因的表達差異。
實施例1.腫瘤相關基因檢測芯片的制備1〕人工合成SD1-82的核苷酸序列(ABI 394 DNA自動合成儀，ABI公司標準操作程序)2〕點膜
將人工合成的探針進行稀釋，調整濃度為0.5微克/微升，用微量移液器轉移到384孔微孔板中，用VP384.5a點膜儀(V&P ScientificsCorp.)點膜。
3〕固定將點膜后的濾膜在80度真空環境下，烘烤30分鐘，然后在紫外交聯儀內65毫焦/cm2進行交聯固定，制備成腫瘤基因芯片。
2.樣品總RNA提取、逆轉錄和標記1〕常規方法從樣品中提取總RNA(Chomczynski，P.and Sacchi，N.(1987)Anal.Biochem.162156)2〕逆轉錄和標記取兩只無菌的200 lPCR管，分別制備溶液A和B。
A)樣品總RNA(0.25g/l)4lOligo dT、基因特異性引物(每種引物2pmol)混合物 3lddH2O(RNase&DNase-free) 3l加熱到72C溫浴2分鐘，然后降溫到42C。
B)5X First Strand Buffer6l0.1mol/L DTT 3ldNTP混合物3lDig-dUTP(1nmol/l) 3l逆轉錄酶SuperScript II(200U/l)1lddH2O(RNase&DNase-free) 4l42C溫浴2分鐘，然后同溶液A混合。
42C反應2小時。
3.雜交和顯色試劑配制a)經變性并被打斷的鮭魚精DNAb)把鮭魚精DNA(Sigma，III型，鈉鹽)溶解于水配制成10mg/ml濃度(必要時于室溫磁力攪拌2-4小時助溶)c)把溶液中NaCL的濃度調至0.1mol/L，并用酚和酚氯仿各抽提一次，回收水相。
d)使DNA溶液快速通過17號皮下注射針頭12次，以剪切DNA。
e)加入2倍體積用冰預冷的乙醇沉淀DNA。
f)離心回收DNA并重溶于水，配制成10mg/ml的濃度。
g)測定溶液的OD260值并計算出精確的DNA濃度。
h)煮沸10分鐘，分裝成小份保存于-20度。
i)臨用前置沸水浴中加熱5分鐘然后迅速在冰浴中驟冷。預雜交液中應含有100ug/ml經變性并被打斷的鮭精DNA。
雜交A)預雜交1)將膜芯片裝入雜交袋中，加入10ml雜交液。盡可能將袋內空氣擠壓出來，加熱封口，將其浸入42℃的水浴中溫育1小時。
2)100℃加熱5分鐘使探針變性，迅速在冰水浴中驟冷。
3)將雜交袋剪開一角，換10ml預熱的新鮮雜交液，加入探針，盡可能將袋內所有空氣擠壓出去，加熱封口。
4)將雜交袋浸入42℃的水浴，雜交過夜。
5)取出膜芯片并將其置入一個盛有2XSSC和0.1％SDS的托盤內，于室溫洗滌4次，每次5分鐘。
6)將膜芯片轉移至一個盛有0.2XSSC，0.1％SDS的平底塑料盒中，洗滌2次，每次30分。
7)將膜芯片置于一疊紙巾上，以除去大部分液體。2、顯色1)將膜芯片置入封閉液中封閉30分鐘2)加入2毫升抗地高辛抗體稀釋液(稀釋度為1∶3000)3)用10毫升的洗滌液洗滌2次，每次15分鐘4)加入2毫升的檢測緩沖液5分鐘5)加入1毫升NBT/BCIP底物溶液，平鋪于膜上用塑料紙蓋好，避光(勿晃動)，反應時間至陽性參照有清晰的斑點出現為止。
6)用水沖洗終止反應。
雜交結果用肉眼檢測或掃描儀檢測及定量。
權利要求
1.一種腫瘤相關基因檢測方法，包括以下步驟A.將選定的腫瘤相關基因片段固定在固相載體上制備檢測用芯片；B.由樣品中提取總RNA并一步完成逆轉錄和標記；C.使標記的樣品cDNA片段與檢測芯片在適宜條件下雜交并讀出雜交結果。
2.權利要求1的方法，其中腫瘤相關基因片段是SD01-82。
3.權利要求1的方法，其中逆轉錄和標記時使用的引物是針對腫瘤相關基因特異性片段的寡核苷酸反向引物以及12-18nt的寡聚胸腺嘧啶引物。
4.權利要求3的方法，其中所使用的引物是PN01-82。
5.權利要求1的方法，其中步驟C完成雜交后還進行顯色反應。
6.權利要求5的方法，其中可以通過肉眼觀察讀出雜交結果。
全文摘要
本發明提供了一種腫瘤相關基因的檢測方法，以人工合成其特異性的cDNA片段為探針，集成固定在固相支持物上形成腫瘤相關基因DNA陣列，然后通過逆轉錄反應一步完成逆轉錄和標記，再使標記的樣品cDNA片段與腫瘤相關基因DNA陣列在適宜的條件下雜交，芯片雜交結果可直接用肉眼觀察或用掃描儀進行定量分析。采用本發明的方法可方便有效地檢測樣品中是否存在腫瘤相關基因，從而實現腫瘤疾病的早期診斷，揭示腫瘤發生、發展的規律。
文檔編號C12Q1/68GK1472338SQ0212589
公開日2004年2月4日 申請日期2002年8月1日 優先權日2002年8月1日
發明者梁培華, 丁野青, 張向陽 申請人:深圳市君軒生物技術有限公司