檢測血小板α7nAChR活性的方法及其應用
【專利摘要】檢測血小板α7nAChR活性的方法及其應用。檢測血小板α7nAChR陽離子通道的Ca2+內流和檢測α7nAChR對血小板黏附和聚集的作用。通過與α7nAChR非活化狀態相比，選擇性活化α7nAChR能導致血小板的Ca2+內流增加，誘導血小板的黏附率和聚集率增加，以評價血小板的α7nAChR活性。
【專利說明】
檢測血小板a7nAChR活性的方法及其應用
技術領域
[0001]本發明屬于醫學生物技術領域，具體涉及一種檢測血小板a7膽堿能受體(a7nAChR)活性的方法及其應用。
【背景技術】
[0002]血小板(bloodplatelet)是哺乳動物血液中的有形成分之一，是從骨髓成熟的巨核細胞胞質裂解脫落下來的小塊胞質。血小板具有特定的形態結構和生化組成，在血液中有較恒定的數量(人的血小板數為每立方毫米10?30萬)。血小板只存在于哺乳動物血液中。沒有細胞核結構，即沒有染色體。血小板壽命約7?14天，每天約更新總量的1/10-20，衰老的血小板大多在脾臟中被清除。血小板的主要功能是參與凝血和止血過程。
[0003]血小板功能測定主要有血小板黏附、血小板聚集和釋放功能的測定。一定量血液與一定表面積的異物接觸后，即有相當數量的血小板粘附于異物表面，測定表面接觸前后血小板數之差，可得出占血小板總數的百分率即血小板黏附率。聚集功能是指血小板與血小板之間的黏附，顯示活化的血小板相互作用成團的特征，是血小板參與止血和血栓形成過程的重要因素之一。此外，二磷酸腺苷(ADP)、腎上腺素、凝血酶和膠原等都是血小板的致聚劑。不同的致聚劑引起的聚集過程表現有所不同。如ADP可直接引起血小板聚集，而聚集的血小板釋放出ADP可以再次引起新的血小板聚集。從而可以出現兩個聚集波。在富血小板血漿或全血中加入誘導劑連續攪拌能誘發血小板聚集。因此，聚集過程有兩相:I相一一血管壁損傷部位血小板黏附，通過損傷的組織或紅細胞釋放出ADP所致。特點是聚集發生迅速、可逆即聚集后的血小板又自行解聚；Π相一一聚集是由血小板本身釋放的ADP誘導聚集的緩慢過程，且不可逆。膠原本身不能直接引起血小板聚集，只能在誘導血小板釋放ADP后引起血小板聚集。不同激動劑引起血小板活化的信號傳遞機制并不完全相同，但最終均可導致血小板胞質內鈣離子(Ca2+)水平的改變。因此，Ca2+是血小板發揮正常生理功能的重要第二信使。α7亞型乙酰膽堿受體(a7nAChR)是一個配體門控的Ca2+通道受體。我們已確定血小板表達a7nAChR，但是a7nAChR活化是否影響血小板的Ca2+內流、血小板的活化、粘附和聚集功能仍然不清楚。
[0004]在中樞神經細胞，β-淀粉肽(Αβ)由淀粉樣前體蛋白(APP)經β-分泌酶和γ-分泌酶裂解產生的含39-42個氨基酸的多肽，主要有ΑβΗο和Afo-42兩種單體形式。腦內的Αβ水平升高，但是外周血Αβ不增加，甚至顯著低于對照組。其關鍵因素是可溶性Αβ不易穿過血腦屏障才能進人外周血液。Αβι-42/1-40是否影響血小板的a7nAChR功能，血小板活化，血小板粘附和聚集功能迄今沒有報道。

【發明內容】

[0005]解決的技術問題:本發明提供一種高靈敏度和高特異性檢測血小板a7nAChR活性的方法及其應用。
[0006]技術方案:檢測血小板a7nAChR活性的方法，檢測血小板a7nAChR陽離子通道的Ca2+內流和檢測a7nAChR對血小板黏附和聚集的作用，通過與a7nAChR非活化狀態相比，選擇性活化a7nAChR導致血小板的Ca2+內流增加或血小板的黏附和聚集能力增強以反映血小板的a7nAChR 活性。
[0007]檢測血小板a7nAChR的Ca2+內流的具體步驟為:I)采用I丐熒光指示劑孵育血小板，所述該焚光指示劑為單波長激發指示劑:Quin-1、Quin-2、Quin-3、Fluo-3;雙波長激發指示劑:fural、fura2、fura3;或，雙波長發射指示劑:indol ;2)采用雙波長顯微焚光分光光度計、流式細胞儀、雙波長熒光分光光度計等方法檢測血小板內的游離Ca 2+水平;3)然后添加a7nAChR激動劑再次檢測血小板的游離Ca 2+水平，所述激動劑為乙酰膽堿或DMXB; 4)計算出a7nAChR活化后血小板Ca2+增加的幅值，從而反映血小板a7nAChR的活性。
[0008]檢測a7nAChR對血小板黏附促進作用的方法為:I)采用玻璃瓶黏附法、玻璃珠柱法或玻璃濾器法檢測血小板的黏附率;2)檢測添加a7nAChR激動劑后血小板黏附率的改變，所述激動劑為乙酰膽堿或DMXB; 3)計算出a7nAChR激動劑添加后血小板黏附率增加的幅值，從而反映血小板a7nAChR的活性。
[0009]檢測a7nAChR對血小板聚集促進作用的具體步驟為:I)通過采用比濁法血小板聚集試驗、電阻抗法全血血小板聚集試驗、循環血小板聚集體檢測、體外自發性血小板聚集檢測或血小板功能分析儀-100檢測血小板聚集率;2)檢測血小板致聚劑二磷酸腺苷ADPJffl腺素、凝血酶或膠原添加后血小板的聚集率;3)然后檢測血小板致聚劑和a7nAChR激動劑聯合添加時血小板的聚集率;4)計算出a7nAChR激動劑添加后血小板聚集率的增加，從而反映血小板a7nAChR的活性。
[0010]檢測血小板a7nAChR的Ca2+內流的具體步驟為:Ca2+熒光探針負載，取富血小板血漿懸液進行離心，1000r/min，每次10分鐘X 3次，吸出上清液后吹打混勻；取50yL的細胞懸液，加入17yL的Fluo-2鈣探針，放入36.5°C的水浴箱中溫育40分鐘；熒光雙波長分光光度計測定[Ca2+]i，Fura-2的熒光強度，測定用日立F-3000型熒光雙波長分光光度計進行;測定條件為:激發光光柵5nm，發射光光柵1nm，測定溫度為37 ± TC ;取I X 16個細胞負載Fura-2/AM的細胞懸液，加入到測量用熒光杯中，在上述測定條件下，以激發光波長300?450nm，發射光波長500nm進行掃描，檢查熒光峰值達最高時的激發波長，判斷細胞負載情況；以峰值在340nm左右處為最佳負載狀態；測定最大熒光比值RmaJP最小熒光比值Rmin，加破膜劑Triton X-100，終濃度為0.lwt.%，使Fura-2和Ca2+結合達飽和時，測得的Fmq/F.為Rmax;加入高濃度的Ca2+螯合劑EGTA，終濃度為5mM，pH8.5，以充分螯合Ca2+，使Fura_2游離，測得的F34o/F38Q為Rmin;[Ca2+]i的計算，根據經典公式計算細胞內游離[Ca2+]i的濃度，Fura-2/AM檢測的[Ca2+]i計算公式為:[Ca2+]i = Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)，其中，Kd為Fura-2與Ca2+反應的解離常數，為224nM; R為各測定點F3WF38Q焚光強度比值;Rmax、Rmin分別為上述測定的最大和最小熒光比值;Fmin、Fmax分別代表Ca2+為零及飽和時，在380nm激發光下測得的Fura-2熒光強度F38Q;添加a7nAChR激動劑乙酰膽堿O-1OmM或DMXB 0_50yM，a7nAChR拮抗劑a-BTX 1yMgScMLA 10μΜ吹打均勻，孵育1_10分鐘，進行血小板內游離Ca離子濃度測定。
[0011]血小板黏附率的檢測步驟為:吸出抗凝血1.5mL注入長頸玻璃瓶中插到底，再從中取血計算旋轉前血小板數，兩三次求平均數，作為旋轉前血小板數。長頸瓶安插血小板黏附儀后，旋轉15min，每分鐘轉3周，再從長頸瓶中取血，按照常規方法血小板計數兩三次，求平均值為旋轉后血小板數;血小板黏附率=(旋轉前血小板數-旋轉后血小板數)/旋轉前血小板數。
[0012]血小板聚集率的檢測步驟為:用3.8%枸櫞酸鹽抗凝管取靜脈血2mL，血:抗凝劑體積比為1:9，混勻后置入室溫低速800r/min離心8分鐘后，小心取出上層血漿即為富血小板血漿PRP;剩余血樣再以3000r/min的速度離心10分鐘，上層較為透明的液體即為貧血小板血漿PPP ；取PRP 0.4mL和PPP 0.4mL分別加入血小板聚集儀專用兩聯樣本杯內，以二磷酸腺苷ADP為血小板聚集誘導劑，ADP最終濃度為0.5μΜ;通過PRP與PPP透光率的比較，計算血小板聚集率，以反映血小板聚集功能，在2小時完成標本檢測，血小板聚集功能以加誘導劑5分鐘血小板聚集率表示。
[0013]上述檢測血小板a7nAChR活性的方法，米用β-淀粉妝1_42片段(々01—42)抑制血小板a7nAChR的Ca2+內流，降低血小板的聚集能力。
[0014]上述方法在篩選阿爾茨海默病診斷藥物中的應用。
[0015]有益效果:(I)本發明提供了一種檢測血小板a7nAChR活性的方法，通過檢測血小板a7nAChR的Ca2+內流和a7nAChR對血小板黏附和聚集作用可以反映血小板的a7nAChR功能活性；(2)Αβι-42能抑制血小板a7nAChR的Ca2+內流，可以降低血小板聚集。
【附圖說明】
[0016]圖1:人和小鼠的血小板表達a7nAChR的蛋白檢測圖。
[0017]圖2:血小板a7nAChR的Ca2+內流檢測結果圖。圖2-A為選擇性a7nAChR激動劑ACh能劑量依賴地增加血小板內游離Ca2+([Ca2+] i)水平；圖23為選擇性a7nAChR激動劑DMXB也能顯著地增加血小板[Ca2+]i水平；圖2-C是a7nAChR拮抗劑能減少a7nAChR激動劑增加血小板的[Ca2+]i水平。
[0018]圖3:a7nAChR活化促進血小板黏附和聚集的檢測結果圖。圖3-A為a7nAChR激動劑增加血小板的黏附率;圖3-B為a7nAChR激動劑提高血小板的聚集率。
[0019]圖LA^1-42能抑制血小板a7nAChR的Ca2+內流和a7nAChR促進血小板聚集的檢測結果圖。圖4-A為Αβ!—42抑制a7nAChR激動劑增加血小板[Ca2+]i水平；圖4-B為Αβ!—42抑制a7nAChR激動劑增加血小板的聚集率。
[0020]圖5:APPswe/PSldE9(APP/PSl)轉基因AD小鼠腦的Αβ!—42水平增加，外周血中血小板的她-42水平也增加的檢測結果圖。圖5-Α為8-10月齡APP/PS1小鼠海馬和皮層的她-42水平增加；圖5-Β顯示APP/PS1小鼠血漿中Αβ!—42水平沒有改變；圖5-C為8-10月齡APP/PS1小鼠血小板的Afo-42水平增加；圖5-D提示APP/PS1小鼠血小板的a7nAChR表達量沒有改變。
[0021 ] 圖6:在APP/PS1小鼠，血小板a7nAChR的Ca2+內流減少和a7nAChR促進血小板聚集作用降低的檢測結果圖。圖6-A顯示在8-10月齡APP/PS1小鼠，a7nAChR激動劑增加血小板[Ca2+ ]i的作用降低；圖6-B是8-10月齡APP/PS1小鼠的a7nAChR激動劑增加血小板聚集率的作用減弱。
【具體實施方式】
[0022]以下結合附圖和實施例進一步說明(I)檢測血小板a7nAChR的Ca2+內流和a7nAChR調節血小板黏附和聚集可以作為評價血小板a7nAChR功能活性的指標；(2)體外實驗顯示Afo-42對血小板的a7nAChR活性有抑制作用；(3)在體實驗發現中樞神經系統她-42/1-4()濃度增加能引起外周血中血小板的a 7nAChR活性降低。
[0023]實施例1人和小鼠的血小板表達a7nAChR
[0024]〈實驗主要材料〉
[0025]ICR小鼠(雄性和雌性各10只)，體重25?30克，購自江蘇省實驗動物中心。用3.8%枸櫞酸鹽抗凝管抽取人肘靜脈或小鼠的內眥取血2mL(血:抗凝劑體積比為1:9)，混勻后置入室溫低速800r/min離心8分鐘后，小心取出上層血漿即為富血小板血漿(PRP)。剩余血樣再以3000r/min的速度離心10分鐘，上層較為透明的液體即為貧血小板血漿(PPP)。
[0026]〈實驗操作〉
[0027]蛋白免疫印記(Western Blot)檢測。WB檢測標本準備:血漿中加入RIPA蛋白裂解液(主要包括磷酸酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、PMSF等成分)，超聲勻漿，冰中靜置30分鐘，40C離心(12000rpm) 15分鐘，取上清。用BCA法測蛋白濃度，標本分裝，在-70°C保存。小鼠海馬組織置于離心管中，加入RIPA蛋白裂解液，用超聲粉碎儀進行裂解后，4°C離心(12000rpm)15分鐘，取上清。BCA法測定蛋白濃度，上清液置于-80°C保存。將檢測樣本與上樣緩沖液混合，100 0C加熱5分鐘，混勻離心后取上清加入制作好的SDS-PAGE膠，恒壓100V進行蛋白電泳。而后將膠轉至PVDF膜、封閉，之后分別加小鼠單克隆抗a7nAChR—抗，4°C孵育過夜。用Blot-buffer洗5分鐘X 3次，再與HRP標記的二抗室溫反應2小時。Blot-buffer洗5分鐘X 3次，ECL化學發光顯色，化學發光成像系統曝光條帶、拍照、存檔。之后將PVDF膜用抗體洗脫液洗5分鐘X3次，重新封閉后分別加actin—抗及相應二抗，再次顯色曝光。用圖像分析軟件ImageJ(NIH Image，美國)進行灰度值分析，計算目的蛋白的灰度值與actin的比值，確定a7nAChR的相對含量。
[0028]〈實驗結果>
[0029]Western B lot檢測結果顯示，人和小鼠的血小板都表達a7nAChR蛋白(圖1)。為了確定檢測的條帶是a7nAChR特異性的，(I)用腦的海馬組織作為陽性對照(b); (2)采用貧血小板血漿作為陰性對照(c); (3)采用血清標本作為陰性對照(d) ο 表示P〈0.05(與海馬組織相比)；“##表示” P〈0.01 (與富血小板血漿相比)。
[0030]實施例2血小板a7nAChR的Ca2+內流。
[0031 ]〈實驗主要材料〉
[0032]同實施例1。
[0033]選擇性a7nAChR 激動劑乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)，a7nAChR 拮抗劑a-BGT(a-bungaro toxin)、MLA (me thy 1-1ycaconi tine)從Sigma公司購買，選擇性 a7nAChR 激動劑 3-(2，4-(1;[11161:11(?5^6112:71丨(16116)-&11&匕&86；[116(0]\1?(13，又稱613-21)由日本大昭制藥公司提供。
[0034]〈實驗操作〉
[0035]血小板內游離Ca2+([Ca2+] i)濃度測定:Ca2+熒光探針負載，取富血小板血漿懸液進行離心，1000r/min，每次1分鐘X 3次，吸出上清液后吹打混勻。取50yL的細胞懸液，加入17yL的Fluo-2鈣探針，放入36.5 °C的水浴箱中溫育40分鐘。熒光雙波長分光光度計測定[Ca2+]i，Fura-2的熒光強度測定用日立F-3000型熒光雙波長分光光度計進行。測定條件為:激發光光柵5nm，發射光光柵10nm，測定溫度為(37±1)°C。取一定量(1乂106個細胞)負載Fura-2/AM的細胞懸液，加入到測量用熒光杯中，在上述測定條件下，以激發光波長300?450nm，發射光波長500nm進行掃描，檢查熒光峰值達最高時的激發波長，判斷細胞負載情況。以峰值在340nm左右處為最佳負載狀態。
[0036]測定最大熒光比值(Rmax)和最小熒光比值(Rmin)。加破膜劑Triton X_100(終濃度為0.1wt.% )，使Fura-2和Ca2+結合達飽和時，測得的F34Q/F38Q為Rmax。加入高濃度的Ca2+螯合劑EGTA(終濃度為5mM，pH8.5)，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游離，測得的Fmq/F.為Rmin。[ Ca2+ ]工的計算，根據經典公式計算細胞內游離cZaCalO的濃度。Fura-2/AM檢測的[Ca2+M+算公式為:[Ca2+]i = Kd[(R-Rmin)/(Rmax-R)](Fmin/Fmax)。其中，Kd為Fura-2與Ca2+反應的解離常數，為224nM; R為各測定點F3WF38q焚光強度比值;Rmax、Rmin分別為上述測定的最大和最小熒光比值。Fmin、Fmax分別代表Ca2+為零及飽和時，在380nm激發光下測得的Fura-2熒光強度(F38q)。實際計算由日立F-3000鈣測定系統鈣定量軟件自動求出。
[0037]添加a7nAChR 激動劑乙酰膽堿(ACh^-KMOSDMXBW-SOyMhc^nAChl^^J^lJa-BTX (I ΟμΜ)或MLA (I ΟμΜ)吹打均勻，孵育1-10分鐘，進行血小板內游離Ca離子濃度測定。在圖2中A和B顯示的結果是用沒有加a7nAChR激動劑標本的結果(％)進行了標準化。在圖2中C顯示的結果是用單純加ACh(5mM)或DMXB(5yM)標本的結果(％)進行了所有數據的標準化。
[0038]〈實驗結果>
[0039]當細胞外液Ca2+濃度是2mM時，選擇性a7nAChR激動劑ACh能劑量依賴地增加血小板內游離Ca2+([Ca2+]i)水平(圖2-AhACh增加血小板[Ca2+]i的最大劑量是5mM。**/*表示P〈
0.01和P〈0.05。同樣，另一個選擇性a7nAChR激動劑DMXB也能顯著地增加血小板[Ca2+] i水平(圖2-B)。其作用的最大劑量為10μΜ。**表示Ρ〈0.01。
[0040]在沒有a7nAChR激動劑處理的標本，雖然a7nAChR拮抗劑Q-BTX(1yM)SMLA(1yM)添加能減少血小板的[Ca2+]i水平(圖2-C)，但是沒有統計學差異。在a7nAChR激動劑處理的標本，a7nAChR拮抗劑α-ΒΤΧ或MLA處理能完全阻斷ACh(5mM)誘導的血小板[Ca2+]i增加。**表示P〈0.01 (與細胞外液Ca2+濃度=0時相比)；##表示P〈0.01 (與沒有加ACh時相比)；++表示P〈0.01 (與加ACh時相比)。這些結果提示，a7nAChR活化能增加血小板的[Ca2+] i水平。
[0041]實施例3a7nAChR活化能促進血小板的黏附和聚集。
[0042]〈實驗主要材料〉
[0043]同實施例1和實施例2。
[0044]〈實驗操作〉
[0045]血小板黏附實驗方法:吸出抗凝血1.5mL注入長頸玻璃瓶中插到底，再從中取血計算旋轉前血小板數，兩三次求平均數，作為旋轉前血小板數。長頸瓶安插血小板黏附儀后，旋轉15min，每分鐘轉3周，再從長頸瓶中取血，按照常規方法血小板計數兩三次，求平均值為旋轉后血小板數。(旋轉前血小板數-旋轉后血小板數)/旋轉前血小板數=血小板黏附率。正常值:20-40 %。
[0046]血小板聚集率采用比濁法測定:用3.8wt.%枸櫞酸鹽抗凝管取靜脈血2mL(血:抗凝劑體積比為1:9)，混勻后置入室溫低速800r/min離心8分鐘后，小心取出上層血漿即為富血小板血楽(PRP)。剩余血樣再以3000r/min的速度離心10分鐘，上層較為透明的液體即為貧血小板血漿(PPP)。取PRP(0.4mL)和PPP(0.4mL)分別加入血小板聚集儀(北京普利生公司LBY—NJ4型)專用兩聯樣本杯內，以二磷酸腺苷(ADP)為血小板聚集誘導劑(ADP最終濃度為
0.5μΜ)。通過PRP與PPP透光率的比較，計算血小板聚集率，以反映血小板聚集功能。在2小時完成標本檢測。血小板聚集功能以加誘導劑5分鐘血小板聚集率表示。正常值為20-40%。在圖中顯示的結果是用單純加乙酰膽堿ACh(5mM)或DMXB(5yM)標本的結果(％)進行了所有數據的標準化。
[0047]〈實驗結果>
[0048]血小板的黏附率(圖3- A)和二磷酸腺苷(A D P)誘導的血小板聚集率(圖3 - B)。α7nAChR拮抗劑α-ΒΤΧ(ΙΟμΜ)或MLA(1yM)處理不能減少血小板的黏附率和聚集率。與對照組水平相比，選擇性a7nAChR激動劑ACh(5mM)或DMXB(5yM)添加能顯著地增加血小板的黏附率和聚集率。此外，a7nAChR拮抗劑a-BGT或MLA預處理能阻止ACh和DMXB促進血小板的黏附和聚集。圖3-A和圖3-B中，**/*表示P〈0.01和P〈0.05 (與沒有加ACh或DMXB的對照組相比).’##表示P〈0.01 (與加ACh時相比)；++表示P〈0.01 (與加DMXB時相比)。這些結果提示，a7nAChR活化能促進血小板的黏附和聚集。
[0049]實施例4 Aft—42能抑制血小板的a7nAChR活性。
[0050]〈實驗主要材料〉
[0051 ] 同實施例1-3。
[0052]Αβι—42從Sigma公司購買。將Αβι—42肽段Img溶于0.33mL無菌雙蒸水中，濃度為3mmol/L，封口膜封好后，置于37°C水浴箱中孵育4天，使其成為聚集態。使用前用生理鹽水稀釋到終濃度。
[0053]〈實驗操作〉
[0054]血小板內Ca2+測定:同實施例2。
[0055]血小板聚集率測定:同實施例3。
[0056]在圖中顯示的結果是用不加a7nAChR激動劑標本的結果(％)進行了所有數據的標準化。
[0057]〈實驗結果>
[0058]與對照組相比，選擇性a7nAChR激動劑ACh( ImM)或DMXB(5μΜ)能增加血小板[Ca2+] i水平(圖4-A)和血小板的聚集率(圖4-B)。與a7nAChR拮抗劑MLA的作用相同，Αβι-42 ( 50μΜ)處理血小板5-10分鐘能明顯抑制ACh和DMXB增加血小板[Ca2+] i水平和血小板的聚集率。但是，Afo—42(50M)處理不影響a7nAChR不活化狀態的血小板[Ca2+]i和血小板聚集率。圖4-A和圖4-B中，#/*表示P〈0.01和P〈0.05 (與沒有加ACh或DMXB的對照組相比)；##/#表示P<0.01和卩〈0.05 (與加ACh相比)；++/+表示P〈0.01和P〈0.05 (與加DMXB相比)。這些結果提示，Afo-42能抑制血小板的a7nAChR活性。
[0059]實施例5APP/PS1小鼠腦和血小板的A&-42濃度增加，而外周血沒有改變。
[0060]〈實驗主要材料〉
[0061 ] APPswe/PSldE9雙轉基因型小鼠(以下簡稱，APP/PS1小鼠)從Jackson實驗室(BarHarbor，ME，USA)購得，運用Jackson實驗室推薦的PCR方法進行基因型鑒定。
[0062]〈實驗操作〉
[0063]小鼠用水合氯醛(100mg/kg)腹腔麻醉后快速斷頭取腦，鏡下分離兩側海馬局部組織。小鼠海馬和皮層組織置于離心管中，加入RIPA蛋白裂解液，超聲粉碎儀裂解后低溫高速離心15分鐘(12000rpm，4°C)，取上清液，BCA法測定蛋白濃度，上清液置于_80 °C保存。
[0064]Aβ1-42蛋白采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)測定:試劑盒由比利時Innogenetics公司提供。用包被緩沖液稀釋特異性抗體至最適濃度(I?10yg/mL)，每凹孔加0.3mL，4 °C過夜。移去包被液，用洗滌緩沖液(含0.05wt.%吐溫-20)洗3次，每次5分鐘。加入0.2mL用稀釋緩沖液稀釋的含抗原的被檢標本，37°C作用2小時。移去包被液，用洗滌緩沖液(含0.05wt.%吐溫-20)洗3次，每次5分鐘。加入0.2mL用稀釋緩沖液稀釋的酶標記特異性抗體溶液，37 °C作用2小時。用洗滌緩沖液洗3次。加入0.2mL底物溶液于每個凹孔(OPD或0T)，室溫作用30分鐘(另作一空白對照，0.4mL底物加0.1mL終止劑)。加終止劑(2M H2SO4或2M梓檬酸0.05mL)。用酶標比色計測定((PD用492nm)0D值。根據標準管濃度及吸光度建立標準曲線，并根據各孔的吸光度計算Ai^42蛋白濃度。在圖中顯示的結果是用野生型小鼠標本的結果(％ )進行了所有數據的標準化。
[0065]〈實驗結果〉
[0066]與野生型小鼠相比，8-10月齡APP/PS1小鼠海馬和皮層的Afo—42濃度增加近3倍(圖5-A)。與野生型小鼠相比，8-10月齡六??/^31小鼠血漿的Αβ!—42濃度沒有改變(圖5-Β)，但血小板的Α?^-42濃度增加18 % (圖5-C)。與野生型小鼠相比，8-10月齡APP/PS1小鼠血小板的α7nAChR表達水平也沒有明顯差異(圖5-D)。圖5-A和圖5-C中，**/*表示P〈0.01和P〈0.05 (與野生型小鼠相比)。這些結果提示，外周血的Ai^42濃度沒有增加，但是血小板流入腦內可以與Αβ?—42結合。
[0067]實施例6 APP/PS1小鼠血小板的a7nAChR活性降低。
[0068]〈實驗主要材料〉
[0069]同實施例5。
[0070]〈實驗操作〉
[0071]細胞內Ca2+測定:同實施例2。
[0072]血小板聚集率測定:同實施例3。
[0073]在圖中顯示的結果是用a7nAChR激動劑處理野生型小鼠標本的結果(％)進行了所有數據的標準化。
[0074]〈實驗結果>
[0075]以10月齡野生型小鼠a7nAChR激動劑DMXB (5μΜ)增加血小板[Ca2+ ] i水平(圖6-A)和血小板聚集率作為100%。在8-10月齡APP/PS1小鼠，DMXB增加血小板[Ca2+]i水平和血小板聚集率的作用明顯降低。同樣，a7nAChR拮抗劑MLA處理10月齡野生型小鼠也能抑制DMXB增加血小板[Ca2+] i水平和血小板聚集率(圖6-B)。結合實施例4和實施例5的結果進一步提示，Afo-42濃度增加可以引起血小板a7nAChR活性減弱。圖6_A和圖6-B中，**/*表示P〈0.01和卩〈
0.05(與野生型小鼠相比)。這些結果提示，檢測血小板a7nAChR活性可以間接地反映腦脊液的Αβ?—42水平。
【主權項】
1.檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于檢測血小板a7nAChR陽離子通道的Ca2+內流和檢測a7nAChR對血小板黏附和聚集的作用，通過與a7nAChR非活化狀態相比，選擇性活化a7nAChR導致血小板的Ca2+內流增加或血小板的黏附和聚集能力增強以反映血小板的a7nAChR 活性。2.根據權利要求1所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于檢測血小板a7nAChR的Ca2+內流的具體步驟為:1)采用鈣熒光指示劑孵育血小板，所述該熒光指示劑為單波長激發指示劑:Quin-1、Quin-2、Quin-3、Fluo-3 ；雙波長激發指示劑:fural、fura2、fura3;或，雙波長發射指示劑:indol;2)采用雙波長顯微熒光分光光度計、流式細胞儀、雙波長熒光分光光度計等方法檢測血小板內的游離Ca2+水平;3)然后添加a7nAChR激動劑再次檢測血小板的游離Ca2+水平，所述激動劑為乙酰膽堿或DMXB; 4)計算出a7nAChR活化后血小板Ca2+增加的幅值，從而反映血小板a7nAChR的活性。3.根據權利要求1所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于檢測a7nAChR對血小板黏附促進作用的方法為:I)采用玻璃瓶黏附法、玻璃珠柱法或玻璃濾器法檢測血小板的黏附率;2)檢測添加a7nAChR激動劑后血小板黏附率的改變，所述激動劑為乙酰膽堿或01?8;3)計算出€[71^011?激動劑添加后血小板黏附率增加的幅值，從而反映血小板€[71^011?的活性。4.根據權利要求3所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于檢測a7nAChR對血小板聚集促進作用的具體步驟為:I)通過采用比濁法血小板聚集試驗、電阻抗法全血血小板聚集試驗、循環血小板聚集體檢測、體外自發性血小板聚集檢測或血小板功能分析儀-100檢測血小板聚集率;2)檢測血小板致聚劑二磷酸腺苷ADP、腎上腺素、凝血酶或膠原添加后血小板的聚集率;3)然后檢測血小板致聚劑和a7nAChR激動劑聯合添加時血小板的聚集率;4)計算出a7nAChR激動劑添加后血小板聚集率的增加，從而反映血小板a7nAChR的活性。5.根據權利要求2所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于檢測血小板a7nAChR的Ca2+內流的具體步驟為:Ca2 +熒光探針負載，取富血小板血漿懸液進行離心，1000r/min，每次10分鐘X 3次，吸出上清液后吹打混勻；取50yL的細胞懸液，加入17yL的Fluo-2鈣探針，放入36.5°C的水浴箱中溫育40分鐘；熒光雙波長分光光度計測定[Ca2+]i，Fura-2的熒光強度，測定用日立F-3000型熒光雙波長分光光度計進行;測定條件為:激發光光柵5nm，發射光光柵10nm，測定溫度為37 ± 1°C ;取I X 16個細胞負載Fura-2/AM的細胞懸液，加入到測量用熒光杯中，在上述測定條件下，以激發光波長300?450nm，發射光波長500nm進行掃描，檢查熒光峰值達最高時的激發波長，判斷細胞負載情況；以峰值在340nm左右處為最佳負載狀態;測定最大熒光比值Rmax和最小熒光比值仏^，加破膜劑Triton X-100,終濃度為0.lwt.%，使Fura-2和Ca2+結合達飽和時，測得的F3WF38q為Rmax;加入高濃度的Ca2+螯合劑EGTA，終濃度為5mM，pH8.5，以充分螯合Ca2+，使Fura-2游離，測得的Fmq/F.為Rmin;[Ca2+]^計算，根據經典公式計算細胞內游離[Ca2+]^濃度，Fura-2/AM檢測的[[一+^計算公式為:[Ca2+ ] i = Kd [ (R-Rmin) / (Rmax-R) ] (Fmin/Fmax)，其中，Kd為Fura-2與Ca2+反應的解離常數，為224nM;R為各測定點F34Q/F38Q焚光強度比值;Rmax、Rmin分別為上述測定的最大和最小熒光比值;Fmin、Fmax分別代表Ca2+為零及飽和時，在380nm激發光下測得的Fura-2熒光強度F380 ;添加a7nAChR激動劑乙酰膽堿O-1OmM或DMXB 0_50yM，a7nAChR拮抗劑a-BTX 1yMSMLA 10μM吹打均勻，孵育1-10分鐘，進行血小板內游離Ca離子濃度測定。6.根據權利要求3所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于血小板黏附率的檢測步驟為:吸出抗凝血1.5mL注入長頸玻璃瓶中插到底，再從中取血計算旋轉前血小板數，兩三次求平均數，作為旋轉前血小板數。長頸瓶安插血小板黏附儀后，旋轉15min，每分鐘轉3周，再從長頸瓶中取血，按照常規方法血小板計數兩三次，求平均值為旋轉后血小板數;血小板黏附率=(旋轉前血小板數-旋轉后血小板數)/旋轉前血小板數。7.根據權利要求4所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于血小板聚集率的檢測步驟為:用3.8 %枸櫞酸鹽抗凝管取靜脈血2mL，血:抗凝劑體積比為1:9，混勻后置入室溫低速800r/min離心8分鐘后，小心取出上層血漿即為富血小板血漿PRP;剩余血樣再以3000r/min的速度離心10分鐘，上層較為透明的液體即為貧血小板血漿PPP；取PRP 0.4mL和PPP 0.4mL分別加入血小板聚集儀專用兩聯樣本杯內，以二磷酸腺苷ADP為血小板聚集誘導劑，ADP最終濃度為0.5μΜ;通過PRP與PPP透光率的比較，計算血小板聚集率，以反映血小板聚集功能，在2小時完成標本檢測，血小板聚集功能以加誘導劑5分鐘血小板聚集率表示。8.根據權利要求1?7任一所述檢測血小板a7nAChR活性的方法，其特征在于采用β-淀粉肽1-42片段(Afo—42)抑制血小板a7nAChR的Ca2+內流，降低血小板的聚集能力。9.權利要求1?7任一所述方法在篩選阿爾茨海默病診斷藥物中的應用。
【文檔編號】G01N33/49GK105891175SQ201610203535
【公開日】2016年8月24日
【申請日】2016年4月1日
【發明人】陳玲, 張寶峰, 張婷婷, 曹馨元, 繆冶煉
【申請人】南京醫科大學, 南京旭之源醫藥科技有限公司