一種利用纈氨酸途徑合成丙烷的大腸桿菌及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及一種利用鄉氨酸代謝途徑合成丙烷的大腸桿菌及其構建方法，屬于基 因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 全球人口的持續增長和發展中國家經濟的發展促進了化石能源的開采和使用，導 致了嚴重的環境污染和氣候變化問題。因此，開發環境友好型清潔能源具有重要的意義。
[0003]丙烷是液化石油氣中的主要成分之一，具有較高的沸點和燃燒熱值，因而容易進 行液化和運輸。其燃燒過程充分，可W與現有的內燃機和能源運輸系統相兼容。此外，丙烷 可用作制冷劑和噴霧推進劑，替換對臭氧層具有破壞性的氣氯控類化合物，對環境保護亦 有重要的價值。當前，石油化工業是丙烷的主要來源。鑒于丙烷的廣泛應用和化石燃料資 源的有限性，實現丙烷的生物合成和可再生具有重要的意義。 陽004] 藍細菌（藍藻，切anobacterium)是一種能夠在體內合成脂肪控類化合物的原核 微生物。Schirmer等人發現了該細菌體內合成脂肪控的關鍵性基因：脂肪醒去甲酯加氧酶 (Aldehyde-deformylatingoxygenase,ADO)(Schirmeretal., 2010)。ADO屬于非血紅素 類鐵蛋白超家族酶，可利用氧氣將脂肪醒氧化，發生脫幾基反應，并生成甲酸和相應的脂肪 控。該酶的發現為實現丙烷的生物合成提供了可能的途徑。 陽0化]Kallio等人利用大腸桿菌的脂肪酸合成系統，通過過表達對下酷ACP具有較高特 異性的硫醋酶，使大腸桿菌得W特異性地合成正下醒，再通過在該菌內同時表達的AD0,最 終將正下醒轉化成丙烷，實現了丙烷的生物合成化allio2014)。但是，該代謝途徑中脂肪 酸合成系統提供的正下醒有限，制約了丙烷產量的提升。因此，為實現丙烷產量的進一步提 高，應建立一條能為ADO提供充足底物的代謝途徑。
[0006] 鄉氨酸代謝途徑是大腸桿菌內的一種氨基酸合成途徑。通過過表達來自乳酸乳球 菌的2-酬酸脫簇酶基因Kivd,可將鄉氨酸代謝途徑的中間產物2-酬異戊酸轉化為異下醒 (化OtaAtsumi2008)。體外加醒實驗證明，異下醒同樣可W被ADO催化生成丙烷。因此， 我們希望W大腸桿菌的鄉氨酸代謝途徑為基礎，通過基因工程改造，構建出可W大量合成 并累積異下醒的菌株。再在該菌株中過表達ADO基因，催化異下醒生成丙烷，從而建立一條 新的丙烷合成途徑。表達該代謝途徑的大腸桿菌可為ADO提供充足的異下醒底物，為丙烷 產量的提高奠定基礎。

【發明內容】

[0007]為解決W上問題，本發明提供了一種利用鄉氨酸代謝途徑合成丙烷的大腸桿菌， 所采取的技術方案如下：
[0008] 本發明的目的在于提供一種利用鄉氨酸代謝途徑合成丙烷的大腸桿菌，該大腸桿 菌過表達乙酷乳酸合成酶基因、2-酬酸脫簇酶基因、酬酸還原異構酶基因、二徑基酸脫水酶 基因和脂肪醒去甲酯加氧酶基因，并敲除多個醒還原酶基因和全局轉錄因子基因。
[0009] 優選地，所述脂肪醒去甲酯加氧酶基因，來源于藍藻（切anobacteria)。
[0010] 優選地，所述乙酷乳酸合成酶基因，為來源于枯草芽抱桿菌的乙酷乳酸合成酶基 因alsS;所述2-酬酸脫簇酶基因，為來源于乳酸乳球菌的2-酬酸脫簇酶基因Kivd;所述 酬酸還原異構酶基因，為來源于大腸桿菌的酬酸還原異構酶基因ilvC;所述二徑基酸脫水 酶基因，為來源于大腸桿菌的二徑基酸脫水酶基因ilvD;所述脂肪醒去甲酯加氧酶基因， 為來源于原綠球藻的脂肪醒去甲酯加氧酶基因PMT1231、集胞藻的脂肪醒去甲酯加氧酶基 因S110208、聚球藻的脂肪醒去甲酯加氧酶基因〇計1593或點形念珠藻的脂肪醒去甲酯加 氧酶基因化unR1711。
[0011] 更優選地，所述乙酷乳酸合成酶基因alsS，GeneBank登錄號：CAB15618. 2 ;所 述2-酬酸脫簇酶基因Kivd,GeneBank登錄號：AAS49166. 1 ;所述酬酸還原異構酶基因 ilvC，GeneBank登錄號：NP_418222 ;所述二徑基酸脫水酶基因ilvD，GeneBank登錄號： YP_026248 ;所述脂肪醒去甲酯加氧酶基因PMT1231，GeneBank登錄號：NP_895059 ;脂肪 醒去甲酯加氧酶基因S110208,GeneBank登錄號：NP_442147 ;脂肪醒去甲酯加氧酶基因 O計1593,GeneBank登錄號：YP_400610 ;脂肪醒去甲酯加氧酶基因化unR1711，GeneBank登 錄號：YP_001865325。
[0012] 優選地，所述多個醒還原酶基因是，基因y化D，基因a化E，基因a化P，基因yj濁，基 因eutG，基因yiaY，基因y址K，基因化cO和基因DkgA。
[0013] 優選地，所述全局轉錄因子基因，為全局轉錄因子基因化r。
[0014] 優選地，還敲除乳酸脫氨酶基因、延胡索酸還原酶基因、甲酸裂解酶基因。
[0015] 更優選地，所述乳酸脫氨酶基因，為乳酸脫氨酶基因1化A;所述延胡索酸還原酶 基因，為延胡索酸還原酶基因化dABCD;所述甲酸裂解酶基因，為甲酸裂解酶基因pflB。
[0016] 所述任一大腸桿菌在合成脂肪控類燃料中的應用也在本發明的保護范圍之內。
[0017] 本發明的另一目的在于提供一種所述大腸桿菌的構建方法，該方法的步驟如下：
[0018] 1)將質粒PKD46轉化到宿主菌E.COliBW25113中，獲得攜帶質粒的宿主菌；
[0019] 2)分別制備含有乙酷乳酸合成酶基因alsS和2-酬酸脫簇酶基因Kivt酬酸還原 異構酶基因ilvC和二徑基酸脫水酶基因ilvDW及脂肪醒去甲酯加氧酶基因的重組質粒， 獲得代謝途徑構建質粒；
[0020] 3)分別構建醒還原酶基因y化D，基因a化E，基因a化P，基因yj濁，基因eutG，基因 ^aY,基因y址K，基因化cO和基因DkgA,W及全局轉錄因子基因化r的基因替換質粒和標 簽替換質粒；
[0021] 4)利用步驟3)所得的基因替換質粒和標簽替換質粒制備基因敲除片段和標簽敲 除片段；
[0022] 5)先后向步驟1)所得的攜帶質粒地D46的宿主菌中轉化同一個基因的基因敲除 片段和標簽敲除片段，獲得缺失一個基因的重組菌；
[0023] 6)W步驟5)所得的缺失一個基因的重組菌為宿主菌，重復步驟5)的操作，獲得缺 失兩個基因的重組菌，再重復步驟5)的操作，每次操作均W上一次操作獲得的重組菌為宿 主菌，直至將步驟3)所述基因全部敲除，獲得醒還原酶活性缺失的重組大腸桿菌；
[0024] 7)將步驟6)中醒還原酶活性缺失的重組大腸桿菌進行溶源化處理，再將步驟2) 所得的代謝途徑構建質粒轉化到所得的溶源菌中，獲得能夠利用鄉氨酸途徑合成丙烷的重 組大腸桿菌：
[00巧]優選地，所述構建醒還原酶基因y化D的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物 的核巧酸序列如SEQIDNO.I-SEQIDNO. 4所示；構建醒還原酶基因a化E的基因替換質 粒和標簽替換質粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 5-SEQIDNO. 8所示；構建醒還原 酶基因a化P的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 9-SEQ IDNO. 12所示；構建醒還原酶基因yj濁的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物的核巧 酸序列如SEQIDNO. 13-SEQIDNO. 16所示；構建醒還原酶基因eutG的基因替換質粒和標 簽替換質粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 17-SEQIDNO. 20所示；構建醒還原酶基 因yiaY的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 21-SEQID NO. 24所示；構建醒還原酶基因y址K的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物的核巧酸 序列如SEQIDNO. 25-SEQIDNO. 28所示；構建醒還原酶基因化CO的基因替換質粒和標 簽替換質粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 29-SEQIDNO. 32所示；構建醒還原酶基 因DkgA的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物的核巧酸序列如SEQIDNO. 33-SEQID NO. 36所示；構建醒還原酶基因化r的基因替換質粒和標簽替換質粒所用引物的核巧酸序 列如沈QIDNO. 49-沈QIDNO. 52所示。
[00%] 本發明還提供了一種具體應用所述重組大腸桿菌合成丙烷的方法，該方法的具體 的步驟如下：
[0027] 1)將質粒PKD46轉化到宿主菌E.COliBW25113中，獲得攜帶質粒的宿主菌；
[0028] 2)分別制備含有乙酷乳酸合成酶基因alsS和2-酬酸脫簇酶基因Kivt酬酸還原 異構酶基因ilvC和二徑基酸脫水酶基因ilvDW及脂肪醒去甲酯加氧酶基因的重組質粒， 獲得代謝途徑構建質粒；
[0029] 3)分別構建醒還原酶基因基因y化D，基因a化E，基因a化P，基因yj濁，基因eutG， 基因^aY,基因y址K，基因化CO和基因DkgA,W及乳酸脫氨酶基因1化A，延胡索酸還原酶 基因化dABCD，甲酸裂解酶基因PflB和全局轉錄因子基因化r的基因替換質粒和標簽替換 質粒；
[0030] 4)利用步驟3)所得的基因替換質粒和標簽替換質粒制備基因敲除片段和標簽敲 除片段；
[0031] 5)先后向步驟1)所得的攜帶質粒地D46的宿主菌中轉化同一個基因的基因敲除 片段和標簽敲除片段，獲得缺失一個基因的重組菌；
[0032] 6)W步驟5)所得的缺失一個基因的重組菌為宿主菌，重復步驟5)的操作，獲得缺 失兩個基因的重組菌，再重復步驟5)的操作，每次操作均W上一次操作獲得的重組菌為宿 主菌，直至將步驟3)所述基因全部敲除，獲得缺失13個基因的重組大腸桿菌；
[0033] 7)將步驟6)中醒還原酶活性缺失的重組大腸桿菌進行溶源化處理，再將步驟2) 所得的代謝途徑構建質粒轉化到所得的溶源菌中，獲得能夠利用鄉氨酸途徑合成丙烷的重 組大腸桿菌。
[0034] 8)利用步驟7)所得的重組大腸桿菌發酵合成丙烷。
[0035] 發明人