專利名稱：頂體蛋白的用途及提取方法
技術領域：
本發明涉及頂體蛋白的用途及制備方法。
背景技術：
眾所周知，腫瘤是當前嚴重影響人類健康，威脅人類生命的主要疾病之一，已成為人類致死的首要原因。據統計，中國每年有160萬人死于癌癥，世界上每年有740萬人死于癌癥。雖然目前治療癌癥的藥物和治療手段不斷在更新，但癌癥發病率和死亡率仍在不斷增加，預計2030年全世界將有超過1200萬人死于癌癥。癌是機體正常細胞快速產生異常細胞，并發生轉移，擴散到其他器官，同時異常細胞增生過程中，吸收營養，破壞人體免疫力和抵抗力，導致機體功能紊亂，失去平衡，最終導致人死亡。目前國際上對癌癥病因及發病機理尚未完全認識，對于癌癥的治療，常規療法無外乎手術治療、藥物化療、放射性治療和以毒攻毒等。他們對癌癥的治療雖能起一定作用， 使部分患者病情暫時好轉，但容易再次復發和轉移，同時正常的組織細胞及機體免疫力不可避免地在治療過程中受損，給患者帶來難以忍受的痛苦和食欲不振、嘔吐、發燒、大小便失禁、抑郁、失眠等癥狀，患者生活質量嚴重降低。經過傳統的化學治療后，患者會頭發脫落、骨瘦如柴，不能飲食吞咽。致使許多患者未死于癌癥而死于放化療和手術。當這些弊端日益顯現時，一些人進而轉向基因和免疫學等途徑，但迄今未取得實質性的進展。專利CN200710017785. 3已描述了動物精液藥材在治療腫瘤、抑郁癥等多種疾病中的藥物應用，專利申請201010219062. 3描述了動物精液凍干粉的制備方法。但精液的主要成分為水，約占90%以上，在有形成分中，除成熟精子外，尚有1 %的其他細胞，如未成熟的精原細胞、精母細胞以及生殖管道脫落的上皮細胞和少量白細胞，除細胞外，精液內還含有脂肪及蛋白質顆粒、色素顆粒、前列腺液的磷脂小體，無機鹽、酶類、乳酸及果糖等；現有技術并未確定動物精液中何種物質起到治療腫瘤、抑郁癥等疾病的作用，直接應用動物精液制備的藥物純度也較低，因此效用較差，患者的服用劑量大。

發明內容
本發明提供的頂體蛋白的用途及提取方法，主要解決了現有應用動物精液制備治療腫瘤、抑郁癥等多種疾病中的藥物純度低、需服用的劑量大及精液中的非特異性蛋白、脂肪和糖類化合物等雜質對治療效果的干擾的問題；本發明提供的頂體蛋白的用途及提取方法，極大地提高了藥物的純度和藥效，突破了現有技術的局限性。本發明的具體技術解決方案如下頂體蛋白可以用于抑制癌細胞的擴散，尤其是用于抑制MCF-7、Bel7402、BGC823、 A2780、A549或HCT-8細胞的擴散。頂體蛋白在制備治療癌癥、抑郁癥的藥物中的應用。癌癥包括婦科腫瘤、消化道腫瘤、肺癌、肝癌、白血病和惡性淋巴瘤；婦科腫瘤包括子宮肌瘤、卵巢癌、乳房瘤、乳腺癌和宮
3頸癌；消化道腫瘤包括食道癌、胃癌、大腸癌。頂體蛋白可以用于制備膠囊、顆粒、片劑、滴丸、中西藥復方制劑、口服液或注射液。本發明頂體蛋白提純通過下述方法得到1]取動物精液或復溶的動物精液凍干粉，動物精液一般選擇健康驢、牛、羊或馬的精液，其中優選為驢精液；向其中加入濃度為1 % 5%的稀酸溶液，再加入無機酸將PH調節至2 5，以2000r/min 8000r/min的轉速離心15 30min后棄去沉淀物，較佳范圍為離心轉速2500r/min 6000r/min，離心時間7 20min ；然后將得到的上清液合并，濃縮； 其中， 5%的稀酸溶液可選醋酸溶液、甲酸溶液、丙酸溶液、丁酸溶液、鹽酸溶液、氫溴酸溶液、硫酸溶液、磷酸溶液等，其中優選為醋酸溶液，稀酸溶液濃度為 5%，較佳范圍為1. 7% 4. 5%，優選為2% ；調節pH的無機酸為lmol/L的硫酸、鹽酸、氫溴酸或磷酸， 其中優選為鹽酸；無機酸調節PH范圍為2 5，優選為2. 8 4. 6，最佳pH為3 ；其中動物精液與稀酸的質量比為1 1 1 20，較佳范圍為1 2 1 15，最優比為1 4 ；動物精液凍干粉與復溶溶劑水的質量比為1 1 1 20，較佳范圍為1 5 1 15，最優比為1 10，其中動物精液凍干粉復溶溶液與稀酸的質量比為1 1 1 16，較佳范圍為1 2 1 12，最優比為1 5. 5 ；2]向步驟1處理所得的上清液中加入無機銨鹽，調節飽和度至0. 2-0. 5后在4°C 環境中放置3-5小時，飽和度的調節的較佳范圍為0. 25-0. 48，優選為0. 3 ；再以2000r/ min 8000r/min離心15 30min，較佳范圍為離心轉速2500r/min 6000r/min，離心時間7 20min ；然后棄去上清液，沉淀用醋酸緩沖溶液溶解后，得到頂體蛋白粗提物；無機銨鹽包括硫酸銨、硫酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫銨、磷酸銨等，其中優選的為硫酸銨；醋酸緩沖溶液為0. lmol/L, pH為1. 8 4，較佳范圍為2 3. 5，優選pH為2 ；3]將經步驟3處理所得的蛋白粗提物進行柱層析，用醋酸緩沖溶液平衡洗脫，處理完成后收集洗脫液；一般是用葡聚糖凝膠柱、羥丙基葡聚糖凝膠柱、丙烯酰胺凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱進行柱層析，其中優選的為葡聚糖凝膠柱和羥丙基葡聚糖凝膠柱；醋酸緩沖溶液是PH = 2,0. lmol/L的醋酸緩沖溶液，醋酸緩沖溶液平衡洗脫的流速為0. 5ml/min，處理完成后收集在680nm處有最大吸收的洗脫液；4]將洗脫液以2000r/min 8000r/min離心5 lOmin，棄去上清液，所得沉淀洗滌后以2000r/min 8000r/min繼續離心1 3次，每次離心5 lOmin，收集沉淀，即得到
頂體蛋白。本發明的優點在于本發明通過大量的實驗研究，突破現有技術應用上的局限性，獲取了頂體蛋白在治療子宮肌瘤、乳房瘤、胃癌、肺癌、肝癌、白血病、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤及治療抑郁癥等疾病的藥物中的應用；極大地提高了該類藥物的純度，并降低了患者的服用劑量和動物精液凍干粉中含有的其他物質可能造成的影響。經檢測，動物精液中頂體蛋白含量約為0. 0.4%。經提純后，頂體蛋白含量大于90%，與動物精液或其凍干粉相比，藥物濃度得到了很大提高，并且剔除了精液中的非特異性蛋白、脂肪和糖類化合物，從藥效上提高抗腫瘤活性，并且降低了服用劑量，更方便臨床應用。
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可制成可制成膠囊、顆粒、片劑、滴丸、口服液、注射液等各種制劑應用于臨床，優選為膠囊。本品也可與其他藥物制成中西藥復方制劑應用。
具體實施例方式頂體蛋白是卵子與精子受精過程中所不可缺少的生物活性物質。其化學成分為絲氨酸蛋白溶解類物質，可溶解卵膜。當卵子和精子都成功地被輸送到受精部位時，精子的頭部一旦接觸到卵子表面時，位于其頭部頂端的細胞器之一的頂體就隨之發生頂體反應，由頂體部分伸長為頂體絲，并分泌出多種酶蛋白，即頂體蛋白，頂體蛋白溶解卵膜，使精子頭部穿透卵的放射冠和透明帶，而進入卵子，完成受精過程。因此，頂體蛋白活性臨床上常成為精液分析評價精子功能的定量指標。頂體蛋白可通過對冷凍保存的精子使用去垢劑，聲處理和低PH等方法提取，并用凝膠過濾，離子交換層析，等電聚集，親和層析和電泳等生化技術，可獲得純頂體蛋白。但不同哺乳動物和采用的不同分離方法所得到的頂體蛋白分子量差異較大，如人頂體素為 30KD 70KD，而豬的約為41KD 56KD。頂體素分子是由酶原區、催化區、尾區三部分組成，其中酶原區、催化區氨基酸序列無種屬差異，尾區有種屬差異。經藥效學實驗證實，頂體蛋白對MCF-7、Bel7402、BGC823、A2780、A549及HCT-8六種人癌細胞株有抑制作用，對小鼠S180腫瘤抑制作用明顯，與動物精液凍干粉相比，抑瘤作用明顯，同時藥用劑量也顯著降低。同時本品與化療藥物聯用能明顯增加對化療藥物治療腫瘤的治療作用，提示本品有應用于治療腫瘤的廣泛前景。人體臨床應用情況表明，本品治療癌癥有實質性的臨床應用效果；將動物精液提純得到頂體蛋白屬于重大創新和發明， 有利于降低患者服藥劑量，為上述疾病的治療提供了一種新的藥用物質。頂體蛋白可制成膠囊、顆粒、片劑、滴丸、口服液、注射液等各種制劑應用于臨床， 優選為膠囊，頂體蛋白具有較好的穩定性，優選的膠囊在遮光、密封條件下可保存M個月， 可穩定有效的應用于臨床。本品也可與其他藥物制成中西藥復方制劑應用。以下結合實施例進一步說明本發明，而非限制本發明實施例1 向Ikg動物精液中加入4L的2%醋酸溶液，用lmol/L的鹽酸調節pH為3，以 5000r/min轉速離心20min，棄去沉淀物，上清液合并，濃縮；上清液加硫酸銨至飽和度為0. 3，于4 °C放置4小時，以3000r/min轉速離心 20min，棄去上清液。沉淀用0. lmol/L (pH 2)的醋酸溶液溶解即得頂體蛋白粗提物柱層析將粗提物用kphadex G-25凝膠柱進行柱層析，以0. lmol/L (pH2)的醋酸緩沖溶液平衡洗脫，流速為0. 5ml/min。用紫外分光光度法檢測，收集按Lowry法在680nm 處有最大吸收的洗脫液；將洗脫液以3000r/min離心lOmin，棄去上清液，所得沉淀用純蒸餾水洗滌后繼續離心，收集沉淀，即得到頂體蛋白，收率為0. 133%，用ELISA定量檢測法測定頂體蛋白含量，含量92%。實施例2:將50g動物精液凍干粉用500ml蒸餾水溶化，加入3L的3%醋酸溶液，用lmol/L的鹽酸調節PH為4，以6000r/min轉速離心15min，棄去沉淀物，上清液合并，濃縮；上清液加硫酸銨至飽和度為0.4，于4°C放置4小時，以3500r/min轉速離心 15min，棄去上清液，沉淀用0. lmol/L(pH2. 5)的醋酸緩沖溶液溶解即得頂體蛋白粗提物；柱層析將粗提物用kphadex LH-20凝膠柱進行柱層析，以0. lmol/L(pH2)的醋酸緩沖溶液平衡洗脫，流速為0. 5ml/min ；用紫外分光光度法檢測，收集按Lowry法在680nm 處有最大吸收的洗脫液；將洗脫液以3000r/min離心lOmin，棄去上清液，所得沉淀用純蒸餾水洗滌后繼續離心，收集沉淀，即得到頂體蛋白，收率為2. 8 %，用ELISA定量檢測法測定頂體蛋白含量， 含量大于93. 7%。頂體蛋白的藥效學實驗如下MTT 試驗用胰酶消化 MCF-7、Bel7402、BGC823、A2780、A549 及 HCT-8 六種人癌細胞株(中國科學院上海細胞所)，以含10%小牛血清的RPMI1640培養液配制細胞懸液，濃度為104/ml，于96孔培養板內每孔接種100 μ 1(1000個細胞/孔)。用培養基稀釋藥物，設 6個濃度:10、20、40、80、160、320μ g/ml，每組設三個平行孔，每孔加樣0. lml。置37°C、5% CO2孵箱中培養96小時后棄去培養液，每孔加入0. Iml 0. 5% MTT溶液(RPMI1640配制)。 37°C保溫4小時，棄上清，每孔加入DMSO 0. Iml溶解i^rmazan顆粒，振蕩混勻，用酶標儀檢測(參比波長450nm、檢測波長570nm)，計算藥物對細胞生長的抑制率。表1. MTT法觀察頂體蛋白對人癌細胞株的生長抑制作用結果
頂體蛋白_抑制率(％)_
劑量
MCF-7 Bel7402 BGC823 A2780 A549 HCT-8 (“g/ml)_
400 60.3±2.79 57.7±5.61 62.0±12.69 76.8±11.19 16.2±7.31 40.4±20.5結果表明，在本實驗條件下，320 μ g/ml頂體蛋白對MCF-7、Bel7402、BGC823、 A2780有較強的抑制作用，對A549及HCT-8有一定的抑制作用。這為該藥應用于腫瘤的治療提供了臨床前研究基礎。S180移植性腫瘤抑制實驗選用昆明種小鼠，18 22g，雌，50只，分為空白對照組，動物精液凍干粉組、 2. 5mg · kg-\5mg · kg—1、IOmg · kg-1低中高劑量組，每組10只。將全身狀況良好的荷瘤動物處死，無菌條件下取出腹水，以生理鹽水稀釋，于每鼠腋窩下接種0. 2ml瘤液(S180細胞
1. 0 X IO7個/ml)。接種后M小時，將動物按體重隨機分組。動物精液凍干粉-kg"1劑量組、頂體蛋白2. 5mg ^kg-1Amg ^kg-1UOmg · kg—1低中高劑量組每天灌胃給藥一次，連續給藥10天，末次給藥后M小時，頸椎脫白處死動物，分別稱體重及瘤重，計算腫瘤抑制率，進行療效評價。并將各組結果進行統計學處理。表2.頂體蛋白對小鼠肉瘤S180的生長抑制作用
權利要求
1.頂體蛋白用于抑制癌細胞的擴散。
2.頂體蛋白用于抑制]\ ^-7、8617402、860823、42780、4549或!101-8細胞的擴散。
3.頂體蛋白在制備治療癌癥的藥物中的應用。
4.頂體蛋白在制備治療抑郁癥的藥物中的應用。
5.根據權利要求3所述的頂體蛋白，其特征在于所述癌癥包括婦科腫瘤、消化道腫瘤、肺癌、肝癌、白血病和惡性淋巴瘤。
6.根據權利要求5所述的頂體蛋白，其特征在于所述婦科腫瘤包括子宮肌瘤、卵巢癌、乳房瘤、乳腺癌和宮頸癌；所述消化道腫瘤包括食道癌、胃癌、大腸癌。
7.根據權利要求3至6任一所述的頂體蛋白，其特征在于所述頂體蛋白用于制備膠囊、顆粒、片劑、滴丸、中西藥復方制劑、口服液或注射液。
8.一種頂體蛋白的制備方法，其特殊之處在于，包括以下步驟1]取動物精液或復溶的動物精液凍干粉，向其中加入濃度為 5%的稀酸溶液，再加入無機酸將PH調節至2 5，以2000r/min 8000r/min的轉速離心15 30min后棄去沉淀物，將得到的上清液合并，濃縮；選取動物精液時，動物精液與稀酸的質量比為1 1 1 20;選取動物精液凍干粉時，動物精液凍干粉與復溶溶劑水的質量比為1 1 1 20，動物精液凍干粉復溶溶液與稀酸的比例為質量比為1 1 1 16;2]向步驟1處理所得的上清液中加入無機銨鹽，調節飽和度至0.2-0. 5后放置3-5小時，再以2000r/min 8000r/min離心15 30min，棄去上清液，沉淀用醋酸緩沖溶液溶解后，得到頂體蛋白粗提物；3]將經步驟3處理所得的蛋白粗提物進行柱層析，用醋酸緩沖溶液平衡洗脫，處理完成后收集洗脫液；4]將洗脫液以2000r/min 8000r/min離心5 lOmin，棄去上清液，所得沉淀洗滌后以2000r/min 8000r/min繼續離心1 3次，每次離心5 lOmin，收集沉淀，即得到頂體蛋白。
9.根據權利要求8所述的頂體蛋白的制備方法，其特征在于所述步驟1中，稀酸溶液是濃度為1. 7% 4. 5%的醋酸溶液、甲酸溶液、丙酸溶液、丁酸溶液、鹽酸溶液、硫酸溶液或磷酸溶液，調節PH的無機酸為lmol/L的硫酸、鹽酸、氫溴酸或磷酸，調節pH至2. 8 4. 6;動物精液與稀酸的質量比為1 4;選取動物精液凍干粉時，動物精液凍干粉與復溶溶劑水的質量比為1 10，動物精液凍干粉復溶溶液與稀酸的比例為質量比為1 5. 5;所述步驟2中無機銨鹽是硫酸銨、硫酸氫銨、碳酸銨、碳酸氫銨或磷酸銨，調節飽和度至0. 3后在 4°C環境中放置3-5小時；所述醋酸緩沖溶液是pH = 2,0. lmol/L的醋酸緩沖溶液；所述步驟3中，是用葡聚糖凝膠柱、羥丙基葡聚糖凝膠柱、丙烯酰胺凝膠柱或瓊脂糖凝膠柱進行柱層析，所述醋酸緩沖溶液是PH = 2，0. lmol/L的醋酸緩沖溶液，醋酸緩沖溶液平衡洗脫的流速為0. 5ml/min,處理完成后收集在680nm處有最大吸收的洗脫液；所述步驟4中，洗滌沉淀使用純蒸餾水；所述步驟1至4中的離心轉速為2500r/min 6000r/min。
10.根據權利要求9所述的頂體蛋白，其特征在于所述動物精液凍干粉為健康驢、牛、 羊或馬的精液凍干粉。
全文摘要
本發明提供的頂體蛋白的用途及提取方法，主要解決了現有應用動物精液制備治療腫瘤、抑郁癥等多種疾病中的藥物純度低、需服用的劑量大及精液中的非特異性蛋白、脂肪和糖類化合物等雜質對治療效果的干擾的問題；本發明提供的頂體蛋白的用途及提取方法，極大地提高了藥物的純度和藥效，突破了現有技術的局限性。獲取了頂體蛋白在治療子宮肌瘤、乳房瘤、胃癌、肺癌、肝癌、白血病、大腸癌、卵巢癌、乳腺癌、宮頸癌、惡性淋巴瘤及治療抑郁癥等疾病的藥物中的應用；極大地提高了該類藥物的純度，并降低了患者的服用劑量和動物精液凍干粉中含有的其他物質可能造成的影響。
文檔編號A61K38/46GK102225197SQ20111015773
公開日2011年10月26日 申請日期2011年6月13日 優先權日2011年6月13日
發明者李偃, 程輝 申請人:陜西精健新星生物醫藥有限公司