一種雙特異性抗體活化的t細胞及制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞免疫學技術領域，具體設及一種雙特異性抗體活化的T細胞及制 備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 腫瘤的過繼免疫治療是將自體或異體的免疫活性細胞經過體外擴增后輸入患者 體內，直接殺傷腫瘤細胞，調節和增強機體的免疫功能，主要包括LAK細胞、CD3AK細胞、TIL 細胞、CTL細胞、NK細胞和CIK細胞的免疫治療。過繼免疫治療作為腫瘤綜合治療中的一個 新方法，已經與常規手術治療、放療、化療及細胞因子和分子祀向治療廣泛聯合，成為腫瘤 綜合治理的一個組成部分，在多種腫瘤的治療中展示了廣泛的應用前景。 陽00引其中，T-細胞（即T淋己細胞）輸入（trans化Sion)，稱為過繼T-細胞療法，已 經過測試用于癌癥和慢性感染的治療。過繼T-細胞療法具有增強抗腫瘤免疫，提高疫苗 效力W及限制移植物抗宿主疾病的潛力。過繼T-細胞療法用作細胞源，尤其是，細胞毒性 T-細胞（CTLs),或腫瘤浸潤淋己細胞（TILs)。在現有技術中常采用雙特異性抗體"武裝 (arm)"(活化的）T-細胞W形成它們和腫瘤細胞表面抗原之間的橋梁，W增強T-細胞的殺 瘤效應。雙特異性抗體化ispecificantibody,BiAb)是含有兩種特異性抗原結合位點的 人工抗體，能在祀細胞和功能分子（細胞）之間架起橋梁，使功能分子（細胞）集中在祀細 胞周圍，進而對祀細胞進行殺傷，產生祀向性的效應功能。BiAb在生物醫學中，特別是在腫 瘤的免疫治療中具有廣闊的應用前景。通過BiAb介導細胞毒作用殺死腫瘤細胞是當前免 疫治療應用研究的熱點之一，其主要特點是BiAb能同時結合腫瘤相關抗原和免疫效應細 胞上的祀分子，直接觸發免疫效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。
[0004] 如中國專利文獻CN104630146A中公開的腫瘤細胞特異性多克隆T細胞制備方法 及其應用，包括如下步驟：（1)獲取外周血單個核細胞；（2)將獲取的外周血單個核細胞與 基因修飾腫瘤細胞混合；（3)將獲取的混合細胞重懸于含有能夠維持細胞生長、增殖和分 化的細胞因子的培養基中。通過上述所制備的腫瘤細胞特異性多克隆T細胞，主要在預防 或治療癌癥的藥物中的應用，其優點在于制備的腫瘤細胞特異性多克隆T細胞具有數量 多、特異性高和殺傷能力強等特性，此外，該制備方法還具有工藝簡單而且成本較目前特異 性T細胞制備成本顯著降低。然而，上述方案中通過雙特異性抗體的連接，使腫瘤細胞對T 細胞進行抗原遞呈，然后激活T細胞，再殺傷祀細胞，使得制備的腫瘤細胞特異性多克隆T 細胞具有特異性高的特點，由于其具有高特異性，則產生特異性殺傷效果，腫瘤細胞特異性 多克隆T細胞僅能殺傷祀細胞，而對于非祀細胞則沒有殺傷作用。 陽0化]鑒于現有技術中還未提出一種方法制備具有擴增能力強、細胞活性強、細胞毒性 強和細胞數量多的具有非特異性殺傷效果的T細胞。為此，本發明提供了一種雙特異性抗 體活化的T細胞及制備方法與應用。

【發明內容】

[0006] 因此，本發明要解決的技術問題在于提供了一種雙特異性抗體活化的T細胞及制 備方法與應用。
[0007] 為此，本發明提供了一種雙特異性抗體活化的T細胞的制備方法，包括如下步驟：
[000引 S1、取外周全血進行離心分離所述外周血中的細胞和血漿，然后滅活所述血漿中 的補體，收集所述細胞和血漿，備用；
[0009]S2、將所述步驟Sl中獲得的細胞稀釋成懸液，分離出單個核細胞，然后洗涂，備 用；
[0010] S3、將所述步驟S2中獲得的單個核細胞加入無血清培養液中，向所述無血清培養 液中加入雙特異性抗體、祀細胞、能夠維持細胞生長、增殖和分化的細胞因子和所述步驟Sl 中收集的血漿，隨后按照常規方法進行解育培養，收集培養細胞，采用生理鹽水離屯、洗涂， 獲得所述的雙特異性抗體活化的T細胞，即得；
[0011] 其中，所述雙特異性抗體具備活化T細胞的功能，包含至少一個祀向T細胞抗原表 位的結合位點和至少一個祀向祀細胞表面抗原表位的結合位點；所述雙特異性抗體與所述 T細胞抗原表位的結合的解離系數大于1X10 7,與所述祀細胞表面抗原表位的結合的解離 系數小于5X10 9;所述雙特異性抗體分子量為小于50KD。
[0012] 所述T細胞抗原為CD3和/或CD28。
[0013] 所述祀細胞抗原為CD19、CD20和/或腫瘤、微生物的特異性抗原祀點。
[0014] 優選的，所述T細胞抗原為CD3,所述祀細胞抗原為CD19。
[0015] 所述祀細胞為滅活的B細胞、癌細胞或病原體細胞。
[0016] 所述的方法，所述祀細胞為滅活的B細胞。
[0017] 所述的方法，所述步驟S3中，所述單個核細胞的終濃度為化5-2)Xl〇6/ml，加 入的所述雙特異性抗體的終濃度為0.Ing/na-lOOOng/ml，加入的所述祀細胞的終濃度為 (0. 001-50)Xl〇6/ml，加入的所述血漿的終濃度為0. 1% -10%。 陽01引所述的方法，所述步驟S3中，加入的所述細胞因子為IL-2和IFN- 丫，所述IL-2終 濃度為50-2000U/ml，所述IFN-丫的終濃度為50-3000U/ml。
[0019] 所述的方法，所述步驟S3中，所述解育培養的步驟，培養條件為36-38°C，3-6% CA的二氧化碳培養箱中培養5-28天。
[0020] 所述的方法，所述步驟S3中，所述解育培養的步驟中還包括補充培養液的步驟， 所述培養液包括所述IL-2、所述IFN-丫和所述步驟Sl中收集的滅活血漿。
[0021] 所述的方法，所述步驟S3中，所述解育培養的步驟中還包括補充祀細胞的步驟， 每間隔4-10天適量補充祀細胞一次。
[0022] 所述的方法，所述步驟Sl中，將分離的所述血漿置于56-6rC下水浴3-30分鐘滅 活補體，優選的，于56°c水浴30分鐘，于60°C水浴5分鐘或于ere水浴3分鐘。
[0023] 本發明提供了一種由上述的方法制備得到的雙特異性抗體活化的T細胞。
[0024] 本發明還提供了一種所述的雙特異性抗體活化的T細胞或其聯合雙特異性抗體 在制備用于免疫治療、預防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物中的用途。
[00巧]在所述的用途中，所述的雙特異性抗體活化的T細胞制備用于免疫治療、預防或 治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，包括如下步驟：將所述的雙特異性抗 體活化的T細胞加入生理鹽水中，并加入添加劑，制成細胞懸液，即得。
[0026] 在所述的用途中，所述的雙特異性抗體活化的T細胞聯合不同抗原祀點的雙特異 性抗體制備用于免疫治療、預防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物的方法，包 括如下步驟：取所述的雙特異性抗體活化的T細胞進行洗涂，然后向其中加入適量的與T細 胞抗原具有高親和力的特定祀標的雙特異性抗體，解育培養，然后洗涂，收集細胞，加入生 理鹽水中，并加入添加劑，制成細胞懸液，即得。
[0027] 本發明技術方案相比現有技術，具有如下優點：
[002引 1、本發明所述的雙特異性抗體活化的T細胞的制備方法，包括如下步驟：S1、取外 周血進行離屯、，分離所述外周血中的細胞和血漿，然后滅活所述血漿中的補體，備用；S2、將 所述步驟Sl中獲得的細胞稀釋成細胞懸液，分離出單個核細胞，收集單個核細胞洗涂，備 用；S3、將所述步驟S2中獲得的單個核細胞加入無血清培養液中，向所述無血清培養液中 加入雙特異性抗體、祀細胞、能夠維持細胞生長、增殖和分化的細胞因子和所述步驟Sl中 收集的血漿，隨后按照常規方法進行解育培養，細胞數量能滿足治療的數量后，并且經流式 細胞儀檢測獲得的細胞中不含有祀細胞時，離屯、收集細胞，生理鹽水離屯、洗涂，洗掉雙特異 性抗體，所述的雙特異性抗體活化的T細胞，即得；其中，所述雙特異性抗體具備活化T細 胞的功能，包含至少一個結合T細胞抗原表位的結合位點和至少一個結合祀細胞表面抗原 表位的位點；所述雙特異性抗體與所述T細胞抗原表位的結合的解離系數大于1X10 7,與 所述祀細胞表面抗原表位的結合的解離系數小于1X10 9;所述雙特異性抗體分子量為小 于50KD;通過在獲取的單個核細胞中加入雙特異性抗體，由于該雙特異性抗體分子量小于 50KD，屬于小分子雙特異性抗體，使得其在將效應T細胞與祀細胞連接在一起時立即分泌 殺傷性因子殺滅祀細胞，直接引起效應T細胞對祀細胞的殺傷，無需通過抗原遞呈作用產 生特異性T細胞對祀細胞進行殺傷，同時還具備活化T細胞的功能，在殺滅祀細胞的過程 中，殺傷性T細胞的活性、增殖能力和殺傷活性都大幅提高，又由于雙特異性抗體與T細胞 抗原低親和力，對祀細胞是高親和力，運種設計在保證了雙特異性抗體對T細胞活化作用 的同時，還可W被輕易地洗掉，使得雙特異性抗體可W從T細胞上脫落，使得T細胞特異性 殺傷效果喪失，成為非特異性的殺傷細胞，起著殺滅MHC分子低表達的腫瘤細胞，并長期對 腫瘤產生細胞免疫監視作用，防止腫瘤再次復發，在根除腫瘤方面效果顯著；
[0029] 在使用所述雙特異性抗體活化的T細胞時，加入不同類型的對T細胞和祀細胞高 親和力的雙特異性抗體，則所述雙特異性抗體活化的T細胞產生特異性殺傷效果，效果類 似于CAR-T的作用；若不加入雙特異性抗體，所述雙特異性抗體活化的T細胞則產生非特 異性殺傷效果，類似于高活性NK或CIK的作用。由于結合在T細胞表面的雙特異性抗體 可W被降解和脫落，雙特異性抗體從T細胞表面消失，此時的T細胞喪失了特異性的殺傷 能力，成為非特異性T細胞，實現了將所述雙特異性抗體活化的T細胞的非特異性一一特異 性一一非特異性殺傷的相互之間的轉變，既可W顧及特異性祀點的殺傷，也可W產生非特 異性殺傷作用，兼顧到腫瘤的不同特性；
[0030] 所述雙特異性抗體活化的T細胞結合高親和力的雙特異性抗體后，其殺傷活性較 CAR-T弱，但安全性遠高于CAR-T，其操作簡單，各個技術環節可控，細胞質量可靠，臨床毒 副作用可控、并且遠低于CAR-T。W治療B細胞惡性疾病為例，由于特異性殺傷和非特異性 殺傷之間的轉換，大部分病人可W避免B細胞缺乏，能有效的減少溶瘤綜合癥、細胞因子風 暴和巨隧細胞活化綜合癥的發生率和運些副作用的嚴重程度。病人一般不會有遠期的不良 反應，如永久性B細胞缺乏癥等；
[0031] 2、本發明所述的雙特異性抗體活化的T細胞的制備方法，所述T細胞抗原為CD3， 所述祀細胞抗原為CD19,祀向所述T細胞抗原表位CD3和祀向祀細胞表面抗原CD19的雙 特異性抗體滿足分子量小于50KD，同時滿足與所述T細胞抗原表位的結合的解離系數大于 1X10 7,與所述祀細胞表面抗原表位的結合的解離系數小于于1X10 9,屬于小分子雙特異 性抗體，保證其在將效應T細胞與祀細胞連接在一起時立即分泌殺傷性因子殺滅祀細胞， 直接引起效應T細胞對祀細胞的殺傷，同時還具備活化T細胞的功能，殺傷性T細胞的活 性、增殖能力和殺傷活性都大幅提高，又由于所述雙特異性抗體與T細胞抗原低親和力，對 祀細胞是高親和力，運種設計使得所述雙特異性抗體可W從T細胞上脫落，使得T細胞特異 性殺傷效果喪失，成為非特異性的殺傷細胞；
[0032] 3、本發明所述的雙特異性抗體活化的T細胞的制備方法，所述祀細胞為滅活的B 細胞，臨床安全的基本保障，臨床安全風險較小；
[0033] 4、本發明所述方法制備的雙特異性抗體活化的T細胞可單獨應用，也可與雙特性 抗體一起使用制備用于免疫治療、預防或治療癌癥或治療微生物感染所致疾病的藥物中的 應用。