基于蛋白結合的fv文庫及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明設及構建基于蛋白結合的Fv文庫的方法，用所述構建的Fv文庫篩選需要 的抗體的方法，通過所述篩選方法篩選的Fv抗體，W及通過所述Fv文庫構建方法構建的Fv 文庫。
【背景技術】
[0002] 抗體是通過免疫系統的B-淋己細胞應答抗原、識別抗原和結合抗原所產生的蛋 白。該類抗體被視為新的用于治療疾病的蛋白質藥物候選物。為了發現所需的功能性抗體， 構建了各種抗體文庫，并從抗體文庫中篩選功能性抗體。使用基因重組技術構建該類抗體 文庫。具體地說，從人體的B-細胞中提取編碼抗體蛋白的基因W構建抗體基因文庫，從文 庫中篩選具有所需抗原結合特異性的抗體。抗體文庫技術為構建諸如人類抗體的抗體帶來 了革命。如果抗原是不同于體內成分的外來物質，抗體免疫應答最突出的特征是在一周內 抗體能特異性地與一種抗原或一種形態的抗原結合。抗體由B-淋己細胞產生，一種單一的 B淋己細胞只產生一種類型的抗體。事實上，已知人體中存在無數的B淋己細胞，每個B淋己 細胞表達在細胞膜上具有獨特抗原結合特異性的抗體。通常已知在人體中大約有1〇8種抗 原結合多樣性存在。當抗原侵入身體時，只有表達特異性結合該抗原的抗體的B淋己細胞 快速增殖從而產生大量的抗體，因此，血清中抗體的濃度快速增加從而迅速地清除入侵的 抗原，因此，在人體中抗體多樣性數W萬計，該種抗體多樣性被稱為抗體譜（repertoire)。 因此，當從人體通過血液收集到足夠數量的B淋己細胞之后，從細胞中分離mRNA并通過 RT-PCR(反轉錄酶-聚合酶鏈反應）合成編碼抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的cDNA，能 W相對簡單的方式在體外構建基因形式的人類抗體譜。抗體文庫技術的關鍵是當通過任何 介質（基因型-表型連接）拼接結合（paring)編碼該抗體蛋白的基因時，都能將該種人類 抗體基因譜表達（或展示）為蛋白，從而測試從抗體文庫中篩選的與特定抗原結合的抗體 并獲得編碼特異性抗體的基因。在此，不需要完全免疫，抗體譜或W具有抗原結合功能的抗 體的Fab展示，或W名為scFv(單鏈可變片段）的抗體片段展示，所述scFv的重鏈可變區 和輕鏈可變區（Vh和VJ通過大概15個氨基酸的短膚接頭相互連接。在此，根據用于基因 型-表型連接介質的類型，將所述展示分為瞻菌體展示、核糖體展示、酵母展示等等，并且 不用通過給予抗原誘導的免疫應答就能獲得具有所需的抗原結合特征的抗體。然而，抗體 文庫構建和抗體篩選所需的很多訣資存在缺點，獲得高親和力抗體不容易，因此抗體篩選 后頻繁地進行諸如親和力成熟的抗體優化步驟，因為諸如毒性問題不能進行哺乳動物細胞 中的功能性分析，特別是在第一步篩選中。因為治療性抗體不是簡單地結合抗原還應該有 治療功能，此缺點成為治療性抗體開發的障礙。
[0003] 在抗體文庫中，最頻繁使用的是瞻菌體展示抗體文庫。實際上，阿達木單抗 (Humira)(抗-TNF-alpha人單克隆抗體）是通過瞻菌體展示技術制備的治療性抗體，所述 阿達木單抗是目前商業上可購買的類風濕性關節炎治療制劑。理想的抗體文庫包括巨大的 抗體多樣性，因此具有所需的抗原結合特異性的高親和性抗體克隆可W從其中篩選。為了 該個目的，應該構建具有大約l〇W-l〇ii抗體文庫的庫。然而，通過抗體基因克隆構建具有該 個規模的文庫很困難，被看做是瞻菌體展示抗體文庫構建中最困難的問題。此外，因為瞻菌 體本身表現毒性，存在由于功能性分析不能直接進行的缺點。核糖體展示技術最大的優勢 是無細胞系統，因此理論上，能通過核糖體展示技術容易地構建具有10"大容量的文庫。因 此，核糖體展示技術有利于篩選高親和力抗體（通常，抗體文庫容量越大，文庫中包括的高 親和力抗體的可能性越大）。此外，因為在核糖體展示技術進行PCR擴增，能使用易于出錯 的聚合酶等等，因此很容易引入人工誘導的突變。然而，核糖體展示技術也有毒性問題和不 同的實驗問題。為此，瞻菌體展示技術主要用于原初起源（naiveorigin)的抗體文庫的構 建。在酵母展示技術中，因為需要將重組載體插入釀酒酵母（S.cerevisiae)菌株的過程并 且酵母細胞的細胞大，制備具有1〇9或更多多樣性的抗體文庫有許多的技術限制。因此，酵 母展示技術主要用于構建已建立的抗原特異性的抗體的突變文庫和用于從突變文庫中篩 選高親和力抗體。
[0004] 然而，在該些抗體文庫中，所有抗體沒有單獨地分開，而是混合在一起。該些抗體 文庫在篩選針對基于其功能（活性）的目標抗原的抗體有局限但不是不可能，只有篩選基 于與抗體結合的抗體有可能。在隨后步驟中檢查該個過程獲得的起始抗體候選物的功能 來選擇具有功能的抗體。大部分情況下，在選擇步驟中獲得能容易結合但不具有功能的抗 體。因此，需要新的方法克服篩選方法的局限。換句話說，需要從一開始就基于抗體的功 能來篩選抗體的方法。然而，現有文庫處在不同抗體混合在一起的狀態，不可能基于抗體 的功能篩選單個抗體。因此，在特別分離的文庫中，類似于低分子量化合物文庫，如果有可 能單個地純化和儲存所有抗體，則有可能基于抗體功能篩選抗體。然而，因為抗體是蛋白 質，需要表達并純化抗體的過程，因此，實際上不可能構建100, 000或1，000, 000種不同 抗體的文庫。換句話說，傳統方法的缺點在于，由于當文庫多樣性被假定為1，000, 000,就 需要純化1，000, 000種蛋白質，隨著多樣性的增加，所需蛋白質純化的個數呈指數增加。 傳統文庫構建技術包括通過在DNA水平在載體中結合Vh和Vj勾建文庫的技術扣.S.Pat No. 8, 178, 320)，在DM水平構建抗體輕鏈和重鏈的文庫技術扣.S.PatNo. 7, 858, 559)等 等。然而，該些文庫構建技術的缺陷在于；要純化所需數量的蛋白質W構建具有在DM水平 滿足蛋白結合的多樣性的文庫，由于抗體的幾何級數，不能立即分析在構建的文庫中的抗 體的功能，為此，需要減少抗體數目的附加步驟，所述抗體能通過結合抗原來篩選并分析它 們的功能。在篩選過程中，會丟失真正重要的抗體。特別是，在傳統文庫構造方法中，Fv應 在DNA水平組合表達，因此，需要與文庫多樣性相對應的蛋白質純化。因此，在傳統文庫構 建方法中，不可能構建一個包括單個地分開的抗體的文庫。
[0005] 在該種情況下，本發明人開展大量的工作來開發將抗體單個地分開從而能功能性 地篩選它們的文庫。因此，本發明人關注文庫的構建，不同于傳統文庫構建中在DNA水平結 合抗體結構域的技術，而是在蛋白質水平發生結合，并發現在蛋白質水平通過結合Vh和VL 能構建基于蛋白結合的Fv文庫，從而完成本發明。

【發明內容】

[0006] 本發明的一個目的是提供一種基于蛋白結合構建Fv(可變片段）文庫的方法。
[0007] 本發明的另一個目的是提供一種通過上述基于蛋白結合構建Fv文庫的方法所構 建的Fv文庫篩選所需抗體的方法。
[000引本發明的又一個目的是提供通過上述篩選方法篩選的所需Fv抗體。
[0009] 本發明的再另一目的是提供通過上述基于蛋白結合構建Fv文庫的方法構建的Fv 文庫。
[0010] 為了實現上述目的，一方面，本發明提供基于蛋白結合的Fv(可變片段）文庫和構 建該Fv文庫的方法。
[0011] 更具體地說，本發明提供基于蛋白結合的Fv文庫，所述Fv文庫包括與V苗吉構域 蛋白連接的Vh結構域蛋白。
[0012] 本發明也提供基于蛋白結合構建Fv文庫的方法。該方法包括步驟；(a)制備重鏈 可變區（Vh)結構域蛋白和輕鏈可變區（W結構域蛋白；和化）將步驟（a)制備的Vh結構 域蛋白和V苗吉構域蛋白相互拼接結合（paring)。
【附圖說明】
[0013] 圖1示意性示出融合蛋白，每個融合蛋白包括祀標-LPETG-連接膚（linker)(具 有任何一種不同長度）-轉膚酶-組氨酸標簽。（A);由7個氨基酸組成的連接膚，炬）：由 18個氨基酸組成的連接膚，（C):由20個氨基酸組成的連接膚。
[0014] 圖2示意性示出通過配對結合來連接W構建根據本發明的基于蛋白結合的Fv文 庫。（A);野生型之間的配對結合；炬）：通過二硫鍵的配對；和（C)通過卷曲螺旋的配對。
[0015] 圖3示意性示出簡單的蛋白質純化過程。
[0016] 圖4示出純化的Vl和VH突變體的SDS-PAGE結果。
[0017] 圖5示出為無Flag標簽的Vh結構域蛋白Vh-G44C的表達、在N-端具有Flag標簽 的Flag-VH-G44C的表達、在N-端和C-端具有Flag標簽的Flag-VH-G44C-Flag蛋白的表 達，其隨著Flag標簽的存在而增加。
[001引圖6示出存在和不存在轉膚酶W及存在和不存在Flag的情況下，重組蛋白的表達 和純化產率的對比。
[0019] 圖7是示出分析通過配對而連接的Vh-Vl的方法的示意圖。
[0020] 圖8示出分析Vh-VJS對的ELISA結果。
[002U圖9示出分析Flag-Va和Flag-VL配對的化ISA結果。
[002引圖10示出引入半脫氨酸突變的Vh-VJS對的SDS-PA(iE結果。
[002引 圖11示出SDS-PAGE結果，表明Flag-Va和Flag-VL的配對增加VH和VL的配對。
[0024]圖 12 示出Vl-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和組裝的Fv的沈C-HPLC結果。
[002引 圖13示出V。Vh和組裝的Fv野生型的MLDI-TOF分析結果。
[0026]圖14示出V廣Q100C、Flag-VH-G44C-Flag和組裝的Fv的MALDI-TOF分析結果。
[0027]圖 15 示出VL-IAALK3、Flag-VH-IAALE3-Flag和組裝的Fv的MALDI-TOF分析結果。
[0028] 圖16示出通過CCK8測定法值oj jindo)分析4D5Fv抗體對BT-474增殖的影響的 結果。
[0029] 圖17示出通過FACS監測4D5IgG、VH結構域、VL結構域和組裝的Fv抗體與BT-474細 胞的化r2-表達細胞表面結合特征的結果。
[0030] 圖18示出根據氨基酸殘基的長度分布用于CDR設計的VhCDR3和V術DR3的選擇 方案。
[0031] 圖19示出引入Vh CDR和Vl CDR多樣性的高頻分析結果。
[0032] 圖20示出根據本發明的實施例而設計出具有多樣性的文庫的結果。
[003引 圖21示出通過5Vh與5V L結合構建的25F V的SEC-HPLC分析結果。
[0034] 圖22示出通過4D5Vh與5個合成V為合制備的組裝的Fv的FACS和沈C-HPLC分 析結果。
[0035] 圖23示出文庫篩選過程。
[0036] 圖24示出通過alpha測定法篩選單個Fv和10種混合抗原的相互作用的結果。
[0037] 圖25示出將與混合抗原結合的Fv和單個抗原的相互結合進行第二次篩選的結 果。
[003引圖26是示出主要與CSF1R結合的Fv的alpha測定法結果圖。
[0039] 圖27示出在alpha測定法中被確認主要與CSF1R結合的Fv的相互作用的化ISA 結果。
[0040] 圖28示出在al地a測定法中被確認主要與CSF1R結合的Fv的相互作用的Western 印跡結果。
[0041] 圖29是示出主要與C-MET結合的Fv的alpha測定法結果圖。
[00創圖30示出在alpha測定法中被確認主要與CSF1R結合的Fv的相互作用的化ISA 結果。