專利名稱：一種體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的方法
技術領域：
本發明涉及生物技術領域中單個核細胞的體外誘導方法，特別是涉及一種將單個核細胞體外誘導分化為巨核祖細胞和巨核細胞的方法。
背景技術：
腫瘤(Tumor)是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平 上失去對其生長的正常調控，導致細胞克隆性異常增生而形成的新生物。腫瘤可分為良性 和惡性兩大類。惡性腫瘤是目前嚴重危害人類健康的主要疾病之一，其常規的治療手段仍 然是手術治療并結合放化療。當患者在接受高劑量放化療后，骨髓造血功能低下，常會出現 血小板減少，嚴重時會造成患者出血死亡。臨床上常采用輸注血小板，但血小板來源有限， 存活期短，體外易失活，且反復輸注血小板易導致輸注無效并增加輸血傳播疾病的危險。 1997 年，Bertolini 等(Bertolini 等，Megakaryocytic progenitors can be expanded ex vivo and safely administeredto autologous peripheral blood progenitor cell transplant recipients. Bloodl997，89 (8) 2679)從外周血中分離 CD34+，體外誘導擴 增巨核細胞7天，用于患者血小板恢復。結果顯示，體外誘導的巨核細胞可替代血小板 輸入，或減少血小板輸入次數。2000年，Paquette等(Paquette等，Ex vivo expanded unselectedperipheral blood progenitor cells reduce posttransplantation neutropenia, thrombocytopenia, and anemia in patients with breast cancer. Blood, 2000,96(7) 2385)將體外動員的外周血細胞經體外誘導擴增巨核細胞9天后，用于改善 大劑量化療的乳腺癌病人中性粒細胞減少、血小板減少和貧血癥狀。Van denOudenri jn等 (Van den Oudenrijn 等 Differences in megakaryocyte expansionpotential between CD34(+)stem cells derived from cord blood, peripheral bloodand bone marrow from adults and children. Exp Hematol，2000，28 (9) : 1054)對外周血、骨髓、臍血來源的 CD34+ 細胞體外擴增進行比較，發現臍血來源的CD34+具有更強的巨核細胞擴增能力。由于臍血來 源廣泛、免疫原性低、對供者無損害、污染少、無倫理道德問題，已成為臨床關注的焦點。由 于臍血造血干細胞移植后血小板的恢復較外周血、骨髓慢，因此采用體外誘導、擴增巨核祖 細胞和巨核細胞，然后輸注患者體內，進一步發育成血小板，縮短血小板的恢復期。文獻報 道種子細胞多為CD34+細胞，而以單個核細胞為體外誘導擴增的種子細胞具有花費低，且操 作簡便，造血干細胞損失小等優點。莫文健等人(莫文健等，無血清臍血巨核系祖細胞體外擴增的研究。中國實驗血 液學雜志，2004 ;12 (2) :133-137;莫文健等，兩步法臍血巨核細胞體外擴增的研究。中國輸 血雜志，2005;18(5) 381-383)公開了一種以單個核細胞進行體外誘導擴增的技術，其主 要是用羥乙基淀粉從臍血中沉降紅細胞(臍血與6%羥乙基淀粉按5 1比例混合)，然后 經PBS洗滌，Ficoll分離單個核細胞。單個核細胞加入無血清培養液中孵育2h去掉黏附 細胞，再在含誘導因子的無血清培養基(含細胞因子終濃度為50ng/ml ΤΡ0, 20ng/ml IL_3、 50ng/ml SCF, 20ng/ml IL-6的StemSpan SFEM無血清培養基)中進行培養、誘導分化得到巨核細胞。然而該文獻介紹的方法較為繁瑣，且臍血單個核細胞擴增后10天CD41+細胞 百分數16. 68士 1. 27%，14天⑶41+細胞表達量為24. 41 士 1. 90%，顯示表達量不高
發明內容
本發明提供了一種操作簡便且可以提高表達量的體外誘導巨核祖細胞和巨核細 胞的方法及其專用培養基。為解決上述技術問題，本發明采取以下技術方案用于體外誘導巨核祖細胞和巨 核細胞的專用培養基，命名為st36無血清培養基，是在StemSpan 無血清培養基中，加入 細胞因子TPO終濃度為50ng/mL、IL-3終濃度為20ng/mL、SCF終濃度為50ng/mL、IL-6終 濃度為50ng/mL。所述StemSpan 為進口無血清培養基(生產商加拿大stemcell公司)。本發明的第二個目的是提供一種體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的方法。本發明所提供的體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的方法，可包括以下步驟1)單個核細胞的分離用常規的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個核 細胞，其中，采用質量/體積百分比濃度為6% (g/100ml)的羥乙基淀粉(生產商美國 B. BRAUN公司)沉降臍血中的紅細胞；2)細胞培養和誘導分化將單個核細胞接種于st36無血清培養基中，在37°C、5% CO2條件下體外培養4-14天，取第4-14天的細胞得到巨核祖細胞和巨核細胞混合物。優選 體外培養7-14天。在上述方法中，所述步驟1)中6 %羥乙基淀粉與臍血的混合比例為 1:2-1: 3(羥乙基淀粉的終濃度為1.5%-2.0%)，優選為1 3(羥乙基淀粉的終濃度 為1. 5% )；單個核細胞的分離方法具體為用6%的羥乙基淀粉按比例與臍血混合沉降紅 細胞30min，吸取上清，1800rpm離心5min，將細胞懸于生理鹽水中，再將細胞懸液緩慢加入 等體積的人淋巴細胞分離液表面，22°C、2000rpm離心25min，得到單個核細胞。步驟2)中單個核細胞的接種量為IO6細胞/ml ；在培養第4、7、10天時進行原體積 的1/3量補液，加入新鮮培養基和細胞因子。用上述方法獲得的巨核祖細胞和巨核細胞也屬于本發明的保護范圍。其中，體外 培養7-10天得到的巨核祖細胞和巨核細胞形態和活性最優。本發明主要提供了一種體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的方法及其專用培養基。 在分離單個核細胞過程中，首先要沉降紅細胞，采用羥乙基淀粉、明膠、甲基纖維素等均可 獲得較好的結果，但明膠、甲基纖維素不適用于臨床應用，而本發明采用的羥乙基淀粉是紅 細胞沉降劑，它可加快紅細胞的沉降效率，阻礙白細胞和內皮細胞的黏附，從而達到直接分 離紅細胞的目的；本發明還優化了羥乙基淀粉的使用濃度，提高了有核細胞的收率；本發 明進而將沉降紅細胞后的上清按體積比1 1緩慢加入人淋巴細胞分離液(FICOLL)上， 進行密度梯度離心，可得到純度較高的單個核細胞。本發明中省去了分離的單個核細胞去 黏附細胞的操作而直接進行誘導，從而簡化了操作過程，減少了污染，縮短了時間。另一方 面，本發明在細胞培養和誘導分化過程中，通過采用合適的培養基并合理配伍使用各種細 胞因子(特別是調整了 IL-6的終濃度為50ng/mL)，選擇恰當的補液時機(在培養第4、7、 10天)和補液量(按原體積1/3量補液)進行體外擴增巨核細胞，獲得了最佳擴增效果和表達量。本發明將臍血單個核細胞高效誘導分化為巨核祖細胞和巨核細胞的方法，具有操 作簡單、成本低廉和分化效率高等優點，并提供了一個巨核祖細胞和巨核細胞的補充來源， 將在醫學領域發揮重要作用，應用前景廣闊。下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細說明。


圖1為不同濃度羥乙基淀粉沉降紅細胞效果比較結果圖2為含不同因子組合的國產無血清培養基體外誘導臍血單個核細胞7d⑶41/ ⑶61表達情況圖3為含st36(SCF、TPO、IL-3、IL-6)因子組合的進口無血清培養基體外誘導不 同時間的細胞形態(X200)圖4為臍血單個核細胞體外誘導后細胞瑞氏吉姆薩染色(X 1000)圖5為臍血單個核細胞體外誘導不同時間半固體培養CFU-MK集落數
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。所述百分比濃度均為質量/ 體積(W/ν)百分比濃度或體積/體積(V/V)百分比濃度。實施例1 培養基中因子組合的確定實驗一、采用含不同細胞因子組合的國產無血清培養基誘導臍血單個核細胞，觀 察表達⑶41/⑶61細胞數的變化該實驗中所用國產無血清培養基為購自北京博特納科技有限公司的BTN無血清
培養基。將單個核細胞(從臍血中獲得，分離單個核細胞的過程參見實施例2)接種于24 孔板中，每孔1ml，IO6細胞/ml。培養基分別為培養基A:國產無血清培養基，其中含116t因子組合10ng/mL IL-IlUOng/ mLIL-6、100ng/mL TPO。培養基B 國產無血清培養基，其中含st36因子組合50ng/mL SCF、50ng/mLTP0、 20ng/mL IL-3、50ng/mLIL_6o培養基C 國產無血清培養基，其中含pt36因子組合50ng/mL PDGF、50ng/mLTP0、 20ng/mL IL_3、50ng/mL IL-6。培養基D:國產無血清培養基，其中含pst36因子組合50ng/mL PDGF、50ng/ mLSCF、50ng/mL TP0、20ng/mL IL_3、50ng/mL IL_6。培養條件37°C、5% C02培養箱體外培養7d。于第4d進行1/3量補液，加入新鮮 培養基(含有與原培養基相同濃度的因子)。采用含不同細胞因子組合的國產無血清培養基誘導臍血單個核細胞，觀察表達 D41/CD61陽性細胞數的變化，結果培養基B效果較好(圖2)，確定本發明采用的因子組合 為st36因子組合。實驗二、培養基B與含st36因子組合的進口無血清培養基(培養基E)對臍血單 個核細胞體外誘導分化影響
實驗中所用進口無血清培養基為StemSpan SFEM無血清培養基，生產商為加拿 大stemcell公司。與實驗一類似，采用培養基E，(含st36因子組合，即50ng/mL SCF、50ng/mLTP0、 20ng/mL IL_3、50ng/mL IL-6的StemSpgm 無血清培養基)，體外誘導培養單個核細胞4d、 7d、10d、14d，分別于第4d、7d、10d按原體積的1/3量補液，加入新鮮培養液和相同濃度的因
子。 結果表明，采用培養基E體外誘導臍血單個核細胞表明，隨著誘導時間延長，細胞 數增加，CD41/CD6表達提高(表1)。在觀察培養基B與培養基E對臍血單個核細胞誘導分 化影響，發現隨著誘導時間延長，臍血單個核細胞經培養基B體外誘導培養(參見實驗一) 存活率降低，細胞狀態不佳。而以培養基E作為培養誘導體系，細胞存活時間延長，存活率 提高。隨著細胞培養誘導時間延長，出現貼壁的基質細胞，以及呈卵圓形、圓形的懸浮細胞， 大小不一，且細胞數逐漸增加，體積變大。表明，在貼壁生長的基質細胞作用下，懸浮的臍血 干細胞向巨核祖細胞和巨核細胞分化，逐漸成熟，擴增。因此，確定采用培養基E作為用于 體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的專用培養基。表1體外培養誘導臍血單個核細胞不同時間細胞數變化和⑶41/⑶6表達(η = 5) 通過以上實驗確定本發明用于體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的專用培養基 (即培養基E，命名為st36無血清培養基)，是在進口無血清培養基(StemSpan 無血清培 養基)中，加入的細胞因子TPO終濃度為50ng/mL、IL-3終濃度為20ng/mL、SCF終濃度為 50ng/mL、IL-6 終濃度為 50ng/mL。實施例2、體外誘導臍血單個核細胞分化為巨核祖細胞和巨核細胞及檢測實驗三、不同濃度的羥乙基淀粉(HES)沉降臍血紅細胞的沉降效果比較將6%羥乙基淀粉與臍血按一定比例混合，使羥乙基淀粉終濃度分別為2.0%、 1.5%,1.2%,1.0% ( “ ％ ”含義為"g/100ml，，)，室溫沉降紅細胞30min,比較沉降效果。 然后，小心吸取上清，ISOOrpm離心5min，細胞懸于生理鹽水中，將細胞懸液緩慢加入等體 積的人淋巴細胞分離液(FIC0LL，中國醫學科學院生物工程研究所灝洋生物)表面，22°C、 2000rpm離心25min，收集單個核細胞層，生理鹽水洗滌2次，細胞計數。比較2. 0%、1. 5%、1. 2%、1. 0%濃度的羥乙基淀粉沉降臍血紅細胞的沉降效果， 結果顯示2.0%或1.5%羥乙基淀粉的沉降效果較好(6%羥乙基淀粉與臍血按1 2或 1 3比例混合)，其中1.5%羥乙基淀粉的沉降效果最佳(圖1，1 4:羥乙基淀粉濃度分 別為2.0%、1.5%、1.2%、1.0% )，且回收的有核細胞量最多(表1)。表2不同濃度羥乙基淀粉沉降紅細胞后獲得有核細胞的量 η = 4 與 1· 5%的 HES 相比，* :ρ < 0. 05，f :ρ < 0. 05以下操作中使用6%的羥乙基淀粉并使其終濃度為1. 5%。一、體外誘導臍血單個核細胞分化為巨核祖細胞和巨核細胞用本發明的方法體外誘導臍血單個核細胞分化為巨核祖細胞和巨核細胞，具體包 括以下步驟1)單個核細胞的分離用常規的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個核 細胞，具體方法為用6%羥乙基淀粉與臍血按1 3體積比混合(羥乙基淀粉的終濃度為 1. 5%)沉降紅細胞30min，吸取上清，1800rpm離心5min，將細胞懸于生理鹽水中，再將細胞 懸液緩慢加入等體積的人淋巴細胞分離液上，22°C、2000rpm離心25min，得到單個核細胞。2)細胞培養和誘導分化將單個核細胞接種于24孔板中，每孔1ml，IO6細胞/ml， 添加實施例1確定的培養基E中，在37°C、5% CO2條件下體外培養，并在培養第4、7、10天 時進行原體積的1/3量補液，加入新鮮培養基，取4、7、10、14天得到的巨核祖細胞和巨核細 胞混合物。二、細胞形態觀察用倒置顯微鏡觀察誘導的單個核細胞不同時間點細胞的大體形態變化。瑞氏吉姆 薩染色，普通光學顯微鏡觀察誘導分化的巨核祖細胞和巨核細胞。單個核細胞接種培養基后于倒置顯微鏡下觀察，可見細胞小，圓形。隨著培養時間 延長，細胞數增加，出現梭形貼壁細胞，圓形、卵圓形細胞，大小不一，且細胞體積逐漸變大。 7天后細胞增殖明顯(圖3，(1) (5)分別為體外誘導0d、4d、7d、10d、14d的細胞形態)。 瑞氏吉姆薩染色，可見有不同階段巨核細胞存在。光學顯微鏡下觀察顯示有原巨核，幼巨核 細胞(核大，紫紅色，細胞邊緣不規則，可有指狀突起)和顆粒型巨核細胞(胞體巨大，胞質 豐富，含細小紫紅色顆粒，核互相聚集呈環狀)存在，10天后出現成熟的巨核細胞(參見圖 4其中箭頭所指細胞，①②誘導IOd巨核細胞③④誘導14d巨核細胞)。三、流式細胞儀檢測誘導4d、7d、10d、14d獲得的巨核祖細胞和巨核細胞分別用生理鹽水洗滌，并將誘 導不同時間的細胞均分成兩管，各加入鼠抗人⑶41—PE、⑶61-FITC抗體和鼠的IgGl-PE、 IgGl-FITC抗體(英國ρ印rotech公司)，4°C、30min孵育，流式細胞儀檢測CD41/CD61表 達。數據參見表3。表3體外培養誘導臍血單個核細胞不同時間細胞數變化和⑶41/⑶6表達(η = 5)
結果誘導10d、14d時，⑶41/⑶61表達分別達到20 %、54%，該數據與莫文健 等人(莫文健等，無血清臍血巨核系祖細胞體外擴增的研究。中國實驗血液學雜志， 2004； 12 (2) :133-137;莫文健等，兩步法臍血巨核細胞體外擴增的研究。中國輸血雜 志，2005;18(5) 381-383)報道的結果(臍血單個核細胞擴增后10天⑶41+細胞百分數 16. 68 士 1.27%，14天⑶41+細胞表達量為24. 41 士 1.90% )相比，定向誘導巨核細胞的效 果更佳。本發明獲得較好的表達量，與培養基中使用的因子濃度、誘導過程的補液的時機、 補液方式有關，且單個核細胞接種后貼壁的基質細胞可能也有利于細胞誘導分化。四、巨核祖細胞集落培養采用含0.9%甲基纖維素，BSA，10_4M β -巰基乙醇，200 μ g/mL人轉鐵蛋白， 10μ g/mL 重組人胰島素，2mM L-谷氨酰胺，10ng/mL rhIL-6,10ng/mL rhIL-3，50ng/mL rhTPO的巨核祖細胞集落培養基對步驟2)獲得的體外誘導培養0、7、10、14d的巨核祖細胞 進行集落培養10-12天，倒置顯微鏡下計CFU-MK集落數。結果如圖5所示，隨著單個核細胞在培養基E中誘導時間的延長，CFU-MK集落數 呈增加趨勢。體外誘導7d、10d、14d的細胞，CFU-MK集落數均高于未誘導的單個核細胞，且 差別非常顯著(P <0.01)。表明，增加體外誘導時間，可獲得更多的巨核祖細胞。實施例2確定了本發明較好的體外誘導臍血單個核細胞分化為巨核祖細胞和巨 核細胞的方法，并且，取使用該方法體外誘導7d-14d的細胞表達量有明顯提高，而從獲得 的細胞形態和活性看，7d-10d的細胞較好。
權利要求
用于體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的專用培養基，命名為st36無血清培養基，是含有終濃度50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3和50ng/mL IL-6的st36因子組合的無血清培養基。FSA000001.tif
2.—種體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的方法，包括以下步驟1)單個核細胞的分離用常規的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個核細胞， 其中，采用質量/體積(W/V)百分比濃度為6%的羥乙基淀粉沉降臍血中的紅細胞；2)細胞培養和誘導分化將單個核細胞接種于用權利要求1所述專用培養基中，在 37°C,5% CO2條件下體外培養4-14天，取4_14天的懸浮細胞得到巨核祖細胞和巨核細胞。
3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于所述步驟1)中6%羥乙基淀粉與臍血的 混合比例為1 2-1 3，使羥乙基淀粉的終濃度為1.5%-2.0%。
4.根據權利要求2或3所述的培養方法，其特征在于所述步驟2)培養時間為7-14天。
5.根據權利要求2或3或4所述的方法，其特征在于所述步驟1)單個核細胞的分 離過程為用6%的羥乙基淀粉沉降按與臍血按比例混合沉降紅細胞30min，吸取上清， ISOOrpm離心5min，將細胞懸于生理鹽水中，再將細胞懸液緩慢加入等體積的人淋巴細胞 分離液表面，22°C、2000rpm離心25min，得到單個核細胞。
6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于所述步驟1)中6%羥乙基淀粉與臍血的 混合比例為1 3，使羥乙基淀粉的終濃度為1.5%。
7.根據權利要求2至6任一所述的方法，其特征在于所述步驟1)得到的單個核細胞 直接用于步驟2)的細胞培養和誘導分化中，無需增加去掉單個核細胞中的黏附細胞的過 程。
8.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)在培養第4、7、10天 時進行原體積的1/3量補液，加入新鮮權利要求1所述專用培養基。
9.根據權利要求1-7任一所述的方法，其特征在于所述步驟2)中單個核細胞的接種 量為IO6細胞/ml。
10.用權利要求2-9任一項所述方法獲得的巨核祖細胞和巨核細胞混合物，優選步驟 2)中體外培養7-10天得到的巨核祖細胞和巨核細胞混合物。
全文摘要
本發明公開了一種體外誘導巨核祖細胞和巨核細胞的方法及其專用培養基。該專用培養基是含有50ng/mL SCF、50ng/mL TPO、20ng/mL IL-3和50ng/mL IL-6的無血清培養基。該方法包括以下步驟1)用常規的Ficoll密度梯度離心方法從臍血中分離單個核細胞，其中用濃度為6％的羥乙基淀粉沉降臍血中的紅細胞；2)將單個核細胞用專用培養基在37℃、5％CO2條件下體外培養4-14天，得到巨核祖細胞和巨核細胞混合物。本發明提供了一個巨核祖細胞和巨核細胞的補充來源，并具有操作簡單、成本低廉和分化效率高等優點。本發明將在醫學領域發揮重要作用，應用前景廣闊。
文檔編號C12N5/0786GK101864396SQ20101017885
公開日2010年10月20日 申請日期2010年5月17日 優先權日2010年5月17日
發明者主鴻鵠, 劉大慶, 呂洋, 岳 文, 師偉, 李艷華, 裴雪濤, 謝小燕, 陳琳 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院野戰輸血研究所