一種細胞培養液及其在培養巨核祖細胞中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明設及細胞培養領域，尤其設及一種細胞培養液及其在培養巨核祖細胞中的 應用。
【背景技術】
[0002] 巨核細胞祖細胞（megakaryo巧teprogenitorcell)是一種使人們產生巨核細胞 的細胞，它是從骨髓祖（CRJ-GEMM)而得，簡稱巨核祖細胞。巨核祖細胞存在于IL-6R-細 胞群中，而CD34+細胞可分為兩個細胞亞群，表達比-6R和不表達比-6R，比-6R+細胞能 被刺激形成粒-巨隧細胞、淋己細胞和粒細胞，而IL-6R-細胞當被給予IL-6/SIL-6R時可 形成紅系及巨核系細胞。造血干細胞首先分化生成巨核系祖細胞，也稱巨核系集落形成單 位（colonyformingunit-megakaryo巧te,C即-Meg)。巨核系祖細胞分化成為成熟的巨核 細胞后，其邊緣部分破裂脫落，形成血小板，每個巨核細胞能生成1000-6000個左右的血小 板；巨核細胞雖然在骨髓的造血細胞中為數最少，僅占骨髓有核細胞總數的0. 05%，但其 產生的血小板卻對機體的止血功能極為重要。
[0003] 如今惡性腫瘤嚴重危害人類健康的主要疾病之一，目前主要是通過手術治療并結 合放化療。當患者在接受高劑量放化療后，骨髓造血功能低下，常會出現血小板減少，嚴重 時會造成患者出血死亡。臨床上常采用輸注血小板，但血小板來源有限，存活期短，體外易 失活，且反復輸注血小板易導致輸注無效并增加輸血傳播疾病的危險。
[0004] 1997年，Bertolini等從外周血中分離CD34+，體外誘導擴增巨核細胞7天，用于 患者血小板恢復。結果顯示，體外誘導的巨核細胞可替代血小板輸入，或減少血小板輸入次 數。2000年，Paquette等將體外動員的外周血細胞經體外誘導擴增巨核細胞9天后，用于改 善大劑量化療的乳腺癌病人中性粒細胞減少、血小板減少和貧血癥狀。VandenOudenrijn 等對外周血、骨髓、廝血來源的CD34+細胞體外擴增進行比較，發現廝血來源的CD34+具有 更強的巨核細胞擴增能力。由于廝血造血干細胞移植后血小板的恢復較外周血、骨髓慢，因 此采用體外誘導、擴增巨核祖細胞和巨核細胞，然后輸注患者體內，進一步發育成血小板， 縮短血小板的恢復期。將巨核祖細胞用于惡性腫瘤的治療是目前的研究熱點，
[0005] 但是，目前的體外培養巨核祖細胞的方法增殖速度較慢，且所得細胞中所包含的 巨核祖細胞的數量并不多，因此，研究開發產量高，純度大的巨核祖細胞的方法十分必要。

【發明內容】

[0006] 有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供一種細胞培養液及其在培養巨核祖 細胞中的應用。本發明提供的細胞培養液能夠用于巨核祖細胞的培養，且將其用于巨核祖 細胞的培養所得細胞數量大，其中巨核祖細胞的含量較高。
[0007] 本發明提供的細胞培養液包括基礎培養基、WNT3a蛋白、膜島素、Flt-3L白蛋白、 非必需氨基酸、血小板生成素、干細胞生長因子，白介素3和白介素6。
[0008] 在本發明的實施例中，WNT3a蛋白、膜島素、Flt-3L白蛋白、非必需氨基酸、血 小板生成素、干細胞生長因子，白介素3和白介素6的質量比為（12~35):(12XIO3~ 35X103):(20 ~45):(30X103~ 100X103):(30X103~80X103):(15 ~50):(10~40): (10 ~40) :(10 ~50)。
[0009]Wnt信號在中樞神經系統發育過程中起重要的作用，控制著細胞的生長和發育， WNT3a蛋白是Wnt家族的成員之一，實驗表明其對神經干細胞的增殖及分化喲一定的調控 作用。
[0010] 膜島素是機體內唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質合成。細胞培 養基中添加膜島素能夠促進細胞增殖，保持細胞活性。
[0011]FMS樣酪氨酸激酶 3 配體（fetallivertyrosinekinaserec巧torligand, Flt-3L)是W中強大的造血細胞生長因子，在干細胞和免疫系統的正常發育過程中起著重 要的作用。
[001引白蛋白（又稱清蛋白，a化umin，A化）是血漿中含量最多、分子最小、溶解度大、功 能較多的一種蛋白質，具有保護血細胞保護和調節凝血的功能，有利于防止細胞成團。
[0013]非必需氨基酸（non-essentialaminoacid,NEAA)，包含7種細胞培養所需非必 需氨基酸，即天冬氨酸、天冬酷胺、甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸、徑脯氨酸。非必需氨基 酸的添加能夠增加細胞的繁殖力，延長細胞的生存時間。
[0014] 血小板生成素燈虹omboietinTP0)又名巨核細胞生長因子，能夠調節造血祖細胞 演化成成熟巨核細胞增殖和分化；
[0015] 干細胞生長因子（SC巧是由骨髓微環境中的基質細胞產生的一種酸性糖蛋白，它 是一種重要的造血細胞因子，主要作用于早期的造血干細胞和原始造血祖細胞，促進其增 殖和分化，在維持造血細胞存活，促進造血細胞增殖和分化，調控各系造血細胞的生長發育 中起著重要作用。
[0016] 白細胞介素-3,是白細胞介素家族重要成員之一，簡稱白介素3 (IL-3)，又名多向 性集落刺激因子（multi-CSF)，是一種細胞因子，屬于白細胞介素的一種。它是由T淋己細 胞所產生，能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。
[0017] 白細胞介素-6,簡稱白介素6(IL-6)，屬于白細胞介素的一種。它是由纖維母細 胞、單核/巨隧細胞、T淋己細胞、B淋己細胞、上皮細胞、角質細胞、W及多種瘤細胞所產生。 白介素6能夠刺激參與免疫反應的細胞增殖、分化并提高其功能。
[0018]本發明將上述組分復配，能夠給細胞提供更加豐富的營養。實驗表明，本發明提 供的培養液用于巨核祖細胞的培養，能夠選擇性的促進巨核祖細胞的生長和增殖。W本發 明提供的培養基培養巨核祖細胞20天，細胞數量增殖400倍~450倍，所得細胞中CD34+、 CD41+雙陽性表達率不低于35%。該效果顯著優于現有技術的培養基（p<0. 01)。
[0019] 在本發明的實施例中，膜島素為人膜島素。
[0020] 在一些實施例中，人膜島素為重組人膜島素。
[0021] 在本發明的實施例中，白蛋白為牛血清白蛋白。
[0022] 本發明提供的培養液中不含有牛血清，降低了異源血清所帶來的風險。
[0023] 在本發明的實施例中，培養液中各組分的濃度分別為：
[0024]
[00 巧]
[0026] 在一些實施例中，培養液中各組分的濃度分別為：
[0027]
[002引在一些實施例中，培養液中各組分的濃度分別為： [0029] WNT3a蛋.白' 20ng/ml 膚島素 200?ml 巧t-3L 35ng/ml 食蕾# 60mg/ml 非必需氨基酸 60mg/ml 血小板生成素 40ng/ml 干細胞生長因子 2 5ng/ml 白介素3 25ng/ml 白介素6 30ng/ml
[0030] 在一些實施例中，培養液中各組分的濃度分別為：
[0031] WNT3a蛋白 35ng/nil 腺島素 35mg/inl Flt-3L 45ng/ml
[0032] 白蛋白 lOOrng/ml 非必需氨基酸 8 0mg/ml 血小板生成素 50iig/ml 干細胞生長巧子 40ng/ml 白介素3 40ng/ml 自奔薰6 SOng/ml
[0033] 在本發明的實施例中，基礎培養基為IMEM培養基。
[0034] 利用本發明提供的培養基培養白膜層細胞，20天后細胞數量增殖400~450倍，其 中CD34+XD41+雙陽性表達率不低于35%。該實驗結果表明，本發明提供的培養基能夠選 擇性的促進巨核祖細胞的生長，從而提高所得細胞中巨核祖細胞的含量。
[0035] 本發明提供的細胞培養液在巨核祖細胞培養中的應用。
[0036] 本發明還提供了巨核祖細胞的培養方法，包括W下步驟：
[0037]