專利名稱：一種提取棉花的線粒體dna的方法
技術領域：
本發明涉及一種提取棉花的線粒體DNA的方法。
背景技術：
線粒體(mitochondria)是高等生物的最重要的細胞器，是細胞質遺傳系統之一。 線粒體基因組DNA(mtDNA)相對獨立細胞核外，能夠自我復制，控制著眾多的遺傳性狀。其 構型主要有開環、閉環、超螺旋、線狀和多聚體。與高等動物比，高等植物的線粒體基因組大 而復雜。植物胞質雄性不育性是自然界較普遍存在的現象，研究植物胞質雄性不育是遺傳 學理論研究的一個重要課題。大量的遺傳學、分子生物學等領域研究表明，引起植物胞質雄 性不育的基因主要分布在線粒體的基因組中，即線粒體基因組直接影響植物胞質雄性不育 的育性。1976年，Levings和Pring在《Science》上發表了 mtDNA與植物胞質雄性不育性 (cytoplasmic male sterility, CMS)的研究結果，認為mtDNA和CMS有著密切的關系，這一 提出引起了研究者們對mtDNA研究的廣泛興趣，因此植物mtDNA的研究稱為近代植物分子 生物學研究的熱點之一。對植物線粒體基因組結構的進行深入的分子水平研究是揭示CMS 這一自然現象的重要途徑。要想進行mtDNA結構和功能的分子水平研究，首先必須從植物 材料中提取高純度的mtDNA，因此提取高質量的mtDNA是進行研究工作的基礎。目前，已用于高等植物mtDNA提取的方法有Leving的CTAB、Dolferus的CsCl/ EB密度梯度離心法、差速離心法等，這些mtDNA提取的方法已經廣泛使用。但是，這些方法 操作過程比較復雜、成本高且提取的mtDNA純度不高，影響后續實驗。在不同的植物mtDNA 的提取過程中，各種影響因素也異常復雜，難以把握，而且在基因工程后續試驗中對提取 mtDNA的質量、純度、完整性的要求也越來越高。由于棉花含有較多酚類和多糖類物質，在分 離和純化mtDNA過程中容易氧化，給純化mtDNA造成一定的困難。

發明內容
本發明的目的是提供一種提取棉花的線粒體DNA的方法。本發明提供的提取棉花的線粒體DNA的方法，包括線粒體的提取和線粒體DNA的 提取兩個步驟；所述線粒體的提取包括如下步驟(1)至步驟(3)(1)將棉花樣品在緩沖液A中進行勻漿，離心收集沉淀；所述緩沖液A的制備方 法如下將 0.05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、6_10g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、 2-5mmol β -疏基乙醇和0. 1-0. 8g BSA用水定容至1升，調pH值至7. 5-8. 5 ；(2)向步驟(1)的沉淀加入緩沖液B和DNase I，以去除核DNA，然后加入EDTA水 溶液(或EDTA-Na2水溶液)，離心得到沉淀；所述緩沖液B的制備方法如下將0. 05mol Tris-HCl,0. 1-0. 5mol 蔗糖、0. 01-0. 05mol MgCl2 和 l_5g 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容 至1升，調pH值至7. 5-8.5 ；
(3)向步驟( 的沉淀加入緩沖液C和緩沖液D，離心得到線粒體；所述緩沖液C的 制備方法如下將0. 05mol Tris-HCl.O. 02mol EDTA-Na2和0. 1-0. 5mol蔗糖用水定容至1 升，調PH值至7. 5 ；所述緩沖液D的制備方法如下將0. 05molTris-HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和0. 2-1. Omol蔗糖用水定容至1升，調pH值至7. 5-8. 5 ；所述線粒體DNA的提取包括如下步驟(4)至步驟(8)(4)向步驟(3)的線粒體加入裂解液進行裂解，然后加入乙酸鹽水溶液，離心收集 上清液，用等體積的溶液甲進行抽提，離心得到沉淀；所述溶液甲由氯仿和異戊醇組成，氯 仿和異戊醇的體積比為M 1 ；(5)向步驟的沉淀加入乙酸鹽水溶液，再加入無水乙醇，離心得到沉淀，用 70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀；(6)用TE溶液或T50E10溶液溶解步驟(5)的沉淀；(7)然后加入RNaes，以去除RNA;然后加入蛋白酶K，以去除蛋白；然后用等體積 的溶液乙進行抽提，離心收集上清液；所述溶液乙由Tris飽和酚、氯仿和異戊醇組成，Tris 飽和酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 24 1 ；(8)向步驟(7)的上清液加入乙酸鹽水溶液，再加入無水乙醇，離心得到沉淀；用 70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，得到棉花的線粒體DNA。步驟中，所述乙酸鹽可為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。步驟(5)中，所述乙酸鹽可為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。步驟(8)中，所述乙酸鹽可為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。步驟中所述裂解液可為CTAB裂解液；所述裂解液優選為如下方法制備得到 的溶液將 O.Olmol Tris-HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g 聚乙烯吡咯燒酮(PVP)禾口 1. 4mol NaCl用水定容至1升。步驟(6)中，所述TE溶液具體可為如下方法制備得到的溶液將1毫升lmol/ LpH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升0. 5mol/L pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫 升蒸餾水中。步驟(6)中，所述T50E10溶液具體可為如下方法制備得到的溶液將5毫升、 lmol/L、pH8. 0 的 Tris-Cl 水溶液和 2 毫升、0. 5mol/L、pH 8. 0 的 EDTA-Na2 水溶液加入到 93 毫升蒸餾水中。所述方法中，所述棉花樣品、所述緩沖液A、所述緩沖液B、所述DNase I、步驟⑵ 的所述EDTA水溶液(或EDTA-Na2水溶液)、所述緩沖液C、所述緩沖液D、所述裂解液、步 驟(4)的所述乙酸鹽水溶液、步驟(5)的所述乙酸鹽水溶液、所述TE溶液、所述RNase、所 述蛋白酶K和步驟(8)的所述乙酸鹽水溶液的配比可為30-100g棉花樣品200-800毫升 緩沖液 A 5-40 毫升緩沖液 B :10-40UDNase I :100-400 μ L 0. 5mol/L ρΗ7· 5-8. 5 的 EDTA 水溶液(或EDTA-Na2水溶液):5_40毫升緩沖液C 5-40毫升緩沖液D 1-10毫升裂解液 200-450微升2mol/L乙酸鹽水溶液400-900微升lmol/L乙酸鹽水溶液100-600微升TE 溶液l-10URNaes =I-IOU蛋白酶K 20-60微升2_5mol/L乙酸鹽水溶液。步驟⑵具體可為向步驟⑴的沉淀加入所述緩沖液B和DNase I后，4°C 反應30-60分鐘，然后加入所述EDTA水溶液。步驟O)中，所述離心的參數具體可為 10000-17000g、5-40 分鐘。步驟(3)中，所述離心的參數具體可為10000-17000g、5-20分鐘。
步驟(4)具體可為所述向步驟(3)的線粒體加入所述裂解液，65°C裂解15-60分 鐘，然后加入所述乙酸鹽水溶液。步驟(7)具體可為在步驟(6)的溶液中加入所述RNaes，37°C水浴30_60分鐘； 然后加入所述蛋白酶K，37°C水浴30-60分鐘。所述棉花樣品具體可為棉花黃化苗。所述棉花的品種具體可為徐棉M4。本發明提供了分離棉花線粒體DNA的方法，是分子生物學的基本步驟之一，屬于 植物基因工程技術領域。本發明針對目前提取線粒體DNA過程中存在的不足，有針對性的 在傳統的CTAB方法上進行改進，調整離心的時間、適當增加離心次數、更改試劑、增加抽提 洗滌次數等，優化其提取條件。本發明在提取過程中確保對線粒體機械損傷程度最小的基 礎上，有效的除去線粒體以外的核DNA以及酚類、多糖類物質，降低污染率，提高線粒體DNA 的純度和質量，可以滿足棉花線粒體基因工程后續實驗。


圖1為實施例1提取的線粒體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；1-4為提取得到的線粒 體 DNA。圖2為實施例2提取的線粒體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；1_4為提取得到的線粒 體 DNA。圖3為實施例3提取的線粒體DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖；1_4為提取得到的線粒 體 DNA。圖4為實施例1至3提取的線粒體DNA酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；1 D15000plus DNA ladder ；2、3 實施例1提取得到的線粒體DNA的酶切產物；4、5 實施例2 提取得到的線粒體DNA的酶切產物；6、7 實施例3提取得到的線粒體DNA的酶切產物。圖5為CTAB法提取的線粒體DNA酶切產物的瓊脂糖凝膠電泳圖；1_5 =CTAB法提 取的線粒體DNA的酶切產物；6 :D2000DNA ladder。
具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。徐棉又名蘇棉20號)購自江蘇徐農種業科技有限公司；由徐州市農業科學 院培育，2002年通過江蘇省農作物品種審定委員會審定，編號為蘇審棉200202。實施例1、棉花線粒體DNA的提取一、溶液配制緩沖液A 的制備方法如下將 0. 05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、8g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、4mmol β -疏基乙醇和0. 5g牛血清蛋白(BSA)用水定容至1升，調pH 值至8.0。緩沖液B 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 3mol 蔗糖、0. 03mol MgCl2 和 3g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容至1升，調pH值至8.0。
緩沖液C 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 3mol 蔗 糖用水定容至1升，調PH值至7. 5.緩沖液D 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 6mol 蔗 糖用水定容至1升，調PH值至8. 0。裂解液的制備方法如下將0. Olmol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和1. 4mol NaCl用水定容至1升。TE溶液的制備方法如下將1毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升、 0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升蒸餾水中。T50E10溶液的制備方法如下將5毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫 升、0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到93毫升蒸餾水中。溶液甲的制備方法如下由氯仿和異戊醇組成，氯仿和異戊醇的體積比為M 1。溶液乙的制備方法如下Tris飽和酚、氯仿和異戊醇組成，Tris飽和酚、氯仿和異 戊醇的體積比為25 24 1。二、線粒體DNA的提取(1)將50g徐棉244黃化苗與400毫升緩沖液A混勻進行勻漿，離心收集沉淀。(2)向步驟(1)的沉淀依次加入20毫升緩沖液B和20U DNase I 4°C反應30min， 然后加入200微升、0. 5mol/L、pH7. 5的EDTA-Na2水溶液，IOOOOXg離心5min得到沉淀。(3)向步驟O)的沉淀加入20毫升緩沖液C，然后用注射器向底部輕輕注入20毫 升緩沖液D，冰浴30min，IOOOOXg離心5min得純凈完整的線粒體。(4)向步驟(3)的線粒體加入5毫升裂解液65°C裂解15min (裂解完全)，然后加 入300微升、2mol/L的乙酸鉀水溶液冰浴30min，離心收集上清液，用等體積的溶液甲進行 抽提，離心得到沉淀。(5)向步驟(4)的沉淀加入450微升、lmol/L的乙酸鈉水溶液，再加入無水乙醇， 離心得到線粒體沉淀物，通過70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌線粒體沉淀物。(6)干燥步驟(5)的線粒體沉淀物，加入400微升T50E10溶液過夜充分溶解。(7)在步驟(6)的溶解液中加入5U RNaSe，37°C水浴中30min ；然后加入5U蛋白 酶K，37°C水浴中30min，之后，用等體積的溶液乙進行抽提，離心收集上清液。(8)在步驟(7)的上清液中加入40微升、3mol/L的乙酸鈉水溶液和二倍體積的無 水乙醇，離心收集沉淀；用70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，得到線粒體DNA。 干燥沉淀，加入TE充分溶解。將線粒體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖1。實施例2、棉花線粒體DNA的提取一、溶液配制緩沖液A 的制備方法如下將 0. 05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、6g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)、2謹Ol β-疏基乙醇禾口 0. Ig BSA用水定容至1升，調pH值至7.5。緩沖液B 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. Imol 蔗糖、0. Olmol MgCl2 和 Ig聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容至1升，調PH值至7. 5。緩沖液C 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. Imol 蔗 糖用水定容至1升，調PH值至7. 5.
緩沖液D 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 2mol 蔗 糖用水定容至1升，調PH值至7. 5。裂解液的制備方法如下將0. Olmol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和1. 4mol NaCl用水定容至1升。TE溶液的制備方法如下將1毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升、 0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升蒸餾水中。T50E10溶液的制備方法如下將5毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫 升、0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到93毫升蒸餾水中。溶液甲的制備方法如下由氯仿和異戊醇組成，氯仿和異戊醇的體積比為M 1。溶液乙的制備方法如下Tris飽和酚、氯仿和異戊醇組成，Tris飽和酚、氯仿和異 戊醇的體積比為25 24 1。二、線粒體DNA的提取(1)將30g徐棉244黃化苗與200毫升緩沖液A混勻進行勻漿，離心收集沉淀。(2)向步驟(1)的沉淀依次加入5毫升緩沖液B和IOU DNase I 4°C反應45min， 然后加入100微升、0. 5mol/L、pH8. 0的EDTA水溶液，15000Xg離心20min得到沉淀。(3)向步驟( 的沉淀依次加入5毫升緩沖液C和5毫升緩沖液D，15000Xg離心 IOmin得純凈完整的線粒體。(4)向步驟(3)的線粒體加入1毫升裂解液65°C裂解40min (裂解完全)，然后加 入200微升、2mol/L的乙酸胺水溶液，離心收集上清液，用等體積的溶液甲進行抽提，離心 得到沉淀。(5)向步驟的沉淀加入400微升、lmol/L的乙酸鈉水溶液，再加入無水乙醇， 離心得到線粒體沉淀物，通過70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌線粒體沉淀物。(6)干燥步驟(5)的線粒體沉淀物，加入100微升T50E10溶液過夜充分溶解。(7)在步驟(6)的溶解液中加入IU RNaSe，37°C水浴中45min ；然后加入IU蛋白 酶K，37°C水浴中45min，之后，用等體積的溶液乙進行抽提，離心收集上清液。(8)在步驟(7)的上清液中加入20微升、2mol/L的乙酸鈉水溶液和無水乙醇，離 心收集沉淀；用70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，得到線粒體DNA。干燥沉淀， 加入TE充分溶解。將線粒體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖2。實施例3、棉花線粒體DNA的提取一、溶液配制緩沖液A 的制備方法如下將 0. 05mol Tris-HCl、1. 2mol NaCl、2mmol EDTAUOg 聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、5mmoli3-疏基乙醇和0. 8g BSA用水定容至1升，調pH值至8. 5。緩沖液B 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 5mol 蔗糖、0. 05mol MgCl2 和 5g聚乙烯吡咯烷酮(PVP)用水定容至1升，調pH值至8.5。緩沖液C 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 0. 5mol 蔗 糖用水定容至1升，調PH值至7. 5.緩沖液D 的制備方法如下將 0. 05mol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2 和 1. Omol 蔗 糖用水定容至1升，調PH值至8. 5。
裂解液的制備方法如下將0. Olmol Tris_HCl、0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚 乙烯吡咯烷酮(PVP)和1. 4mol NaCl用水定容至1升。TE溶液的制備方法如下將1毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升、 0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升蒸餾水中。T50E10溶液的制備方法如下將5毫升、lmol/L、pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫 升、0. 5mol/L、pH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到93毫升蒸餾水中。溶液甲的制備方法如下由氯仿和異戊醇組成，氯仿和異戊醇的體積比為M 1。溶液乙的制備方法如下Tris飽和酚、氯仿和異戊醇組成，Tris飽和酚、氯仿和異 戊醇的體積比為25 24 1。二、線粒體DNA的提取(1)將IOOg徐棉244黃化苗與800毫升緩沖液A混勻進行勻漿，離心收集沉淀。(2)向步驟(1)的沉淀依次加入40毫升緩沖液B和40U DNase I 4°C反應60min， 然后加入400微升、0. 5mol/L、pH8. 5的EDTA水溶液，17000Xg離心40min得到沉淀。(3)向步驟( 的沉淀依次加入40毫升緩沖液C和40毫升緩沖液D，17000Xg離 心20min得純凈完整的線粒體。(4)向步驟(3)的線粒體加入10毫升裂解液65°C裂解60min (裂解完全)，然后加 入450微升、2mol/L的乙酸鈉水溶液，離心收集上清液，用等體積的溶液甲進行抽提，離心 得到沉淀。(5)向步驟(4)的沉淀加入900微升、lmol/L的乙酸胺水溶液，再加入無水乙醇， 離心得到線粒體沉淀物，通過70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌線粒體沉淀物。(6)干燥步驟(5)的線粒體沉淀物，加入600微升TE溶液過夜充分溶解。(7)在步驟(6)的溶解液中加入IOU RNase，37°C水浴中60min ；然后加入IOU蛋 白酶K，37°C水浴中60min，之后，用等體積的溶液乙進行抽提，離心收集上清液。(8)在步驟(7)的上清液中加入60微升、5mol/L的乙酸鈉水溶液和無水乙醇，離 心收集沉淀；用70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，得到線粒體DNA。干燥沉淀， 加入TE充分溶解。將線粒體DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，見圖3。實施例4、提取效果驗證分別將實施例1至實施例3中提取的線粒體DNA用Not I酶切12小時，然后進行 瓊脂糖凝膠電泳，以驗證提取效果。見圖4。采用CTAB法提取棉花黃化苗的線粒體DNA，用Not I酶切12小時，然后進行瓊脂 糖凝膠電泳，見圖5。結果表明常規CTAB提取線粒體DNA，雜質較多，一般內切酶切不開，而且彌散較 嚴重；而本發明提供的方法，提取的DNA較純凈，質量較高，能滿足繼續的相關分子試驗。
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權利要求
1.一種提取棉花的線粒體DNA的方法，包括線粒體的提取和線粒體DNA的提取兩個步驟；所述線粒體的提取包括如下步驟(1)至步驟(3)(1)將棉花樣品在緩沖液A中進行勻漿，離心收集沉淀；所述緩沖液A的制備方法如 下將0. 05mol Tris-HClU. 2mol NaCl、2mmol EDTA、6_10g聚乙烯吡咯烷酮、2_5_ο1 β-疏 基乙醇和0. 1-0. 8g BSA用水定容至1升，調pH值至7. 5-8. 5 ；(2)向步驟(1)的沉淀加入緩沖液B和DNaseI，以去除核DNA，然后加入EDTA水溶液 或EDTA-Na2水溶液，離心得到沉淀；所述緩沖液B的制備方法如下將0. 05mol Tris-HCl、 0. 1-0. 5mol蔗糖、0· 01-0. 05mol MgCl2和l_5g聚乙烯吡咯烷酮用水定容至1升，調pH值 至 7. 5-8. 5 ；(3)向步驟O)的沉淀加入緩沖液C和緩沖液D，離心得到線粒體；所述緩沖液C的制 備方法如下將0. 05mol Tris-HCl.O. 02mol EDTA-Nei2和0. 1-0. 5mol蔗糖用水定容至1升， 調PH值至7. 5 ；所述緩沖液D的制備方法如下將0. 05mol Tris-HCl、0· 02mol EDTA-Na2 ^P 0. 2-1. Omol蔗糖用水定容至1升，調pH值至7. 5-8. 5 ；所述線粒體DNA的提取包括如下步驟(4)至步驟(8)(4)向步驟(3)的線粒體加入裂解液進行裂解，然后加入乙酸鹽水溶液，離心收集上清 液，用等體積的溶液甲進行抽提，離心得到沉淀；所述溶液甲由氯仿和異戊醇組成，氯仿和 異戊醇的體積比為M 1 ；(5)向步驟的沉淀加入乙酸鹽水溶液，再加入無水乙醇，離心得到沉淀，用70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀；(6)用TE溶液或T50E10溶液溶解步驟(5)的沉淀；(7)然后加入RNaes，以去除RNA;然后加入蛋白酶K，以去除蛋白；然后用等體積的溶 液乙進行抽提，離心收集上清液；所述溶液乙由Tris飽和酚、氯仿和異戊醇組成，Tris飽和 酚、氯仿和異戊醇的體積比為25 24 1 ；(8)向步驟(7)的上清液加入乙酸鹽水溶液，再加入無水乙醇，離心得到沉淀；用70% (體積百分含量)乙醇水溶液洗滌沉淀，得到棉花的線粒體DNA。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述乙酸鹽為乙酸鉀、乙酸胺 和乙酸鈉中的至少一種；步驟(5)中，所述乙酸鹽為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一 種；步驟(8)中，所述乙酸鹽為乙酸鉀、乙酸胺和乙酸鈉中的至少一種。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述裂解液為CTAB裂解液；步驟中，所述裂解液優選為如下方法制備得到的溶液將0. Olmol Tris-HCl, 0. 02mol EDTA-Na2,2g CTAB、2g聚乙烯吡咯烷酮和1. 4mol NaCl用水定容至1升。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于步驟(6)中，所述TE溶液為如 下方法制備得到的溶液將1毫升lmol/L pH8. 0的Tris-Cl水溶液和200微升0. 5mol/L PH 8. 0的EDTA-Na2水溶液加入到98. 8毫升水中；步驟(6)中，所述T50E10溶液的制備方 法如下將5毫升lmol/L pH8. 0的Tris-Cl水溶液和2毫升0. 5mol/L pH 8. 0的EDTA-Na2 水溶液加入到93毫升水中。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，所述棉花樣品、所述緩沖液A、所述緩沖液B、所述DNase I、步驟O)的所述EDTA水溶液或EDTA-Nii2水溶 液、所述緩沖液C、所述緩沖液D、所述裂解液、步驟(4)的所述乙酸鹽水溶液、步驟(5)的 所述乙酸鹽水溶液、所述TE溶液、所述RNase、所述蛋白酶K和步驟(8)的所述乙酸鹽水溶 液的配比為30-100g棉花樣品200-800毫升緩沖液A 5_40毫升緩沖液B 10-40U DNase I 100-400 μ L 0. 5mol/L ρΗ7· 5_8· 5 的 EDTA 水溶液或 EDTA-Nei2 水溶液5-40 毫 升緩沖液C 5-40毫升緩沖液D 1-10毫升裂解液200-450微升2mol/L乙酸鹽水溶 液400-900 微升 lmol/L 乙酸鹽水溶液100-600 微升 TE 溶液1-10U RNaes 1-10U 蛋白酶K 20-60微升2-5mol/L乙酸鹽水溶液。
6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于步驟O)中，向步驟(1)的沉淀 加入所述緩沖液B和DNase I后，4°C反應30-60分鐘，然后加入所述EDTA水溶液；步驟⑵ 中，所述離心的參數為10000-17000g、5-40分鐘。
7.如權利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于步驟(3)中，所述離心的參數為 10000-17000g、5-20 分鐘。
8.如權利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于步驟(4)中，所述向步驟(3)的 線粒體加入所述裂解液，65°C裂解15-60分鐘，然后加入所述乙酸鹽水溶液。
9.如權利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于步驟(7)中，在步驟(6)的溶液 中加入所述RNaes，37°C水浴30-60分鐘；然后加入所述蛋白酶K，37°C水浴30-60分鐘。
10.如權利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于所述棉花樣品為棉花黃化苗； 所述棉花的品種為徐棉對4。
全文摘要
本發明公開了一種提取棉花的線粒體DNA的方法。本發明的方法包括如下步驟(1)棉花勻漿，離心收集沉淀；(2)去除核DNA，加EDTA溶液，離心得沉淀；(3)加緩沖液，離心得線粒體；(4)加裂解液，再加乙酸鹽溶液，離心收集上清，用氯仿-異戊醇抽提；(5)加乙酸鹽溶液，再加無水乙醇，離心得沉淀，用乙醇洗滌；(6)用TE溶解；(7)去除RNA和蛋白，用Tris飽和酚-氯仿-異戊醇抽提，離心收集上清；(8)加乙酸鹽溶液，再加乙醇，離心得沉淀；用乙醇洗滌，得線粒體DNA。本發明針對目前提取線粒體DNA中存在的不足，改進傳統的CTAB法，調整離心的時間和次數、更改試劑、增加抽提洗滌次數等，優化提取條件。本發明確保對線粒體機械損傷程度最小的基礎上，有效的除去線粒體以外的核DNA以及酚類、多糖類物質，降低污染率，提高線粒體DNA的純度和質量，可以滿足棉花線粒體基因工程后續實驗。
文檔編號C07H1/08GK102121000SQ20101003394
公開日2011年7月13日 申請日期2010年1月7日 優先權日2010年1月7日
發明者華金平, 張曦, 李雙雙, 熊敏, 王玉美, 蘇愛國, 薛龍飛 申請人:中國農業大學