專利名稱：組織性質診斷用試劑盒的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種試劑盒，特別是用于測定從患者身上采集的組織中的周期素依賴性激酶的表達量和活性值，根據取得的表達量和活性值診斷組織性質的試劑盒。
背景技術：
作為主管生物細胞增殖的細胞周期調節因子，有正調節因子--周期素依賴性激酶(以下簡稱CDK)。CDK一旦被磷酸化等激活，就會和周期素結合，形成CDK與周期素的復合物(以下有時簡稱為活化CDK)。CDK因此被激活，這樣，CDK在相應的細胞周期的特定階段顯示活性。眾所周知，負調節因子--周期素依賴性激酶抑制劑(以下簡稱CDK抑制劑)會結合到CDK和/或CDK·周期素的復合物中阻礙CDK的活性。
細胞周期調節因子的表達量和活性值的數據可以作為判斷有關細胞周期控制的諸如疾患種類和惡性程度等從患者身上采集的組織性質的良好指標。比如大家都知道CDK一般在細胞內也能表現出一定量，但在被增殖因子誘導增殖的細胞中其表達量更高。然而，如上所述，激活CDK是CDK、周期素與CDK抑制劑密切相關的非常復雜的過程。因此，無論單憑CDK、周期素和CDK抑制劑的表達量的數據，還是僅憑CDK的活性值的數據作為判斷組織性質的指標都是不充分的。
在此，表達量是指用組織配制的組織液測得的目標蛋白質量(對應于分子個數的單位)。表達量用周知的從蛋白質混合物測定目標蛋白質量的方法也可以測定。比如表達量用ELISA法、蛋白質轉移吸印技術westernblot法以及日本專利申請公告第號上公開的方法等都可測定。目標蛋白質可以用特異抗體捕捉到。比如捕捉CDK1時，使用抗CDK1抗體可以捕捉到上述組織溶液中的全部CDK1(含CDK1單體、CDK1和周期素及/或CDK抑制劑的復合物、CDK1和其他化合物的復合物)。
所謂CDK活性值是指CDK與特定的周期素結合后有多少基質磷酸化這一激酶活性水平，其單位用U(單元)表示。例如通過檢測活化CDK1或活化CDK2使多少組朊H1磷酸化，即可以測定CDK1或CDK2的活性值。通過檢測活化CDK4或活化CDK6使多少成視網膜細胞瘤蛋白(Rb；Retinoblastoma protein)磷酸化即可以測定CDK4或CDK6的活性值。CDK活性值可以用眾所周知的以放射性物質為標記的酶活性測定法來測定。具體來說，使用32P標記腺甙5’-O-(3-磷酸三甲酚酯)(γ-〔32P〕-ATP)的測定法。用此方法，在CDK的作用下，來自于32P標記ATP的一元磷酸基進入該基質。通過用放射自顯影術或閃爍計數管檢測該基質中的32P即可測定磷酸化后的該基質的量，從該基質的量來計算出CDK的活性。另外，在美國專利申請公告第號當中公開了不以放射性物質為標記的CDK活性值測定法。根據此方法，讓腺甙5’-O-(3-硫代磷酸三甲酚酯)(ATP-γS)與基質反應，并讓標記物質與加入基質中的含有一元硫代磷酸基的硫磺原子結合，測定標記量。例如用標記熒光物質作為標記物時，測定熒光量作為標記量。
現在，診斷從患者身上采集的組織的性質在臨床上擔負著診斷癌癥惡性度的重要任務。在此，所謂癌癥惡性度包括轉移的機率、復發的機率和預后不良的程度等。比如用通過測定腫瘤標記、生檢作出的組織診斷和細胞診斷、TNM(T原發腫瘤的大小；N淋巴節轉移水平；M遠距離轉移)分類和熒光顯示式細胞分離機測定DNA含量等方法得到的信息，診斷癌癥。但是，在各種方法中存在以下問題
·診斷敏感度低；·最終診斷要憑觀察者自己的經驗，故診斷難；·診斷時的病態雖然能夠把握，但不能正確預測預后；·需要有嫻熟的技術。
這些問題表現出在癌癥的惡性度診斷中各人判斷的不同和醫療機關診斷方法的各異，從而成為癌癥惡性度診斷出現偏差的重要原因。
在決定癌癥的治療方針時，調查組織中所含細胞對抗癌藥等藥物的敏感性與診斷惡性度同樣重要。作為調查敏感性的方法有體外進行腫瘤細胞抗癌藥敏感性試驗的方法，如周知的MTT法(四氮唑鹽法，3-(4，5-dimcthylthioazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide)和DISC法(區別染色細胞毒法，differential staining cytotoxicity)。然而，無論哪種方法其陽性預測率都不到70％，作為是否進行抗癌藥物治療的判斷指標是不夠的。(Weisenthal，L.M.and Nygren.P(2002)Current status of cell culturedrug resistance testing(CCDRT)、//weisenthal.org/)。
如上所述，從患者身上采集的組織中測定CDK的表達量的方法在日本專利申請公告第號上有記載，CDK活性值的測定方法在美國專利申請公告第號上也有公開。但是，根據CDK的表達量和活性值診斷組織性質的試劑盒尚未開發。而且，測定CDK表達量和CDK活性值分別需要用很多試劑，這些試劑保存條件各異，放在一起保存非常煩雜。

發明內容
本發明目的是提供易于保存各種試劑的，對從患者身上采集的組織性質進行診斷的試劑盒。
本發明提供以下試劑盒
一種用于診斷從患者身上采集的組織的性質的試劑盒，包括用于測定所述組織中周期素依賴性激酶(CDK)的表達量的表達量測定試劑；及用于測定所述組織中CDK的活性值的活性測定試劑。
所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在第一保存條件下保存的試劑構成第一試劑組；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在不同于第一保存條件的第二保存條件下保存的試劑構成第二試劑組。
其中所述第一保存條件為冷藏保存，所述第二保存條件為冷凍保存。
其中所述第一試劑組包含被標記的CDK抗體(標記CDK抗體)、固定CDK抗體的載體、所述CDK的基質、三磷酸腺苷(ATP)；所述第二試劑組包含能與ATP和所述基質在所述CDK作用下反應生成的產物結合的標記物。
其中所述第一試劑組包括含有固定所述CDK抗體的載體的柱。所述第二試劑組包括已知濃度的CDK。
其中所述試劑盒用于組織性質診斷裝置，所述組織性質診斷裝置測定所述組織中的CDK表達量和活性值，并根據獲得的CDK表達量和活性值的數據診斷所述組織的性質。其中所述組織性質診斷裝置包括獲取反映所述組織中CDK表達量的第一數據的第一數據獲取手段、獲取反映所述組織中CDK活性值的第二數據的第二數據獲取手段以及根據所述第一數據和第二數據得出的值獲取所述組織性質的有關信息的解析手段。
本發明還提供一種診斷從患者身上采集的組織的性質的試劑盒，包括用于測定所述組織中第一周期素依賴性激酶(CDK)表達量的第一表達量測定試劑、用于測定第一CDK活性值的第一活性測定試劑、用于測定第二CDK表達量的第二表達量測定試劑及用于第二CDK活性值的第二活性測定試劑；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在第一保存條件下保存的試劑構成第一試劑組，所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在與第一保存條件不同的第二保存條件下保存的試劑構成第二試劑組。
其中所述第一保存條件為冷藏保存，所述第二保存條件為冷凍保存。
其中所述第一試劑組包含被第一標記物標記的第一CDK抗體(第一標記CDK抗體)、被第二標記物標記的第二CDK抗體(第二標記CDK抗體)、固定第一CDK抗體的第一載體、固定第二CDK抗體的第二載體、所述第一CDK及第二CDK的基質以及三磷酸腺苷(ATP)；所述第二試劑組包含能與ATP和所述基質在所述CDK作用下反應生成的產物結合的第三標記物。
其中所述第一試劑組包括含有所述第一載體的第一柱和含有所述第二載體的第二柱。
其中所述第二試劑組包含已知濃度的第一和已知濃度的第二CDK。
其中所述試劑盒用于組織性質診斷裝置，所述組織性質診斷裝置測定所述組織中的第一CDK和第二CDK的表達量和活性值，根據所得到的第一CDK及第二CDK表達量和活性值的數據，診斷哺乳動物組織的性質。
其中所述組織性質診斷裝置包括獲取所述第一CDK表達量的第一表達獲取手段、獲取所述第二CDK表達量的第二表達獲取手段、獲取所述第一CDK活性值的第一活性值獲取手段、獲取所述第二CDK活性值的第二活性值獲取手段以及根據所述第一表達量、第二表達量、第三活性值和第四活性值獲取所述組織性質的有關信息的解析手段。
其中所述第二試劑組含有已知濃度的蛋白質，該蛋白質被管家基因標記，所述第一試劑組含有所述蛋白質的已標記抗體。
其中所述第二試劑組有已知濃度的含哺乳動物細胞的細胞質與核內蛋白質的溶液。
其中所述第二試劑組配有組織增溶劑，用于增溶所述組織，配制組織液。所述第二試劑組含有已知濃度的周期素依賴性激酶抑制劑，所述第一試劑組含有所述周期素依賴性激酶抑制劑的抗體。
其中所述第一試劑組有用于減低背景的含蛋白質試劑。所述組織的性質指組織中所含細胞的增殖能、細胞對抗癌藥的敏感性或組織的惡性度。
其中所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在不同于第一和第二保存條件的第三保存條件下保存的試劑構成第三試劑組。
其中所述第三保存條件是常溫保存。


圖1為本發明實施方式的試劑盒的示意圖。
圖2為細胞周期的示意圖。
圖3為搭載本發明實施方式中的試劑盒診斷組織性質的診斷裝置的一例斜視示意圖。
圖4為圖3所示診斷裝置中的試片安放器的俯視圖。
圖5為圖4的從A到A的剖視圖。
圖6為安放在圖3所示診斷裝置中的試片安放器的蛋白固相用試片的上夾板的俯視圖。
圖7為圖6從B到B的剖視圖。
圖8為為安裝在圖3所示診斷裝置中的試片安放器的蛋白固相用的下夾板的俯視圖。
圖9為圖9的從C到C的剖視圖。
圖10為圖6的上夾板與圖8的下夾板的組合截面圖。
圖11為圖3所示診斷裝置中的活性測定單元的試樣配制器的縱截面示意圖。
圖12為圖3所示診斷裝置中的活性測定單元的試樣配制器的斜視圖。
圖13為圖12所示試樣配制器的流體集流腔的俯視圖。
圖14為圖13從D到D的剖視圖。
圖15為圖12所示試樣配制器的流體線路圖。
圖16為控制手段的硬件結構的框圖。
圖17為控制診斷裝置的控制器的框圖。
圖18為診斷裝置處理的全流程圖。
圖19為表達量測定用試樣配制處理的流程圖。
圖20為活性測定用試樣配制處理的流程圖。
圖21為活性測定用試樣的使用例示意圖。
圖22為診斷裝置解析處理一例的全流程圖。
圖23為診斷裝置解析處理其他例的全流程圖。
圖24為測定得出的診斷結果的使用例顯示圖。
圖25為關于敏感性解析的其他流程的顯示圖。
圖26為關于敏感性解析的其他診斷結果的顯示圖。
圖27為關于敏感性解析的另一部分診斷結果的顯示圖。
圖28為診斷裝置解析處理的其他實例的全流程圖。
圖29為診斷裝置解析處理其他實例的全流程圖。
具體實施例方式一種用于診斷從患者身上采集的組織的性質的試劑盒，其包括用于測定組織中周期素依賴性激酶(CDK)表達量的表達量測定試劑和用于測定組織中CDK活性的活性測定試劑。并且，表達量測定試劑和活性測定試劑中在第一保存條件下保存的試劑構成第一試劑組，多種試劑中在與第一保存條件不同的第二保存條件下保存的試劑構成第二試劑組。此種分類易于在各個不同的保存條件下識別、保存用于診斷從患者身上采集的組織性質的多種試劑。
在此，所謂從患者身上采集的組織的性質指組織中所含細胞的增殖能和組織中所含細胞對抗癌藥等藥物的敏感性以及組織中癌的惡性度。所謂組織中癌的惡性度是指癌的轉移機率、復發機率和預后的不良程度。通過診斷這些性質，可以診斷癌癥的預后情況及做耐藥性試驗。
下面就試劑盒的實施方式作一說明。不過本發明并不限于此實施方式。
本實施方式的試劑盒具有以下用于測定CDK表達量的各種試劑和用于測定CDK活性值的各種試劑。
表達量測定試劑群表達量測定試劑群有待測定CDK的經標記的CDK抗體(以下簡稱為標記CDK抗體)。標記CDK抗體可以從由CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、周期素A依賴性激酶、周期素B依賴性激酶、周期素D依賴性激酶及周期素E依賴性激酶構成的組群當中選出的周期素依賴性激酶的抗體選擇。作為標記CDK抗體的標準品可以使用熒光物、酶、或放射性同位素。
作為上述熒光物質，有熒光素、香豆素、曙紅、菲繞啉、芘、若丹明等，其中優選熒光素。作為標記酶，有β半乳糖酶、堿性磷酸酶、過氧化物酶等，其中，優選過氧化物酶。作為放射性同位素有32P。
另外，表達量測定試劑群最好包含以下物質已知濃度的CDK、用管家基因標記的已知濃度的蛋白質、針對該蛋白質的標記抗體和針對所述CDK的已知濃度的周期素依賴性激酶抑制劑(CDK抑制劑)以及針對該CDK抑制劑的抗體。
此外，表達量測定試劑最好有防止標記CDK抗體以外的化學物質結合到該CDK中的阻斷液。
上述已知濃度的CDK、用管家基因標記的已知濃度的蛋白質、已知濃度的CDK抑制劑用于求各自表達量所需的標準曲線。為此，表達量測定試劑最好備有諸如第一濃度CDK和不同于第一濃度的第二濃度CDK的不同濃度的試劑各兩種以上。
管家基因是正常細胞生存不可或缺的，可以從在幾乎所有細胞中都有表達的基因群中選擇。比如GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)和β-actin等。
CDK抑制劑可根據待測定CDK適當選擇。比如如果待測定CDK是CDK1，則可選p21，測定對象是CDK2，則選p21或p27，測定對象是CDK4及/或CDK6，則選p16或p27。
阻斷液可使用Block Ace(將Block Ace粉溶解在蒸餾水中而成)(大日本制藥社)、TBS-T(Tris Buffered Saline Tween)、BSA(牛血清白朊；Bovine Serum Albumin)等，蛋白質除白朊外，也可使用酪朊。
表達量測定試劑群因為要進行背景補正，最好有CDK以外的已知濃度的蛋白質溶液。BSA即可作為這種蛋白質的一例。
活性值測定試劑群活性值測定試劑群包含固定了CDK抗體(以下簡稱固定CDK抗體)的載體、能被該載體捕捉到的與周期素生成復合物的CDK(活化CDK)磷酸化的基質、能與這一基質反應的三磷酸腺苷(ATP)以及能結合到在活化CDK的作用下ATP和基質反應的產物中的標記物質。
固定CDK抗體可以選自CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、周期素A依賴性激酶、周期素B依賴性激酶、周期素D依賴性激酶和周期素E依賴性激酶等周期素依賴性激酶的抗體。
固定固定CDK抗體的載體，可以是單硅膠、或名稱為“朊Aセファロ一ズビ一ズ”、“朊Gセファロ一ズビ一ズ”的載體。
能被固定在載體上的CDK抗體捕捉到的活化CDK磷酸化的基質可根據待測定CDK適當選擇。具體地說，如果CDK是CDK1和/或CDK2，則優選組朊H1；如果上述CDK是CDK4和/或CDK6，以成視網膜細胞瘤蛋白為好。
標記物和ATP可適當選擇。比如，如果標記物是放射性同位素可選擇32P標記的三磷酸腺苷(γ-〔32P〕-ATP)。若標記物是熒光物質或酶，可選擇硫代三磷酸腺苷(ATP-γS)。
活性測定試劑群優選有以下試劑含固定CDK抗體之載體的柱管、含沒有固定CDK抗體之載體的柱管(空柱)、使從患者身上采集的組織配制的組織溶液中所含CDK與固定在該載體的CDK抗體能很好反應的緩沖劑、用于沖洗沒有被載體捕捉到的非吸附物的2種柱用洗滌劑、含已知濃度的哺乳動物細胞的細胞質和核內蛋白質的溶液以及含有減滅背景用蛋白質的溶液。
上述柱管最好有支持載體的部分和儲存溶液的部分。空柱可用于對活性測定結果進行背景補正。
改善固定在載體的CDK抗體與組織溶液中CDK反應的緩沖劑可使用Nonidet-P40等表面活性劑和含有Tris-HCl pH7.4的溶液。
沖洗非吸附物的2種柱用洗滌劑使用1)Nonidet-P40等表面活性劑、含Tris-HCl pH7.4和NaCl的溶液；2)Tris-HCl pH7.4等。最好讓載體捕捉CDK后，用1)沖洗1次，再用2)沖洗1次。
已知濃度的含有哺乳動物細胞的細胞質和核內蛋白質的溶液最好含有待測定CDK。并且此CDK不僅有與CDK抗體的結合部位，還由所有能排入的氨基酸序列組成，且形成應有的三維結構(構造)。
含有用于減滅背景的蛋白質的溶液可以使用與表達量測定試劑群所含阻斷液同樣成份的東西。具體地說，可使用50％Block Ace(將Block Ace粉溶于蒸餾水)(大日本制藥社)、TBS-T(Tris Buffered Saline Tween)、4％BSA(牛血清白朊；Bovine Serum Albumin)等。蛋白質除白朊外，還可使用酪朊。
另外，本試劑盒最好還有增溶劑、測定用試片和洗滌劑作為表達量測定和活性值測定通用試劑。增溶劑用于溶解從患者身上采集的組織調制組織液。測定用試片有可吸附組織液中所含蛋白質的膜，用于測定表達量和活性值。洗滌劑用于清洗測定用試片的膜等。
增溶劑最好是含有表面活性劑、蛋白質分解酶阻斷劑及脫磷酸化酶組斷劑的緩沖液。
表面活性劑用于破壞細胞膜和核膜，提取細胞內物質，但要使用表面活性不致于活化CDK分解的東西。比如Nonidet-P40、Triton X-100、脫氧膽酸、CHAPS等。最好表面活性劑濃度在1w/v％以下。
蛋白質分解酶阻斷劑用于防止細胞膜和核膜被打破后，混有細胞內物質時，作為蛋白質的CDK和周期素被分解酶破壞。比如，可以使用EDTA和EGTA等金屬蛋白酶阻斷劑、諸如PMSF、胰蛋白酶抑制劑和糜蛋白酶那樣的絲氨酸蛋白酶阻斷劑及/或碘乙酰胺和E-64那種胱氨酸蛋白酶阻斷劑混合物、SIGMA公司的蛋白酶阻斷劑混合物等預先混入蛋白質分解酶阻斷劑的市場販賣品。
脫磷酸化酶阻斷劑用于防止蛋白質--活化CDK自身的磷酸基加水分解后活性發生變化。作為絲氨酸/蘇氨酸脫磷酸化酶阻斷劑，有氟化鈉，作為酪氨酸脫磷酸化酶阻斷劑有正釩酸鈉。
測定用試片最好有1個以上的小池。設1個以上，既可以一次測定不同的試樣，又可以以不同的濃度測定同一試樣。
池底部的膜最好為疏水性多孔膜，疏水性多孔膜可以與蛋白質疏水結合，具體地說，有以下幾種PVDF(磺化聚二氟乙烯)疏水性膜、尼龍(已經電荷處理)膜、硝化纖維素等。疏水性多孔膜的孔為0.1～10μm，優選0.1～0.5μm。另，疏水性多孔膜最好經甲醇滲透等初始化處理。
以上所述各試劑的具體案例及其保存條件，如表1～6所示。表1～3為表達量測定試劑群，表4～5為活性值測定試劑群，表6為表達量測定和活性值測定通用的試劑群。對溶媒沒有特別記載的表示以蒸餾水作為溶媒使用。
表1表達量測定試劑群

表2表達量測定試劑群

表3表達量測定試劑群


表4活性值測定試劑群

表5活性值測定試劑群

表6表達量·活性值測定通用試劑群

本試劑盒為了測定組織中所含CDK表達量和活性值如上所述含有很多種試劑。特別是關于含有抗原等蛋白質的溶液，要防止蛋白質變質存放時就要注意保存條件。為此，要根據各種試劑中所含物質來選擇適當的保存條件。因此，通過分別將保存條件一樣的試劑歸為一組，更容易在正確的保存條件下保存，以便在穩定的狀態下使用本試劑盒。各種試劑的保存條件如表1～6所示。
圖1為試劑群的封裝例。i)為將本試劑盒所含試劑按保存條件(冷藏保存、冷凍保存)分開包裝的例子。ii)為將按保存條件分開包裝的試劑再分成表達量測定試劑群和活性值測定試劑群；iii)則為保存條件相同的試劑存放在同一包裝盒內，在該包裝盒內分設表達量測定試劑群空間和活性值測定試劑群空間。如ii)和iii)所示，將表達量測定試劑群與活性值測定試劑群分開還可以防止在將試劑放入所述組織性質診斷裝置時搞錯放置位置。作為表達量測定和活性值測定通用試劑的組織增溶劑(試劑號3001)在ii)和iii)存放在冷凍保存試劑群的哪一個包裝或空間都可。保存條件為常溫的洗滌劑(試劑號3002)和測定用試片(試劑號3003)如iv)所示，最好另行打包。
本試劑盒雖然可以用于手工測定，但最好放在全程自動化的裝置中使用。
作為這種裝置有具以下功能的組織性質診斷裝置第一數據獲取手段取得的第一數據反映從患者身上采集的組織中的CDK表達量；第二數據獲取手段取得的第二數據反映從患者身上采集的組織中的CDK活性；解析手段根據上述第一數據和第二數據得出的值，獲取關于組織性質的信息。
在此，本試劑盒通過對從患者身上采集的組織測定2種以上的CDK表達量和活性值，通過根據測定數據判斷組織性質來診斷組織所含細胞的增殖能、組織所含細胞對抗癌藥的敏感性和組織的惡性度。
所謂增殖能是細胞的增殖活性水平，指有關是否已超出增殖的控制機理(有無癌變)、及非整倍性的信息。
所謂對抗癌藥的敏感性指抗癌治療有無效果。抗癌藥，針對乳癌來說有CMF群(環磷酰胺、氨甲喋呤、氟脲嘧啶3劑合用療法)、多烯紫衫醇、紫杉醇等紫杉類抗癌藥、CE(環磷酰胺與表阿霉素2藥合用療法)、AC(阿霉素與環磷酰胺2藥合用療法)、CAF(氟脲嘧啶、阿霉素與環磷酰胺3藥合用療法)、FEC(氟脲嘧啶、表阿霉素、環磷酰胺3藥合用療法)、曲妥珠單抗與紫杉醇2藥合用療法以及截瘤達(capecitabine)等；針對胃癌有FAM(氟脲嘧啶、阿霉素與絲裂霉素C3藥合用療法、FAP(氟脲嘧啶、阿霉素與順鉑3藥合用療法)ECF(表阿霉素、順鉑與氟脲嘧啶3藥合用療法)、絲裂霉素C與替加氟2藥合用療法、氟脲嘧啶與卡莫司汀2藥合用療法等；針對大腸癌有氟脲嘧啶與醛氫葉酸2藥合用療法、絲裂霉素與氟脲嘧啶2藥合用療法等；針對卵巢癌有TP(紫杉醇與順鉑2藥合用療法)、TJ(紫杉醇與卡鉑2藥合用療法)、CP(環磷酰胺與順鉑2藥合用療法)、CJ(環磷酰胺與卡鉑2藥合用療法)等。
所謂惡性度指轉移機率、復發機率及預后情況等。復發是指為摘除惡性腫瘤切除部分臓器后殘存臓器再次出現同樣惡性腫瘤的情況，以及腫瘤細胞從原發病灶分移到遠處組織(遠處臓器)并在那里獨自增殖的情況。一般5年以內復發稱為“易復發”。按期分類的話，III期為復發率50％，比II期(復發率20％)容易復發。預后指預知疾病的過程和最終結果，5年或10年后的死亡率高為預后不良，比如，III期死亡率為50％，比II期(20％)預后差。
測定2種以上的CDK的表達量和活性值，求其在各種CDK中的比(下記式子中表示的CDK活性比或其逆數)，就能診斷從患者身上采集的組織的性質。
CDK活性比＝CDK活性值/CDK表達量上述算式算出的CDK活性比相當于細胞內存在的CDK中顯示活性的CDK比例，可以說是根據被診斷組織所含細胞增殖狀態得出的CDK活性水平。通過2種以上的CDK活性比、比如第1個CDK(第一CDK)的活性比與第2個CDK(第二CDK)活性比之比即可知道哪個CDK活性占優勢，由此可知在細胞周期的某個時期的細胞比例為多少或哪個時期的細胞比例更活躍等。
在此，CDK是與周期素結合活化的酶群的總稱，根據其種類，在細胞周期的特定時期發揮作用。CDK抑制劑是結合到周期素與CDK的復合物中阻礙其活性的因子群的總稱。CDK通常在細胞內作為非活性單體存在于細胞質中，CDK本身受磷酸化等活化移至核內。在核內，CDK與存在于核內的周期素分子結合變成活化CDK，在細胞周期的各個階段調節細胞周期的運行使其正常。另一方面，CDK抑制劑通過與CDK單體或活化CDK結合，使CDK變為非活性，調節細胞周期的運行使其不正常。因此，細胞內存在CDK單體、CDK與周期素及/或CDK抑制劑的復合物(以下簡稱CDK群)。
本試劑盒的測定對象CDK最好選自由CDK1、CDK2、CDK4、CDK6、周期素A依賴性激酶、周期素B依賴性激酶、周期素D依賴性激酶及周期素E依賴性激酶構成的群體。周期素A依賴性激酶是與周期素A結合表現出活性的CDK，現在判明的有CDK1和CDK2。周期素B依賴性激酶是與周期素B結合表現出活性的CDK，現在判明的有CDK1。周期素D依賴性激酶是與周期素D結合表現出活性的CDK，現在判明的有CDK4和CDK6。周期素E依賴性激酶是與周期素E結合表現出活性的CDK，現在判明的有CDK2。
這些CDK據現階段所知，如表7所示，分別與相應的周期素結合構成周期素·CDK復合物(活化CDK)，活化表7所示的細胞周期的特定時期。比如CDK1與周期素A或B、CDK2與周期素A或E、CDK4和CDK6與周期素D1、D2或D3結合成為活化CDK。另一方面，CDK活性有時受到表7所示CDKI阻礙，如p21阻礙CDK1、2，p27阻礙CDK2、4、6，p16阻礙CDK4、6。
表7

在此，從細胞開始增殖，經過DNA復制、染色體分配、核分裂、細胞質分裂等過程，分成2個子細胞再返回起點為一個周期，這一細胞周期如圖2所示，分為G1期、S期、G2期、M期4個期。S期為DNA復制期，M期為分裂期。G1期指從有絲分裂結束到DNA合成開始的一段時間，是進入M期的準備檢查期。一過了G1期的臨界點(在動物細胞中稱R點)細胞周期開始啟動，通常不停頓地巡回一周。G2期指DNA合成結束到有絲分裂開始的期間。細胞周期的主要檢查點是從G1期進入S期之前和從G2期到有絲分裂的入口處。特別是，G1期檢查點因為是扣動S期開始的扳機，非常重要。因為一過了G1期的某個點，細胞即使增殖信號消失，也不會停止增殖，從S→G2→M→G1這樣進行完細胞周期。另，停止增殖的細胞將帶著G1期的DNA含量休止一段時間(休止期(GO))，處于脫離細胞周期的狀態。在增殖誘導下可比細胞周期的G1期略晚一點進入S期。
一般來說，癌細胞逃脫正常的增殖控制，活躍地增殖，因此，S期、G2期的細胞比例較高。這種癌發展很快，可以說是惡性的。發生非整倍性一般也認為是在經過了異常的M期或不經M期直接從G1期進入S期的情況下，因此，存在于M期的細胞比例少也是診斷惡性度的指標。因此，作為表達量和活性值的測定對象可以選擇從G2期到M期活化并起作用的CDK1作為第1個CDK，選擇從G1期到S期活化并起作用的CDK2作為第2個CDK，將據測定結果所得的活性比之比通過與所定的臨界值進行比較作為細胞增殖和癌的惡性度的指標。
上述活性比之比對于細胞對藥物的敏感性也適用。比如近年指出的患者遺傳體質帶來的抗癌藥等藥物的療效不同就是起因于細胞對藥物的敏感性的不同。即，細胞原有的性質包含對藥物是否敏感的性質，2種以上的CDK活性比之比也與對藥物的敏感性有關。從2種CDK的表達量和活性值的測定結果得出的活性比之比通過與所定臨界值比較，就可診斷細胞對藥物的敏感性。
關于組織性質的診斷方法和對藥物(抗癌藥)的敏感性的診斷方法在國際公告第WO2004/076686號、日本專利申請第號、日本專利申請號中有詳細記載。
本試劑盒對作為測定對象的哺乳動物沒有特定，但對人，特別是臨床狀態更具體地要求診斷癌的狀態的人更有效。
本試劑盒要測定的被檢組織適于諸如含有超越增殖控制機構的腫瘤細胞的組織等一切想得到病理信息的被檢組織。考慮到患者的肉體和精神的損害和抗癌藥治療所需的高額費用等，希望知道是否該實施抗癌藥治療時本試劑盒也適用。作為組織，可以是乳腺、肺、肝臟、胃、大腸、胰臟、皮膚、子宮、精巢、卵巢、甲狀腺、副甲狀腺、淋巴系統、骨髓等。而且癌的種類可以是乳癌、胃癌、大腸癌、食道癌、前列腺癌等。
下面，用本發明的試劑盒和可搭載試劑盒的組織性質診斷裝置，測定從患者身上采集的組織所含的周期素依賴性激酶(以下稱CDK)的表達量和活性值，并根據所得測定結果診斷人的癌的惡性度和抗癌藥的有效性(敏感性)，就其方法進行詳細說明。
首先，就組織性質診斷裝置進行說明。圖3是可搭載本試劑盒的組織性質診斷裝置A(以下簡稱為診斷裝置A)的斜視示意圖。診斷裝置A主要由以下部分構成裝置主體20的前方部位的檢測器4、試片放置部分1、第1試劑放置部分5和第2試劑放置部分6、裝置主體20后面的活性測定單元2、收容廢液的廢液槽7和清洗吸管的吸管清洗槽8、根據裝置主體20的信息可以將吸管向三個方向(X方向、Y方向和Z方向)移動的分裝機關3、在裝置主體20背后的流體部分9和電子線路板部分10、以及作為控制手段與所述檢測器4和電子線路板10連接并可通信的電腦12。此外，診斷裝置A還配有純凈水箱13、清洗箱14、廢液箱15和空壓源11。純凈水箱13儲存測定結束時清洗流路用純凈水，通過管道21與流體部分9相接，清洗箱14儲存清洗吸管的洗滌劑，通過管道22與吸管清洗槽8相連，收容廢液的廢液箱15通過管道23與廢液槽7相接。診斷裝置A還配有用于從組織上抽取診斷裝置A可處理的測定試樣的增溶裝置B。
增溶裝置B在診斷裝置A處理前從組織中抽取制備診斷裝置A可處理的液態檢體，其包括筐體部分30、筐體部分30前上方的操作部分31、有一對擠壓磨碎所述組織的杵34的驅動部分32和裝有存放所述組織的艾本德(Eppendorf)管35的檢體放置部分33。
驅動部分32可上下驅動并左右旋轉杵34，注入艾本德管35內的生物試樣被其擠壓、磨碎。所述筐體部分30內藏有控制這些驅動部分32動作的控制器(無圖示)。
操作部分31有操作鍵31a、運轉燈31b、顯示裝置狀態和錯誤信息等的顯示器31c。檢體放置部分33內有無圖示的冷卻設施，使安裝在該檢體放置部分33上面凹處的艾本德管里的生物試樣保持一定的溫度。被增溶裝置B增溶、又被無圖示的離心機離心處理的生物試樣的上清液吸入規定的檢體容器中，放置到診斷裝置A的第一試劑放置部分5。
第一試劑放置部分5內與檢體放置部分33同樣有無圖示的冷卻設施，使第一試劑放置部分5上面凹處的螺旋蓋試管等容器內的檢體、各種熒光標記CDK抗體溶液和各種CDK抗原溶液等保持一定溫度。本實施方式所用組織性質診斷裝置設計為縱5列、橫4列共計20個凹處，可放置最多20個螺旋蓋試管等容器。
第二試劑放置部分6與第一試劑放置部分5相鄰。第二試劑放置部分6與第一試劑放置部分5一樣有多個凹處，這些凹處放置裝入緩沖劑、基液和熒光增強試劑等溶液的艾本德管和螺旋蓋試管等容器。在診斷裝置A處理之前，先將測定用試片放在試片安放器1，同時將柱管放置到活性測定單元。
試片安放器1由鋁塊構成，如圖4～5所示，為了放置測定用試片121，上面有凹部132，同時底部有吸口135。更詳細地說，試片安放器1上面有長方形的第一凹部132和在此第一凹部132底部有同樣長方形的第二凹部133。第一凹部132底面沿第二凹部133的邊緣配有長方形框狀的橡膠制彈性墊圈137。
第二凹部133其底部有十字形槽134，底部中心有吸口135，槽134的底部由第二凹部133邊緣向中心傾斜，越來越深。吸口135連通與外部吸移泵相接的管接頭136。后面還要詳述的測定用試片121隔第一凹部132底面的橡膠墊圈137平鋪在上面。當含蛋白試液注入或滴入測定用試片的各小池后，管接頭136連接的無圖示的吸移泵動作。從而測定用試片121夾橡膠墊圈137緊密吸附在第一凹部132的底面，同時各小池內的試液通過后述的疏水性多孔膜122吸移，測定目標蛋白呈固相吸附在該膜上。此時，也可將壓固測定用試片121于第一凹部132底面的固定部件設在試片安放器1。
測定用試片121由疏水性多孔膜122和夾持疏水性多孔膜122的上夾板101和下夾板111構成(圖10為截面圖)。這一蛋白固相用試片121發揮著使含周期素依賴性激酶抗體的抗體溶液與檢體接觸的第二接觸手段的功能。疏水性多孔膜122使用的是Millipore公司的止動劑-FL(PVDFmembrane、孔徑0.45μm)。
上夾板101如圖6～7所示。長方形的上夾板101上有呈矩陣狀排列為4行10列共40個長方形的穿孔102。上夾板101的下面繞上述40個穿孔102一周有槽(凹部)104。這個槽104將長方形疏水性多孔膜設置區域103界定在其內側。且，槽104底部有8個夾具穿孔105。
另一方面，圖8～9所示長方形下夾板111在與所述上夾板101的穿孔102對應的位置分別也有矩陣狀排列成4行10列共40個長圓形穿孔112。穿孔112有著與穿孔102同樣的形狀和截面積。
下夾板111的上面有繞40個穿孔112一周壟起的凸部114在與所述槽104對應的位置上。此凸部114將長方形疏水性多孔膜設置區域113劃定在其內側。下夾板111的周圍還有6個缺口115。另，上夾板101和下夾板111可以用氯乙烯樹脂材料制成。
圖10顯示了測定用試片121的截面，上夾板101和下夾板111如圖所示重疊在一起。凸部114壓入槽104，可隨時分離，各穿孔102和各穿孔112相互同軸。使用時，疏水性多孔膜設置區域103和113之間填裝長方形疏水性多孔膜122，再將所述凸部114壓入槽104，據此幾層壓縮為一體。如此，疏水性多孔膜122被各穿孔102劃分各個區域，各不互相滲水。中間只有穿孔102數量的小池(儲液)。
活性測定單元2如圖11～14所示，由具有各自的柱201和流體集流腔213的多個試樣配制器211組成，用于測定CDK活性值。圖11所示柱201由氯乙烯樹脂材料的圓筒構成，內有保留用于離析液體試樣中的目標物的載體206的載體保留器202及將液體試樣放入此載體保留器202儲存的液體儲存器204。柱201是使含有所定基質的基液與檢體接觸的第一接觸手段。
柱201的液體儲存器204上部有可從外部注入或抽取液體試樣的開口205。載體206由固定CDK1抗體或CDK2抗體的圓柱形單硅膠構成，以捕捉液體試樣中的CDK1或CDK2。此單硅膠與粒子載體不同，其結構為三維網狀骨架及其空隙為一體。載體206從柱201的下方開口處插入載體保留器202，夾○形環207被固定用管208有彈性地擠壓、固定。固定用管208從柱201下方開口處推入，固定用管208與○形環207的孔形成液體導入部分203。
另外，柱201下端有裝填用凸緣209，以便將柱201裝入試樣配制器211加以固定。此為橢圓形，即將直徑D的圓盤狀凸緣兩側平行切屑為寬度W(W＜D)。圖12是試樣配制器211的斜視圖，如該圖所示，試樣配制器211有一L字形的支撐板212，這一支撐板212固定有流體集流腔213、注射泵214和帶有減速機的步進電動機215。
步進電動機215的輸出軸上連接有螺旋狀旋轉軸216，與此螺旋狀旋轉軸216螺紋咬合的驅動臂217連接在注射泵214的活塞218前端。步進電動機215一帶動螺旋狀旋轉軸216旋轉，活塞218就上下運動。注射泵214和流體集流腔213之間通過連接器219、220用輸液管205連接。注射泵214通過連接器220a經輸液管220b與存放液體(洗滌劑)以灌滿流路的流體室234(圖14)相接。
如圖13～14所示，流體集流腔213有接有柱201的液體導入部203的柱連接器221和接受液體試樣的液體試樣接受器222。流體集流腔213內部有流路223，下面還有開合液體試樣接受器222與柱連接器221之間通路的電磁閥224及開合流路223與柱連接器221之間通路的電磁閥225。為連接連接器220，流體集流腔213側面還有連接器專用螺孔226，這個螺孔226連接到流路223。
圖15是試樣配制器211的流體線路圖，顯示出注射泵214通過連接器220a連接到流體集流腔213的狀態。注射泵214還通過電磁閥233連接有流體室234，加壓源235將壓縮空氣加到流體室234。
在此，說明一下將柱201裝填到流體集流腔213的方法。如圖13～14所示，流體集流腔213上面有接受柱201的受柱凹部227，此凹部227的底部中心與柱連接器貫通，并在底部裝有一圈○形環228。另有2張截面為L字形的壓板229、230以受柱凹部227為中心、以寬于所述寬度W、窄于D的間隔平行固定在流體集流腔213的上面。
凸緣209如從壓板229、230之間通過般將柱201裝入受柱凹部227，再順時針或逆時針旋轉90度。這樣，凸緣209的直徑D部分與壓板229、230咬合，同時，靠○形環228的彈性，凸緣209被壓板229、230固定。拆卸柱201時，只要壓著柱201向左或右轉動90度即可。
為防止柱201裝入試樣配制器211的流體集流腔213時混入氣泡，流體集流腔213的凹部227被流體充滿，一旦柱201的前端插入凹部227，根據其體積，流體會溢出。為防止這些液體溢出周圍，受柱凹部227周圍設置了溢液儲蓄凹部231，溢液儲蓄凹部231的部分還留出了溢液排出凹部232，以便用吸移管吸出溢液。各種檢體和試劑被具有吸移管的分裝設備3注入所定部位，或從所定部位吸出。在此，就檢體或試劑被注入液體試樣接受器222時的運行過程作一說明。當檢體或試劑被注入液體試樣接受器222時，首先，電磁閥224開啟(電磁閥225和233閉合)，注射泵214做吸入動作，從而，檢體或試劑通過電磁閥224被抽取到注射泵214一側。接著，關閉電磁閥224，打開電磁閥225，注射泵214做排出動作。這樣，檢體或試劑通過電磁閥225移送到柱201中。
分裝設備3如圖3所示，有朝X方向移動吸移管的支架352、朝Y方向移動吸移管的支架353和朝z方向移動吸移管的托板354。支架352有朝箭頭X方向移動托板354的螺旋軸355、支撐并拉動托板354的引導桿356和旋轉螺旋軸355的步進式電動機357。支架353有朝箭頭Y方向移動支架352的螺旋軸358、支撐并拉動支架352的引導桿359和旋轉螺旋軸358的步進式電動機361。托板354有朝箭頭Z方向移動固定吸移管的旋臂368的螺旋軸367、支撐并拉動旋臂368的引導桿和旋轉螺旋軸367的步進式電動機370。
本實施方式使用的組織性質診斷裝置因為分裝設備3具備一對吸移管362，因此可以同時向2個檢體容器注入試劑等，或同時從2個檢體容器抽取內容，從而更有效地進行測定處理。
裝置主體20的背面如圖3所示，配置有操作流體的流體部分9，上面連接了所述吸移管362、吸移管清洗槽8及各試樣配制器211等。這一流體部分9如圖14所示，有各試樣配制器211的電磁閥224、225、從低溫液室向注射器214注射液體時控制流體的電磁閥233、用吸移管362吸移液體時控制流體的電磁閥、從廢液槽7的吸移管362抽取廢棄的液體時控制流體的電磁閥和在吸移管清洗槽8清洗吸移管362時控制流體的電磁閥。
裝置主體20背面還配有給各種試樣配制器211、步進式電動機357、361、370、流體部分9等提供驅動信號的電子線路板部分10。
檢測器4用于測定反映固化在測定用試片121疏水性多孔膜122上的蛋白量的熒光物數量和反映磷酸基量的熒光物數量，將勵起光照射到測定用試片121，檢測發出的熒光量，再將與檢測的熒光強度相應大小的電信號輸出到電子線路板部分10。檢測器4可適當采用通用的由光源、照明系統和受光系統構成的儀器。
作為控制手段的電腦12如圖16所示，有聯線到所述電子線路板部分10的控制器77、向該控制器77輸入數據等的輸入設備78以及顯示分析結果等的顯示器79。控制器77構成了解析手段、用標準曲線從熒光強度獲取表達量的第一(第二)表達量獲取手段和用標準曲線從熒光強度獲取活性值的第一(第二)活性值獲取手段。
控制器77如圖16所示，有CPU91a、ROM91b、RAM91c、輸出入接口91d和圖像輸出接口91e。ROM91b中收納有操作系統、控制裝置運行的控制程序和實行控制程序所需的數據。CPU91a可將控制程序寄存到RAM91c、或從ROM91b直接運行。這樣，CPU91a處理的結果數據就通過輸出入接口91d傳送到電子線路板部分10，CPU91a處理所需的數據從電子線路板部分10通過輸出入接口91d被接收。CPU91a通過運行控制程序來實現對電子線路板的控制。CPU91a根據檢測器4獲得的熒光強度，取得周期素依賴性激酶(CDK)的表達量和活性值，再根據取得的值得出有關組織性質的信息。為了獲取CDK的表達量和活性值，所述RAM91c存儲有將熒光強度轉換為表達量或活性值的轉換數據--標準曲線。
圖17為控制診斷裝置A的控制器的框圖。此控制器如該圖所示，包括有驅動分裝設備3各部分的驅動線路的電子線路板部分10和由以下幾部分組成的電腦控制器77控制該電子線路板的同時，還分析檢測器4檢測出的結果；輸入設備78向該控制器77輸入數據等；顯示控制器77分析得出的分析結果等內容的顯示器79。
控制器77通過控制電子線路板部分10輸出以下信號通過電子線路板部分10驅動各試樣配制器211的步進式電動機215的驅動信號、調節第一試劑放置部分5的溫度的驅動信號、驅動步進式電動機357、361、370的驅動信號以及驅動流體部分9里面的電磁閥的驅動信號。控制器77通過電子線路板部分10從檢測器4讀取檢測信號。
下面，以診斷人的癌細胞的惡性度(復發風險高低)和抗癌藥的有效性(敏感性)為例，就使用本試劑盒和診斷裝置A診斷組織性質作一說明。另，以下使用的試劑號與表1～6所列試劑相對應。
(1)增溶裝置的預處理在診斷裝置A處理前，首先用增溶裝置B從癌癥患者身上摘除的組織中采集液態檢體，現就這一方法加以說明。首先，將從癌癥患者身上采集的組織(約2mm3)用鑷子放入裝有組織增溶劑(試劑號3001)的試管中，將該試管安放到圖3所示增溶裝置B的檢體放置部分33。接下來，按操作部分31的開始鍵，則杵34下降到所定位置，擠壓試管內的組織到試管底部，在此狀態下旋轉杵34碾碎組織。經一定時間后，停止杵34的運動，將杵34提起后，從檢體放置部分33取出試管。然后，將已增溶的試管內的物質用離心機處理，按指南抽取所得上清液作為檢體。
(2)表達量測定用試樣在診斷裝置上的放置將抽取的上清液裝入2個檢體容器，以各不相同的稀釋倍率稀釋后安放到第一試劑放置部分5。2個檢體中，一邊是表達量測定用檢體，另一邊是活性值測定用檢體。
再將以下試劑放到第一試劑放置部分5熒光標記CDK1抗體溶液(試劑號1001)、熒光標記CDK2抗體溶液(試劑號1002)、熒光標記p21抗體溶液(試劑號1003)、熒光標記GAPDH抗體溶液(試劑號1004)、CDK1抗原溶液1(試劑號1005)、CDK1抗原溶液2(試劑號1006)、CDK2抗原溶液1(試劑號1007)、CDK2抗原溶液2(試劑號1008)、p21抗原溶液1(試劑號1009)、p21抗原溶液2(試劑號1010)、GAPDH抗原溶液1(試劑號1011)、GAPDH抗原溶液2(試劑號1012)以及活性用校準器溶液(試劑號2011)。
另，將以下試劑放到第二試劑放置部分6阻斷液(試劑號1013)、免疫沉降(IP)緩沖劑(試劑號2004)、反應前緩沖劑1(試劑號2005)、反應前緩沖劑2(試劑號2006)、基液(試劑號2007)、熒光標記液(試劑號2008)、熒光增強試劑(試劑號2009)和反應停止液(試劑號2010)。
(3)診斷裝置處理全程在此，就圖18所示診斷裝置處理的全過程做一說明。另，在以下流程圖的判斷中，對「Yes」和「No」不作圖示時，則下為Yes，右(左)為No。以下所述處理全部由控制器77控制。
首先，一接通電源，則接受測定注冊(步驟S1)。在這一處理過程中，接受檢體號等有關測定信息的輸入。接著，接受選擇預后預測模式(判斷人的癌細胞的惡性度(復發風險的高低)模式)還是抗癌藥敏感性模式(判斷抗癌藥的有效性(敏感性)模式)等對某一個模式的選擇(步驟S2)。具體地說，電腦12顯示器79上出現2種模式的輸入鍵。操作者按希望選擇的模式鍵。本例是以抗癌藥敏感性模式判斷紫衫類抗癌藥的敏感性。除上述2種模式外，還可選擇預后預測·抗癌藥敏感性模式。
接下來，判斷是否接受了開始測定的指令(步驟S3)。若為Yes則進入步驟S4，若為No則進入步驟S8。從放置在第一試劑放置部分5的檢體容器中抽取檢體，對抽取的檢體進行一定的處理，配制成熒光檢測用的試樣(步驟S4)。此步驟中包括后面還要詳細描述的表達量測定用試樣的配制和活性值測定用試樣的配制，這兩個處理同時進行。
將安放了含有熒光檢測用試樣的測定用試片121(試劑號3004)的試片安放器1從圖3所示位置移到檢測器4中(步驟S5)，用勵起光照射測定用試片的各小池，檢測熒光檢測用試樣放射出的熒光(步驟S6)。
由電腦12的控制器77獲取熒光強度，根據獲取的熒光強度輸出解析結果(步驟S7)。判斷是否接到關閉診斷裝置的指令(步驟S8)，若為Yes則進入步驟S9，若為No則返回步驟S1。最后，關機處理，切斷電源(步驟S9)。
(4)表達量測定用試樣的配制步驟S4中的表達量測定用試樣的配制過程如圖19所示。首先，排出預存在測定用試片121(試劑號3003)的各小池的保存液(TBS；25mM Tris、150mM NaCl、pH7.4)，清洗各小池(步驟S11)。清洗過程是通過分裝設備3的吸移管將洗滌劑(試劑號3002)從上方注入各小池，再從測定用試片的下方通過疏水性多孔膜用真空方法將注入的洗滌劑抽出來。以后所述清洗工序也一樣。
其次，用吸移管從放置在第一試劑放置部分5的檢體容器中吸移配制作表達量測定之用的檢體至所定池內，然后再用真空方法將這一檢體從測定用試片121(試劑號3004)下方吸移。這樣一來，檢體中所含蛋白質就會因與疏水性多孔膜之間的疏水結合而保留并固化(步驟S12)。接下來與步驟S11一樣，清洗所述所定的池，如此，蛋白質以外的成份從測定用試片的疏水性多孔膜除去(步驟S13)。
之后，用吸移管抽取放在第一試劑放置部分5的阻斷液(試劑號1014)注入所定池內，放置15分鐘以上(比如30分鐘)后將殘留在池內的阻斷液排出(步驟S14)。這樣可以防止接下來要注入的熒光標記CDK1抗體溶液(試劑號1001)、熒光標記CDK2抗體溶液(試劑號1002)、熒光標記p21抗體溶液(試劑號1003)和熒光標記GAPDH抗體溶液(試劑號1004)在疏水性多孔膜中沒有蛋白質固化的部位固化。接著，向2個池內注入該熒光標記CDK1抗體溶液、該熒光標記CDK2抗體溶液、該熒光標記p21抗體溶液、該熒光標記GAPDH抗體溶液、以及背景溶液(試劑號1013)。經過20～30分鐘，各熒光標記抗體溶液與固化在疏水性多孔膜上的蛋白質(CDK1、CDK2、p21、或GAPDH)反應結束后，排出注入的各熒光標記抗體溶液(步驟S15)。最后，與步驟S13一樣清洗所定小池(步驟S16)。
此外，關于除阻斷液(試劑號1014)外還收容有反應前緩沖劑1(試劑號2005)、反應前緩沖劑2(試劑號2006)和熒光增強試劑(試劑號2009)的可二連動容器，有2個液體儲存器，其寬度設定為分裝設備3的兩個吸移管可同時吸移溶液。
(5)活性值測定用試樣的配制步驟S4中的活性值測定用試樣的配制過程如圖20所示。在這一活性值測定用試樣的配制處理中，圖3所示的活性測定用單元2使用的是有圖中靠前部分的4個試樣配制器211和圖中靠后部分的4個試樣配制器211的設備。活性測定以此活性測定單元2的各試樣配制器211為(圖中后排左起)第一試樣配制器(Ac1)、第二試樣配制器(Ac2)、第三試樣配制器(Ac3)和第四試樣配制器(Ac4)，和(圖前排左起)第五試樣配制器(Ac5)、第六試樣配制器(Ac6)、第七試樣配制器(Ac7)和第八試樣配制器(Ac8)。
首先，將CDK1柱(試劑號2001)3根、CDK2柱(試劑號2002)3根及空柱(試劑號2003)2根共計8根柱(以下有時簡稱各柱)如圖21所示放在第1～第8試樣配制器(Ac1～Ac8)后，針對第1～第8試樣配制器(Ac1～Ac8)，用分裝設備3的吸移管向液體試樣接受部分222注入免疫沉降緩沖劑(試劑號2004)。憑借注射泵214和電磁閥224、225如所述動作，緩沖劑輸送到8根該各柱。然后，全部各柱中的免疫沉降緩沖劑又被分裝設備3的吸移管抽出、廢棄(步驟S21)。
接下來，進行免疫沉降(抗體與CDK反應)(步驟S22)。移送檢體的順序如圖21所示。先從放在第一試劑放置部分5的一個檢體容器中用分裝設備3的一個吸移管抽取活性值測定用檢體1，用另一個吸移管抽取活性值測定用檢體2。
從檢體容器抽取的活性值測定用檢體1注入第一試樣配制器(Ac1)的液體試樣接受部分222，再憑借注射泵214和電磁閥224、225的所述動作，移送到設在第一試樣配制器(Ac1)的空柱(試劑號2003)中。此時，使活塞218上下往返1.5次(排出-抽取-排出)，以此讓檢體1在空柱內的單硅膠載體中往返1.5次。
另一方面，從檢體容器抽取的活性值測定用檢體2注入第五試樣配制器(Ac5)的液體試樣接受部分222，與上述一樣通過這一接受部分輸送到安放在第五試樣配制器(Ac5)的空柱(試劑號2003)中。第一試樣配制器(Ac1)和第五試樣配制器(Ac5)的該空柱的單硅膠載體中既無固相CDK1的抗體，也無固相CDK2的抗體。因此，在第一試樣配制器(Ac1)和第五試樣配制器(Ac5)CDK1和CDK2不固化，放在第一試樣配制器(Ac1)的空柱中存留有含CDK1及CDK2的檢體1，放在第五試樣配制器(Ac5)的空柱中存有含CDK1及CDK2的檢體2。
然后，存留在第一試樣配制器(Ac1)的空柱中的檢體1用分裝設備3的吸移管抽取，注入第三試樣配制器(Ac3)的液體試樣接受部分222，并通過該接受部分與上述一樣輸送到第三試樣配制器(Ac3)的CDK1柱(試劑號2001)。
存留在第五試樣配制器(Ac5)的空柱內的檢體2用分裝設備3的吸移管抽取，注入第四試樣配制器(Ac4)的液體試樣接受部分222，再通過該接受部分與上述一樣輸送到第四試樣配制器(Ac4)的CDK1柱(試劑號2001)中。CDK1抗體固定在第三試樣配制器(Ac3)和第四試樣配制器(Ac4)中的CDK1柱的單硅膠載體中，因此，在第三試樣配制器(Ac3)和第四試樣配制器(Ac4)，CDK1被固化，但CDK2卻不被固化，放在第三試樣配制器(Ac3)中的CDK1柱剩下不含CDK1含CDK2的檢體1，第四試樣配制器(Ac4)的CDK1柱剩下不含CDK1含CDK2的檢體2。
接著，留在第三試樣配制器(Ac3)的CDK1柱(試劑號2001)中的檢體1被分裝設備3的吸移管抽取出來，注入第七試樣配制器(Ac7)的液體試樣接受部分222，并通過該接受部分與上述一樣輸送到放在第七試樣配制器(Ac7)的CDK2柱(試劑號2002)。
留在第四試樣配制器(Ac4)的CDK柱(試劑號2001)內的檢體2用分裝設備3的吸移管抽取，注入第八試樣配制器(Ac8)的液體試樣接受部分222，并通過該接受部分與上述一樣輸送到第八試樣配制器(Ac8)的CDK2柱(試劑號2002)中。CDK2抗體固定在第七試樣配制器(Ac7)和第八試樣配制器(Ac8)中的CDK2柱的單硅膠載體中，因為在第七試樣配制器(Ac7)和第八試樣配制器(Ac8)，CDK2被固化，所以放在第七試樣配制器(Ac7)中的CDK2柱內只有不含CDK1和CDK2的檢體1，第八試樣配制器(Ac8)的CDK2柱內只有不含CDK1和CDK2的檢體2。第七試樣配制器(Ac7)和第八試樣配制器(Ac8)的CDK2柱中存留的檢體1和檢體2分別用分裝設備3的吸移管抽取出來廢棄到廢液槽7中。
第一試劑配制器(Ac1)和第五試樣配制器(Ac5)用于測定背景活性，第三試劑配制器(Ac3)和第四試樣配制器(Ac4)用于測定CDK1活性，第七試劑配制器(Ac7)和第八試樣配制器(Ac8)用于測定CDK2活性。
這樣，通過將柱內剩余的檢體注入其他柱，實現了用少量的檢體即可進行背景活性測定、CDK1活性測定及CDK2活性測定。
此外，為繪制活性值的標準曲線，按上述同樣的辦法測定了活性用校準液(試劑號2011)的活性值。
接下來，為清洗、去除檢體中的不需要成份，將反應前緩沖劑1(試劑號2005)移送到各柱(步驟S23)。然后，因為反應前緩沖劑1(試劑號2005)會影響在步驟S25實施的酶反應，故以為這種酶反應創造條件為主要目的，將反應前緩沖劑2(試劑號2006)移送到各柱，沖洗反應前緩沖劑1(試劑號2005)的成份(步驟S24)。
接下來，將基液(試劑號2007)注入各柱，讓活塞219往返5.5次(步驟S25)。從各柱下方擠出的溶液先原封不動地存放在各柱內。通過此步驟，以CDK1或CDK2為酶，將磷酸基導入基液含有的組蛋白H1中。這一磷酸基的量將受CDK1或CDK2發揮酶的作用的強弱(即活性值)所左右，因此，通過測定所述磷酸基的量即可求出CDK1或CDK2的活性值。另外，圖21所示使用第一試樣配制器(Ac1)和第五試樣配制器(Ac5)求得的背景活性值如后所述，用于背景補正。
下一步，將熒光標記溶液(試劑號2008)用吸移管從各柱的上方直接分別注入各柱內，使熒光標記與被導入到HistonH1中的磷酸基結合(步驟S26)。此時，吸移管在一定時間內反復注入和抽取各柱內的液體，以此攪拌各柱內的液體。從步驟S26開始經過一定時間(比如20分鐘)后，將反應停止液(試劑號2010)和熒光標記試劑一樣直接分別注入各柱。然后與步驟S26同樣在一定時間內反復分別注入和抽取各柱內的液體，從而攪拌各柱內的液體(步驟S27)。熒光標記的結合到此為止。
將第一試樣配制器(Ac1)、第三試樣配制器(Ac3)、第四試樣配制器(Ac4)、第五試樣配制器(Ac5)、第七試樣配制器(Ac7)和第八試樣配制器(Ac8)的6根柱內的液體分別注入測定用試片121(試劑號3004)的6個小池內，再從測定用試片121下方抽取(步驟S28)。以此，含有熒光標記結合的磷酸基的組蛋白H1被固化在測定用試片121的多孔膜。接下來和在所述表達量測定用試樣的配制處理步驟S11同樣，用洗滌劑(試劑號3002)清洗小池(步驟S29)。最后，為了活化熒光，向小池內注入、排出熒光增強劑(試劑號2009)，并反復6次(步驟S30)。
(6)解析處理如圖22所示，解析是根據檢測器得出的熒光強度進行的，其結果將輸出。首先，控制器77通過電子線路板部分10從檢測器4的受光系統分別就CDK1的表達、CDK1的活性、CDK2的表達、CDK2的活性、p21的表達、背景的表達和背景的活性各獲取2個熒光強度(步驟S31)。
其次，控制器77計算出各獲取了2個的熒光強度的平均值(步驟S32)，從CDK1表達的熒光強度(平均值)減去背景表達(平均值)，同時，從CDK2表達的熒光強度(平均值)減去背景表達(平均值)，以此就CDK1表達、CDK2表達和p21表達進行背景補正。關于CDK1活性、CDK2活性和p21活性也用同樣方法進行背景補正(步驟S33)。
下一步是用標準曲線就各項獲取表達量和活性值(步驟S34)。此標準曲線是將熒光強度轉換為表達量或活性值的依據。至于標準曲線的繪制，表達量的標準曲線是根據以下試劑的表達量測定結果繪制的所述CDK1抗原溶液1(試劑號1005)、CDK1抗原溶液2(試劑號1006)、CDK2抗原溶液1(試劑號1007)、CDK2抗原溶液2(試劑號1008)、p21抗原溶液1(試劑號1009)、p21抗原溶液2(試劑號1010)、GAPDH抗原溶液1(試劑號1011)及GAPDH抗原溶液2(試劑號1012)。活性值的標準曲線是根據上述活性用校準器溶液(試劑號2011)的活性值測定結果繪制的。這些表達量和活性值的標準曲線被存儲在控制器77的RAM91c中。根據以下公式計算CDK1活性比和CDK2活性比(步驟S35)。
CDK1活性比＝CDK1活性值/CDK1表達量CDK2活性比＝CDK2活性值/CDK2表達量按以下公式計算CDK1活性比和CDK2活性比之比(步驟S36)。
CDK1活性比與CDK2活性比之比＝CDK2活性比/CDK1活性比在此，首先判斷CDK2活性比是否超過第1臨界值(步驟S37)，如果CDK2活性比高于第1個臨界值則說明癌的復發機率很高。如果CDK2活性比低于第1臨界值則看CDK1活性比與CDK2活性比之比是否超過第2臨界值(步驟S38)，如果該比高于第2臨界值則說明癌的復發機率高，若該比低于第2臨界值則判斷為癌的復發機率低。最后，顯示決定復發機率大小的根據--CDK1表達量、CDK1活性值、CDK1活性比、CDK2表達量、CDK2活性值、CDK2活性比、CDK1活性比與CDK2活性比之比的同時，顯示復發機率的診斷結果(步驟S39)。
在此，舉例說明實際中用本試劑盒測定乳癌組織的表達量和活性值，判斷復發機率的情況。本例根據從乳癌患者W、X、Y及Z4人身上分別采集的被檢組織，用上述方法作出了復發機率的判斷。關于4名乳癌患者的被檢組織，病理醫生的診斷結果(TMN分類、淋巴節轉移的情況、癌組織的大小、術后5年的復發可能性及復發部位)如表8所示。4人全部為早期乳癌(LN為a)，被檢組織經冷凍保存。
表中的“LN”表示手術時的淋巴轉移狀態，其中“a”表示所屬淋巴節沒有認定轉移的部分，“b”表示所屬淋巴節中認定轉移到1～3個的部分，“c”則表示所屬淋巴節中認定轉移達到4個以上的部分。“T”則表示手術時原病灶的尺寸，腫瘤直徑在2cm以下的用“a”、2cm～5cm的用“b”、5cm以上的用“c”表示。
針對4名乳癌患者的被檢組織用所述試劑盒和組織性質診斷裝置測定CDK1活性比和CDK2活性比，判斷被檢組織的復發機率。從乳癌患者W、X、Y及Z身上采集的被檢組織的CDK1活性比與CDK2活性比之比分別如表8所示。首先預設第1臨界值為10000，與CDK2活性比進行比較。比超過第1臨界值(10000)的乳癌患者X的被檢組織被診斷為癌癥復發率高。接著，預設第2臨界值為46，與CDK1活性比和CDK2活性比之比進行比較。比超過第2臨界值(46)的乳癌患者Z的被檢組織被診斷為癌癥復發率高，比小于第2臨界值的乳癌患者W和Y的被檢組織被診斷為癌癥的復發率低。結果如表8所示。
表8

如表8所示，即使是被認為惡性度不高的早期乳癌從用所述試劑盒和組織性質診斷裝置得出的測定結果看，患者X及Z被診斷為復發率高，實際上在手術后5年內復發了。另一方面，被診斷為復發率低的患者W及Y沒有復發。
圖23是圖22所示診斷裝置解析處理其他例的全流程圖。在本例中，在步驟S40診斷紫杉類抗癌藥的敏感性。本實施例所示的解析處理，從步驟S31到步驟S36與圖21所示的解析處理是一樣的。
在此，首先判斷所述CDK2活性比是否高于第1臨界值(步驟S40)，若CDK2活性比高于第1臨界值則對抗癌藥敏感性高，即判斷抗癌藥有效。若CDK2活性比低于第1臨界值，則看所述CDK1活性比與CDK2活性比之比是否高于第3臨界值(步驟S41)，若比高于第3臨界值則判斷對抗癌藥敏感性高，若比低于第3臨界值，則判斷對抗癌藥敏感性低。并且作為以上各判斷根據的CDK1表達量、CDK1活性值、CDK1活性比、CDK2表達量、CDK2活性值、CDK2活性比、CDK1活性比與CDK2活性比之比將顯示出來，同時，抗癌藥的敏感性的判斷結果也顯示出來(步驟S42)。
在此，說明實際應用本試劑盒測定乳癌組織表達量和活性值、判斷上述紫杉類抗癌藥敏感性的具體實例針對從乳癌患者O、P、Q身上采集的被檢組織用上述方法判斷紫杉類抗癌藥敏感性。關于3名乳癌患者的被檢組織，病理醫生的診斷結果(TMN分類、淋巴節轉移的狀態、癌組織的大小、抗癌藥療效)如表9所示。3人都是進行性癌(LN為c或b)，所用被檢組織是為生檢采集的。
對于沒有接受過抗癌藥治療的3名乳癌患者O、P、Q的被檢組織，用試劑盒和組織性質診斷裝置測定CDK1活性比和CDK2活性比，判斷紫杉類抗癌敏感性。從乳癌患者O、P、Q身上采集的被檢組織的CDK1活性比與CDK2活性比之比分別如表9所示。在此，首先與圖21一樣，先設第1臨界值為10000，與CDK2活性比比較，比高于第1臨界值(10000)的乳癌患者P及Q的被檢組織被診斷為對抗癌藥的敏感性高，即抗癌藥有效。接著預設第3臨界值為48，比較CDK1活性比與CDK2活性比之比，該比高于第3臨界值(48)的乳癌患者O的被檢組織也被診斷為對抗癌藥敏感性高。結果見表9。另，表中“PR”(partial response)指可計測病變總和減少50％以上及沒有出現新病變。
表9

如表9所示，診斷為抗癌藥敏感性高的被檢組織被認為抗癌藥療效顯著。
(7)診斷結果的利用實例圖24顯示出醫生是如何利用圖22中的步驟S39和圖23中的步驟S42所表示的診斷結果的。
對于患者，用圖像診斷乳癌的可能性，通過生檢的病理組織診斷或細胞診斷確診癌癥。如果病理組織診斷的結果確診為癌癥早期，則實施癌組織摘除手術，對摘除的組織用診斷裝置A診斷組織性質。若診斷裝置A診斷組織性質的結果為癌癥屬低機率群(診斷裝置A顯示的診斷結果為“復發機率低”)，則醫生會選擇治療方案1(荷爾蒙治療藥單獨使用)，若結果為癌癥屬高機率群(診斷裝置A顯示的診斷結果為“復發機率高”)，則診斷對紫杉類抗癌藥的敏感性。若屬于使用紫杉類抗癌藥有效的紫杉敏感性群體(診斷裝置A顯示的診斷結果為“抗癌藥敏感性高”)的話，就選擇治療方案2(荷爾蒙藥劑與紫杉類抗癌藥合用)。如果診斷裝置A顯示的診斷結果為“抗癌藥敏感性低”的話，就不能斷言紫杉類藥物有效，就要根據醫生的判斷選擇治療方案2(荷爾蒙藥劑與紫杉類抗癌藥合用)或治療方案3(荷爾蒙藥劑與紫杉以外的化學抗癌藥合用)。
另外，如果在病理組織診斷中診斷為進行性癌，則考慮到患者的生活方式和保留乳房的要求及治療費等情況，一般醫生都會與患者研究是否進行術前化療(摘除手術前的化學抗癌藥治療)。如果進行術前化療，則用診斷裝置A對在抗癌藥(紫杉類)浸泡24小時的生檢樣品進行抗癌藥敏感性診斷。若診斷裝置A顯示的診斷結果為“抗癌藥敏感性高”則選擇治療方案2(荷爾蒙藥劑與紫杉類抗癌藥合用)。若診斷裝置A顯示的診斷結果為“抗癌藥敏感性低”，就不能斷言紫杉類藥物有效，就要根據醫生的判斷選擇治療方案2(荷爾蒙藥劑與紫杉類抗癌藥合用)或治療方案3(荷爾蒙藥劑與紫杉以外的化學抗癌藥合用)。以這種診斷結果為指針，可以適當進行術前化療，用抗癌藥將癌組織縮小后再摘除。
如果不進行化療，就直接進行摘除手術，對摘除的癌組織用診斷裝置A進行抗癌藥敏感性診斷。若診斷裝置A顯示的診斷結果為“抗癌藥敏感性高”，則選擇治療方案2(荷爾蒙藥劑與紫杉類抗癌藥合用)。若診斷裝置A顯示的診斷結果為“抗癌藥敏感性低”，則不能斷言紫杉類藥物有效，就要根據醫生的判斷選擇治療方案2(荷爾蒙藥劑與紫杉類抗癌藥合用)或治療方案3(荷爾蒙藥劑與紫杉以外的化學抗癌藥合用)。
圖25顯示了關于解析敏感性的其他流程。這一流程也是對紫杉類抗癌藥的敏感性進行診斷，再比較CDK2活性比與臨界值“400”(步驟S50)，CDK2活性比高于400，則診斷為敏感性高型I，若CDK2活性比不到400，則比較p21表達量與臨界值“8”(步驟S51)。若P21表達量超過8，則診斷為敏感性低型III，若p21表達量不到8，則診斷為敏感性中型II。另外，在本實施例中，CDK2活性比及p21表達量的各臨界值可根據預先收集的患者的數據等設定。
圖26顯示的是關于解析敏感性的其他的診斷結果。在這一結果中，根據周期素(Cyclin)E的表達量和CDK2的活性比診斷出CE(抗癌藥)的敏感性。具體地說，通過將CDK2活性比與周期素E表達量之比與所定臨界值比較，判斷CE的敏感性。周期素E的表達量可以通過適當改變試劑與CDK1的表達量一樣測定。
圖27顯示了關于解析敏感性的又一診斷結果。根據這一結果，通過將CDK1活性比與所定臨界值比較診斷CMF(抗癌藥)的敏感性。在這一結果中，患者No.1～16摘除手術后接受CMF藥物治療，沒有發現癌癥復發；患者No.17～25雖然也接受了CMF藥物治療，但癌癥復發了。在這種情況下，若臨界值設為“90”，則CDK1活性比高于90的8例(No.1、6、9、11～15)都沒有復發，說明90這一臨界值是合適的。診斷中使用了摘除后經冷凍保存的組織。
圖28為圖22所示解析處理的又一流程示意圖。此流程所示的解析處理從步驟S31到步驟S36與圖22的解析處理一樣。此例所示解析處理中，在步驟S43判斷步驟S2選擇的模式是預后預測模式還是敏感性模式，如果是預后預測模式，則看所述CDK1活性比與CDK2活性比之比是否超過第4臨界值(步驟S44)，若為敏感性模式，則看CDK2活性比是否超過第5臨界值(步驟S46)。在步驟S44，如果CDK1活性比與CDK2活性比之比超過第4臨界值，則診斷為復發機率高，如果CDK1活性比與CDK2活性比之比低于第4臨界值，則診斷為復發機率低。而且，當診斷為復發機率高時，就要看是否實施敏感性模式(步驟S45)。具體地說，電腦12的顯示器79上有實施敏感性模式還是只顯示復發機率的診斷結果的選擇鍵，接受操作者輸入。在步驟S45，如果判斷實施敏感性模式則處理進入到步驟S46，如果判斷不實施敏感性模式(只顯示復發機率的診斷結果)則處理進入到步驟S49。在步驟S46，CDK2活性比如果超過第5臨界值，則診斷為敏感性高、即抗癌藥有效，另一方面，若CDK2活性比小于第5臨界值則進行p21表達量與第6臨界值的比較(步驟S47)。
當p21表達量小于第6臨界值時，診斷為敏感性低，而當p21表達量高于第6臨界值時，進行CDK1活性比與第7臨界值的比較(步驟S48)。如果CDK1活性比小于第7臨界值，則診斷為敏感性略低，如果CDK1活性比高于第7臨界值，則診斷為敏感性中等。
最后顯示作為以上各判斷根據的CDK1表達量、活性值、活性比、CDK2表達量、活性值、活性比、CDK1活性比與CDK2活性比之比以及p21表達量，同時根據所選擇的模式，顯示復發機率的診斷結果或敏感性的診斷結果(步驟S49)。
作為第4至第7臨界值可使用國際申請第PCT/JP2005/009847號上記載的臨界值以及日本專利申請第號上記載的臨界值。而且，作為第4臨界值，最好使用與所述第1臨界值相同的值。
圖29為圖28所示解析處理的其他實施例的流程圖。根據這一流程，圖17中的步驟S1不含接受模式選擇的處理，在步驟S61進行復發機率診斷，只對復發機率高的檢體實施抗癌藥敏感性診斷(步驟S62)。其他步驟同圖28。
在上述流程中，診斷裝置A可以診斷復發機率和抗癌藥的敏感性，但本發明并不僅限于此，只能進行某一項診斷的診斷裝置也適用本試劑盒。
權利要求
1.一種用于診斷從患者身上采集的組織的性質的試劑盒，包括用于測定所述組織中周期素依賴性激酶的表達量的表達量測定試劑；及用于測定所述組織中周期素依賴性激酶活性值的活性測定試劑；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在第一保存條件下保存的試劑構成第一試劑組；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在不同于第一保存條件的第二保存條件下保存的試劑構成第二試劑組。
2.如權利要求1所述的試劑盒，其中所述第一保存條件為冷藏保存，所述第二保存條件為冷凍保存。
3.如權利要求2所述的試劑盒，其中所述第一試劑組包含被標記的周期素依賴性激酶抗體、固定周期素依賴性激酶抗體的載體、所述周期素依賴性激酶的基質、三磷酸腺苷；所述第二試劑組包含能與三磷酸腺苷和所述基質在所述周期素依賴性激酶作用下反應生成的產物結合的標記物。
4.如權利要求3所述的試劑盒，其中所述第一試劑組包括含有固定所述周期素依賴性激酶抗體的載體的柱。
5.如權利要求2～4中任一所述的試劑盒，其中所述第二試劑組包括已知濃度的周期素依賴性激酶。
6.如權利要求5所述的試劑盒，其中所述試劑盒用于組織性質診斷裝置，所述組織性質診斷裝置測定所述組織中的周期素依賴性激酶表達量和活性值，并根據獲得的周期素依賴性激酶表達量和活性值的數據診斷所述組織的性質。
7.如權利要求6所述的試劑盒，其中所述組織性質診斷裝置包括獲取反映所述組織中周期素依賴性激酶表達量的第一數據的第一數據獲取手段、獲取反映所述組織中周期素依賴性激酶活性值的第二數據的第二數據獲取手段以及根據所述第一數據和第二數據得出的值獲取所述組織性質的有關信息的解析手段。
8.一種診斷從患者身上采集的組織的性質的試劑盒，包括用于測定所述組織中第一周期素依賴性激酶表達量的第一表達量測定試劑；用于測定第一周期素依賴性激酶活性值的第一活性測定試劑；用于測定第二周期素依賴性激酶表達量的第二表達量測定試劑；及用于第二周期素依賴性激酶活性值的第二活性測定試劑；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在第一保存條件下保存的試劑構成第一試劑組；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在與第一保存條件不同的第二保存條件下保存的試劑構成第二試劑組。
9.如權利要求8所述的試劑盒，其中所述第一保存條件為冷藏保存，所述第二保存條件為冷凍保存。
10.如權利要求9所述的試劑盒，其中所述第一試劑組包含被第一標記物標記的第一周期素依賴性激酶抗體、被第二標記物標記的第二周期素依賴性激酶抗體、固定第一周期素依賴性激酶抗體的第一載體、固定第二周期素依賴性激酶抗體的第二載體、所述第一周期素依賴性激酶及第二周期素依賴性激酶的基質以及三磷酸腺苷；所述第二試劑組包含能與三磷酸腺苷和所述基質在所述周期素依賴性激酶作用下反應生成的產物結合的第三標記物。
11.如權利要求10所述的試劑盒，其中所述第一試劑組包括含有所述第一載體的第一柱和含有所述第二載體的第二柱。
12.如權利要求9～11中任一所述的試劑盒，其中所述第二試劑組包含已知濃度的第一周期素依賴性激酶和已知濃度的第二周期素依賴性激酶。
13.如權利要求12所述的試劑盒，其中所述試劑盒用于組織性質診斷裝置，所述組織性質診斷裝置測定所述組織中的第一周期素依賴性激酶和第二周期素依賴性激酶的表達量和活性值，根據所得到的第一周期素依賴性激酶及第二周期素依賴性激酶表達量和活性值的數據，診斷哺乳動物組織的性質。
14.如權利要求13所述的試劑盒，其中所述組織性質診斷裝置包括獲取所述第一周期素依賴性激酶表達量的第一表達獲取手段、獲取所述第二周期素依賴性激酶表達量的第二表達獲取手段、獲取所述第一周期素依賴性激酶活性值的第一活性值獲取手段、獲取所述第二周期素依賴性激酶活性值的第二活性值獲取手段以及根據所述第一表達量、第二表達量、第三活性值和第四活性值獲取所述組織性質的有關信息的解析手段。
15.如權利要求2或9所述的試劑盒，其中所述第二試劑組含有已知濃度的蛋白質，該蛋白質被管家基因標記，所述第一試劑組含有所述蛋白質的已標記抗體。
16.如權利要求15所述的試劑盒，其中所述第二試劑組有已知濃度的含哺乳動物細胞的細胞質與核內蛋白質的溶液。
17.如權利要求16所述的試劑盒，其中所述第二試劑組配有組織增溶劑，用于增溶所述組織，配制組織液。
18.如權利要求17所述的試劑盒，其中所述第二試劑組含有已知濃度的周期素依賴性激酶抑制劑，所述第一試劑組含有所述周期素依賴性激酶抑制劑的抗體。
19.如權利要求18所述的試劑盒，其中所述第一試劑組有用于減低背景的含蛋白質試劑。
20.如權利要求19所述的試劑盒，其中所述組織的性質指組織中所含細胞的增殖能、細胞對抗癌藥的敏感性或組織的惡性度。
21.如權利要求20所述的試劑盒，其中所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在不同于第一和第二保存條件的第三保存條件下保存的試劑構成第三試劑組。
22.如權利要求21描述的試劑盒，其中所述第三保存條件是常溫保存。
全文摘要
本發明提供一種用于診斷從患者身上采集的組織的性質的試劑盒，包括用于測定所述組織中周期素依賴性激酶的表達量的表達量測定試劑；及用于測定所述組織中周期素依賴性激酶活性值的活性測定試劑；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在第一保存條件下保存的試劑構成第一試劑組；所述表達量測定試劑和活性測定試劑中在不同于第一保存條件的第二保存條件下保存的試劑構成第二試劑組。
文檔編號G01N33/543GK1971276SQ20061014106
公開日2007年5月30日 申請日期2006年9月28日 優先權日2005年9月30日
發明者石原英幹, 中山智, 川崎由子, 片山彩 申請人:希森美康株式會社