一種檢測線粒體dna c1494t突變的試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學檢測領域，具體的本發明提供了一種檢測線粒體DNAC1494T突變的試劑盒，此外本發明還提供了該試劑盒在預測美尼爾氏病發病可能性中的應用。
【背景技術】
[0002]美尼爾氏病，又稱眩暈癥、內耳眩暈癥、膜迷路積水，是一種常見病、多發病。本病癥狀的出現是由內耳膜迷路內積水膨脹，壓迫內耳終器所致。有如下4個癥狀:眩暈、耳聾、耳鳴及耳內悶脹感。其中眩暈多為突然發作的旋轉性眩暈。患者常感周圍物體圍繞自身沿一定的方向旋轉，閉目時癥狀可減輕。常伴惡心、嘔吐、面色蒼白、出冷汗、血壓下降等自主神經反射癥狀。頭部的任何運動都可以使眩暈加重。患者意識始終清楚，個別患者即使突然摔倒，也保持著清醒狀態。眩暈持續時間多為數10分鐘或數小時，最長者不超過24小時。眩暈發作后可轉入間歇期，癥狀消失，間歇期長短因人而異，數日到數年不等。眩暈可反復發作，同一患者每次發作的持續時間和嚴重程度不盡相同，不同患者之間亦不相同。且眩暈發作次數越多，每次發作持續時間越長，間歇期越短。
[0003]據報道，約20%的美尼爾氏病患者有家族史，該疾病很可能是一種基因與環境共同作用所致的疾病，目前已研究的致病基因主要包括凝血因子C同源物基因(C0CH)、人白細胞抗原基因(HLA)、水通道蛋白基因(AQP)和鉀離子通道基因(KCNE)。

【發明內容】

[0004]發明人通過分析大量臨床樣本，發現線粒體DNA C1494T突變與美尼爾氏病顯著相關。該發現提供了一種預測美尼爾氏病發病可能性的新方法，為美尼爾氏病的早期診斷、預防提供了新的思路。
[0005]—方面，本發明提供了一種檢測線粒體DNA C1494T突變的試劑盒，其包含一對引物:
引物 1:tacgaaagtggctttaacata，
引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
[0006]另一方面，本發明提供了該試劑盒在在預測美尼爾氏病發病可能性中的應用。
[0007]進一步的方法，應用包括使用試劑盒中的引物擴增待測對象基因組DNA樣品后電泳檢測，如果得到494bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變，進而有較高的美尼爾氏病發病可能性。
[0008]再另一個方面，本發明提供了引物對在制備預測美尼爾氏病發病可能性的試劑盒中的應用，其中引物對序列為:
引物 1:tacgaaagtggctttaacata，
引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
[0009]
【具體實施方式】
[0010]引物設計與合成
使用引物設計軟件Primer Premier 6.0，根據Genbank中的人線粒體DNA序列設計檢測C1494T突變的引物對:
引物 1:tacgaaagtggctttaacata，
引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
[0011]設計的引物對由上海英駿公司合成。
[0012]具體檢測過程樣品處理:
取這待測者的血濾紙片，將血濾紙片剪碎紙片放入1.5ml Eppendorf管，加入900 μ I紅細胞裂解緩沖液(20mmol/L Tris-HCl，pH 7.6)室溫靜置lOmin，充分裂解紅細胞，12000rpm離心lmin，收集白細胞沉淀；在裝有白細胞沉淀的1.5mlEP管中加入600 μ I的細胞裂解液(10mmol/L Tris-Cl、lmmol/L EDTA、0.1% SDS, pH 8.0)和 3μ1 的蛋白酶溶液(20mg/ml蛋白酶K)，充分混勻，55°C恒溫消化裂解2?3h ;待消化液降至室溫，加入200 μ I預冷5mol/L醋酸鉀溶液，充分混勻，12000rpm_4°C離心15min ;取約700 μ I上清加A600 μ I異丙醇于一新的1.5ml Eppendorf管中，充分混勾，-20°C冰浴30min后，12000rpm離心1min收集DNA沉淀；加入600 μ I乙醇洗滌DNA沉淀，12000rpm離心5min，棄上清，待乙醇揮發干燥后用高壓滅菌水或TE緩沖液溶解后-20°C保存備用。
[0013]PCR 過程:
PCR 反應體系為 1xPCR 緩沖液 4 μ UdNTP (2.5mM) 2.5 μ UMgCl2 (25mM) 2.5 μ 1、引物 I (5μΜ) 0.5 μ 1、引物 2 (5 4]\00.5“1、丁&1酶(51]/^1) 0.5 μ 1、模板 DNA 50ng、雙蒸水補充至25 μ I。
[0014]PCR反應過程為94°C預變性5min ;94°C變性30s，63°C退火30s，72°C延伸30s，循環7次；94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，重復循環30次；72°C延伸5min。
[0015]電泳方法為PCR產物10 μ I在2%的瓊脂糖凝膠中電泳，經EB染色后在紫外線檢測儀上觀察并照相記錄結果。
[0016]結果判讀方法為如果得到494bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變；如果未發現494bp片段，則表明樣品主體沒有C1494T突變。
[0017]引物特異性驗證
選取下面第4部分中的陰性樣本(無C1494T突變)10例，陽性樣本6例(有C1494T突變)進行了線粒體DNA 12S rRNA直接測序分析，結果與使用本發明引物PCR檢測結果完全相同，證明了本發明的引物對具備良好的特異性和準確性。
[0018]美尼爾氏病與C1494T突變的關聯分析
選取臨床中發現的一個中國北方美尼爾氏病家系中的9位患者(分布在2代中)和4位非患者，以及100名無血緣關系的正常對照，按照【具體實施方式】第2部分的方法進行檢測。
[0019]家系中所有9位患者里均發現了 C1494T突變；家系中4位非患者里I位有C1494T突變，3位無C1494T突變；100名無血緣關系的正常對照中2位有C1494T突變，98位無C1494T 突變。
[0020] 結果初步表明了 C1494T突變與美尼爾氏病之間存在一定關聯性。
【主權項】
1.一種檢測線粒體DNA C1494T突變的試劑盒，其包含一對引物:引物 1:tacgaaagtggctttaacata，引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD2.權利要求1的試劑盒在預測美尼爾氏病發病可能性中的應用。3.權利要求2的應用，該應用包括使用試劑盒中的引物擴增待測對象基因組DNA樣品后電泳檢測，如果得到494bp片段，則表明樣品主體有C1494T突變，進而有較高的美尼爾氏病發病可能性。4.引物對在制備預測美尼爾氏病發病可能性的試劑盒中的應用，其中引物對序列為:引物 1:tacgaaagtggctttaacata，引物 2:tttgaagtatacttgggaagaD
【專利摘要】本發明公開了一種檢測線粒體DNA？C1494T突變的試劑盒，其包含一對引物，引物1：tacgaaagtggctttaacata，引物2：tttgaagtatacttgggaaga。此外，本發明還提供了該試劑盒在預測美尼爾氏病發病可能性中的應用。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105002289
【申請號】CN201510473333
【發明人】于剛, 菅慧蓉, 陳剛, 李赟, 張天陽, 代小燕, 王國濤
【申請人】于剛
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年8月5日