雙功能適配體檢測試劑盒以及檢測方法
【專利摘要】本發明涉及一種能夠同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測的雙功能適配體檢測試劑盒以及檢測方法。這種雙功能適配體檢測方法，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時存在的情況下，會由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結構的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端的胸腺嘧啶的錯配和胞嘧啶的錯配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴增，被第一DNA切割酶的切割形成的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導致第一探針序列和第二探針序列分別被第二DNA切割酶和第三DNA切割酶切割，最終第一熒光團和第二熒光團被暴露出來，通過熒光檢測同時對在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進行檢測。
【專利說明】雙功能適配體檢測試劑盒以及檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及環境分析和食品安全領域，特別是涉及一種能夠同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測的雙功能適配體檢測試劑盒以及檢測方法。
【背景技術】
[0002]汞和銀是兩種很常見的重金屬，被廣泛應用于制藥，電池和攝影工業等領域。但當這些產品的副產物或在使用廢棄后，部分重金屬最終將以離子形式進入環境，對水體和土壤造成了嚴重的污染。汞離子對動植物和人體健康都有很大的影響，長期暴露在含汞離子的環境中會導致中樞神經系統以及其它器官的永久性的傷害。銀離子的直接毒性相對較小，但它能夠在水生生物中產生很強的富集作用，從而通過食物鏈的方式進入人體內，使之成為具有高危害的重金屬元素之一。
[0003]現有的Hg2+和Ag+檢測技術包括原子吸收光譜，ICP-MS，有機熒光分子和適配體法等。其中，原子吸收光譜法是傳統的分析方法，測試時將樣品通過適當的方法溶解，使所含的汞全部轉化為Hg2+，然后用還原劑將Hg2+還原成汞蒸氣，導入測汞儀中進行測定；ICP-MS法的樣品前處理過程與原子吸收光譜類似，首先需要將樣品中的汞溶解以轉化成離子狀態，經過消解作用后，將樣品注入進質譜儀中進行測定；有機熒光分子法是通過化學合成的方法產生一種特殊基團，此基團能夠特異性地與重金屬離子發生反應，從而造成結構上的改變而增強或淬滅熒光，最后利用熒光強度的變化達到檢測的目的。適配體法是近年發展了一種新方法，具有高靈敏度和特異性，其主要是利用胸腺嘧啶(T)與胞嘧啶(C)分別與Hg2+和Ag+形成兩種特殊的配對結構，即T-Hg2+-T與C-Ag+-C,從而設計出相應的生物傳感器來進行分析重金屬離子。
[0004]適配體法以其靈敏度和特異性受到很多關注，通過復合結構發展了多種金屬離子的分析方法，如熒光，電化學，比色和拉曼法等。但這些方法只能局限于檢測一種金屬離子(Hg2+或Ag+)，不能同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子的檢測。

【發明內容】

[0005]基于此，有必要提供一種能夠同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測的雙功能適配體檢測試劑盒以及檢測方法。
[0006]一種雙功能適配體檢測試劑盒，用于同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測，包括: [0007]第一模版DNA和第二模版DNA，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補配對的15個堿基，并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配，所述胸腺嘧啶的錯配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配對結構，從而使得雜交后的所述第一模版DNA的3’末端能夠以所述第二模版DNA的5’端為模版擴增，所述胞嘧啶的錯配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配對結構，從而使得雜交后的所述第二模版DNA的3’末端能夠以所述第一模版DNA的5’端為模版擴增；
[0008]DNA聚合酶和第一 DNA切割酶，所述第一 DNA切割酶可以對擴增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還可以對擴增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第二寡核苷酸；
[0009]第一熒光團淬滅團探針和第二熒光團淬滅團探針，所述第一熒光團淬滅團探針包括第一探針序列和結合在所述第一探針序列上的第一熒光團和第一淬滅團，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團和所述第一淬滅團發生淬滅反應，所述第二熒光團淬滅團探針包括第二探針序列和結合在所述第二探針序列上的第二熒光團和第二淬滅團，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團和所述第二淬滅團發生淬滅反應，所述第一熒光團和所述第二熒光團不同；
[0010]第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶和dNTPs，所述第二 DNA切割酶可以對雜交后的所述第一探針序列進行剪切并且剪切后所述第一熒光團和所述第一淬滅團分離，所述第三DNA切割酶可以對雜交后的所述第二探針序列進行剪切并且剪切后所述第二熒光團和所述第二淬滅團分離。
[0011 ] 在一個實施例中，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
[0012]在一個實施例中，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
[0013]在一個實施例中，所述第一熒光團為羧基熒光素，所述第二熒光團為四甲基羅丹明。
[0014]在一個實施例中，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI，所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
[0015]一種雙功能適配體檢測方法，用于同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測，包括如下步驟:
[0016]將待測樣品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后發生雜交反應得到雜交液，其中，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補配對的15個堿基,并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配；
[0017]向所述雜交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶發生寡核苷酸鏈置換擴增反應，得到寡核苷酸擴增液，其中，胸腺嘧啶的錯配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配對結構，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端為模版擴增，胞嘧啶的錯配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配對結構，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端為模版擴增，所述第一 DNA切割酶對擴增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的·互補序列進行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還對擴增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第二寡核苷酸；
[0018]向所述寡核苷酸擴增液中加入第一熒光團淬滅團探針、第二熒光團淬滅團探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發生雙功能熒光擴增反應，得到熒光檢測液，其中，所述第一熒光團淬滅團探針包括第一探針序列和結合在所述第一探針序列上的第一熒光團和第一淬滅團，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團和所述第一淬滅團發生淬滅反應，所述第二熒光團淬滅團探針包括第二探針序列和結合在所述第二探針序列上的第二熒光團和第二淬滅團，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團和所述第二淬滅團發生淬滅反應，所述第一熒光團和所述第二熒光團不同，所述第二 DNA切割酶對雜交后的所述第一探針序列進行剪切并且剪切后所述第一熒光團和所述第一淬滅團分離，所述第三DNA切割酶對雜交后的所述第二探針序列進行剪切并且剪切后所述第二熒光團和所述第二淬滅團分離；
[0019]對所述熒光檢測液進行熒光檢測，完成所述雙功能適配體檢測方法。
[0020]在一個實施例中，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
[0021]在一個實施例中，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
[0022]在一個實施例中，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI，所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
[0023]在一個實施例中，向所述寡核苷酸擴增液中加入第一熒光團淬滅團探針、第二熒光團淬滅團探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發生雙功能熒光擴增反應的操作中，還需要向其中加入牛血清白蛋白。
[0024]這種雙功能適配體檢測方法，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時存在的情況下，會由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結構的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴增，接著通過第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導致第一探針序列和第二探`針序列分別被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最終第一熒光團和第二熒光團被暴露出來，通過檢測熒光檢測液的熒光，可以同時對在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進行檢測。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為一實施方式的雙功能適配體檢測方法的原理圖；
[0026]圖2為如圖1所示的雙功能適配體檢測方法的流程圖；
[0027]圖3為寡核苷酸鏈置換擴增反應得到的寡核苷酸擴增液的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳結果圖；
[0028]圖4A為不同濃度Hg2+的熒光光譜曲線；
[0029]圖4B為如圖4A所示的熒光光譜曲線以520nm處的熒光強度作為縱坐標，Hg2+濃度的對數值的橫坐標擬合曲線；
[0030]圖5A為不同濃度Ag+的熒光光譜曲線；
[0031]圖5B為如圖5A所示的熒光光譜曲線以582nm處的熒光強度作為縱坐標，Ag+濃度的對數值的橫坐標擬合曲線；[0032]圖6為雙功能適配體檢測方法的特異性實驗的熒光分析圖。
【具體實施方式】
[0033]為使本發明的上述目的、特征和優點能夠更加明顯易懂，下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】做詳細的說明。在下面的描述中闡述了很多具體細節以便于充分理解本發明。但是本發明能夠以很多不同于在此描述的其它方式來實施，本領域技術人員可以在不違背本發明內涵的情況下做類似改進，因此本發明不受下面公開的具體實施的限制。
[0034]一實施方式的雙功能適配體檢測試劑盒，用于同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測，包括:
[0035]第一模版DNA、第二模版DNA、DNA聚合酶、第一 DNA切割酶、第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶、dNTPs、第一熒光團淬滅團探針和第二熒光團淬滅團探針。
[0036]第一模版DNA中含有與第二模版DNA互補配對的15個堿基,并且第一模版DNA和第二模版DNA通過該15個堿基形成雜交后第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶(T)的錯配和3個胞嘧啶(C)的錯配。
[0037]胸腺嘧啶(T)的錯配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配對結構，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端能夠以第二模版DNA的5’端為模版擴增。當Hg2+不存在時，由于3個胸腺嘧啶(T)的錯配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端不能夠以第二模版DNA的5’端為模版擴增。
[0038]胞嘧啶(C)的錯配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配對結構，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端能夠以第一模版DNA的5’端為模版擴增。當Ag+不存在時，由于3個胞嘧啶(C)的錯配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端不能夠以第一模版DNA的5’端為模版擴增。
[0039]第一 DNA切割酶可以對擴增出來的第一模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第一寡核苷酸，并且第一 DNA切割酶還可以對擴增出來的第二模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第二寡核苷酸。
[0040]第一熒光團淬滅團探針包括第一探針序列和結合在第一探針序列上的第一熒光團和第一淬滅團，第一探針序列可以與第一寡核苷酸雜交，第一熒光團和第一淬滅團發生淬滅反應。
[0041]第二熒光團淬滅團探針包括第二探針序列和結合在第二探針序列上的第二熒光團和第二淬滅團，第二探針序列可以與第二寡核苷酸雜交，第二熒光團和第二淬滅團發生淬滅反應。
[0042]本實施方式中，第一熒光團淬滅團探針和第二熒光團淬滅團探針由探針合成公司“寶生物工程(大連)”制作。
[0043]本實施方式中，第一熒光團為FAM (羧基熒光素)，第二熒光團為TAMRA (四甲基羅丹明X 第一淬滅團為 EclipseCEclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.),第二淬滅團為 Eclipse (Eclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.X
[0044]本實施方式中，第一突光團和第二突光團不同。
[0045]第二 DNA切割酶識別雙鏈DNA，可以對雜交后的第一探針序列進行剪切并且剪切后第一突光團和第一淬滅團分離，從而第一突光團活化可以發出突光。[0046]第三DNA切割酶識別雙鏈DNA，可以對雜交后的第二探針序列進行剪切并且剪切后第二熒光團和第二淬滅團分離，從而第二熒光團活化可以發出熒光。
[0047]這種雙功能適配體檢測試劑盒，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時存在的情況下，會由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結構的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴增，接著通過第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導致第一探針序列和第二探針序列分別被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最終第一熒光團和第二熒光團被暴露出來，通過熒光檢測，可以同時對在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進行檢測。
[0048]本實施方式中，第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ IDN0.2所示的序列。
[0049]本實施方式中，第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二探針序列為SEQ IDN0.4所示的序列。
[0050]DNA聚合酶可以為DNA聚合酶Klenow fragment，第一 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶可以為DNA切割酶 Nt.AlwI。
[0051]下面結合圖1和圖2，提供一實施方式的采用上述雙功能適配體檢測試劑盒的一種雙功能適配體檢測方法，用于同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測，包括如下步驟:
[0052]S10、將待測樣品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后發生雜交反應得到雜交液。
[0053]SlO中使用的緩沖液為第一反應緩沖液，其中，IOX第一反應緩沖液(0.2摩爾每升的三氨基甲烷醋酸，PH7.9,0.1摩爾每升的醋酸鎂，0.5摩爾每升的醋酸鉀，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)。`
[0054]第一模版DNA中含有與第二模版DNA互補配對的15個堿基,并且第一模版DNA和第二模版DNA通過15個堿基形成雜交后第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配。
[0055]本實施方式中，第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ IDN0.2所示的序列。
[0056]S20、向SlO得到的雜交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶發生寡核苷酸鏈置換擴增反應，得到含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的寡核苷酸擴增液。
[0057]胸腺嘧啶(T)的錯配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配對結構，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端為模版擴增。當Hg2+不存在時，由于3個胸腺嘧啶(T)的錯配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端不能夠以第二模版DNA的5’端為模版擴增。
[0058]胞嘧啶(C)的錯配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配對結構，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端為模版擴增。當Ag+不存在時，由于3個胞嘧啶(C)的錯配形成阻斷作用，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端不能夠以第一模版DNA的5’端為模版擴增。
[0059]第一 DNA切割酶對擴增出來的第一模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第一寡核苷酸，并且第一 DNA切割酶還對擴增出來的第二模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第二寡核苷酸。
[0060]S30、向S20得到的寡核苷酸擴增液中加入第一熒光團淬滅團探針、第二熒光團淬滅團探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發生雙功能熒光擴增反應，得到熒光檢測液。
[0061]S30中使用的緩沖液為第二反應緩沖液，其中，IOX第二反應緩沖液(0.1摩爾每升的三氨基甲烷鹽酸，PH7.9,0.1摩爾每升的氯化鎂，0.5摩爾每升的氯化鈉，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)。
[0062]一般而言，S30中進行雙功能熒光擴增反應時，還需要加入牛血清白蛋白。
[0063]牛血清白蛋白的作用是為了輔助第二 DNA切割酶。
[0064]第一熒光團淬滅團探針包括第一探針序列和結合在第一探針序列上的第一熒光團和第一淬滅團，第一探針序列可以與第一寡核苷酸雜交，第一熒光團和第一淬滅團發生淬滅反應。
[0065]第二熒光團淬滅團探針包括第二探針序列和結合在第二探針序列上的第二熒光團和第二淬滅團，第二探針序列可以與第二寡核苷酸雜交 ，第二熒光團和第二淬滅團發生淬滅反應。
[0066]本實施方式中，第一突光團和第二突光團不同。
[0067]本實施方式中，第一熒光團淬滅團探針和第二熒光團淬滅團探針由探針合成公司“寶生物工程(大連)”制作。
[0068]本實施方式中，第一熒光團為FAM (羧基熒光素)，第二熒光團為TAMRA (四甲基羅丹明X 第一淬滅團為 EclipseCEclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.),第二淬滅團為 Eclipse (Eclipse are trademarks of Epoch Biosciences, Inc.X
[0069]第二 DNA切割酶識別雙鏈DNA，可以對雜交后的第一探針序列進行剪切并且剪切后第一突光團和第一淬滅團分離，從而第一突光團活化可以發出突光。
[0070]第三DNA切割酶識別雙鏈DNA，可以對雜交后的第二探針序列進行剪切并且剪切后第二熒光團和第二淬滅團分離，從而第二熒光團活化可以發出熒光。
[0071]本實施方式中，第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二探針序列為SEQ IDN0.4所示的序列。
[0072]DNA聚合酶可以為DNA聚合酶Klenow fragment，第一 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶可以為DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶可以為DNA切割酶 Nt.AlwI。
[0073]S40、對S30得到的熒光檢測液進行熒光檢測，完成雙功能適配體檢測方法。
[0074]由于第一突光團和第二突光團不同，第一突光團和第二突光團活化后發出的突光也不同。
[0075]通過對熒光檢測液進行熒光檢測，分析具體檢測得到的熒光波長和熒光強度，可以對Hg2+和Ag+兩種金屬離子進行定性和定量分析。
[0076]這種雙功能適配體檢測方法，在Hg2+和Ag+兩種金屬離子同時存在的情況下，會由于T-Hg2+-T與C-Ag+-C結構的形成，使得第一模版DNA的3’端以及第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配分別形成連接，從而使得雜交在一起的第一模版DNA和第二模版DNA能夠被擴增，接著通過第一 DNA切割酶的切割形成第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸分別與第一探針序列和第二探針序列雜交，從而導致第一探針序列和第二探針序列分別被第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶切害I]，最終第一熒光團和第二熒光團被暴露出來，通過檢測熒光檢測液的熒光，可以同時對在Hg2+和Ag+兩種金屬離子進行檢測。
[0077]這種雙功能適配體檢測方法還具有如下優點:
[0078]擴增效率高，通過將兩步雙功能擴增方式串聯起來，大大提高了擴增效率，極大地提聞了檢測靈敏度；
[0079]特異性強，通過T-Hg2+-T與C-Ag+-C結構，大大增強了檢測的特異性；
[0080]適用于實際樣品檢測，在實際樣品檢測時不需要復雜的前處理步驟，而且在自來水樣檢測中未發現任何的基質干擾效應，在實測中具有良好的應用前景。
[0081]下面為具體實施例。實施例中第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列，第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，第二探針序列為SEQ ID N0.4所不的序列，DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI，第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI，第一熒光團淬滅團探針和第二熒光團淬滅團探針由探針合成公司“寶生物工程(大連)”制作，第一熒光團為FAM，第二熒光團為TAMRA。第一淬滅團為Eclipse，第二淬滅團為Eclipse。
[0082]實施例1
[0083]試劑準備:分別準備以下濃度的試劑:1微摩爾每升的第一模版DNA，I微摩爾每升的第二模版DNA，2.5毫摩爾每升的dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)，IOX第一反應緩沖液(0.2摩爾每升的三氨基甲烷醋酸，pH7.9，0.1摩爾每升的醋酸鎂，0.5摩爾每升的醋酸鉀，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)，IOX反應緩沖液2 (0.1摩爾每升的三氨基甲烷鹽酸，PH7.9,0.1摩爾每升的氯化鎂，0.5摩爾每升的氯化鈉，0.01摩爾每升的二硫蘇糖醇)，10單位每微升的DNA切割酶Nb.BbvC1、Nb.BtsI和Nt.AlwI，5單位每微升DNA聚合酶Klenowfragment (3，-5’ exo_), 100XBSA(牛血清蛋白，10mg/mL), 100微摩爾每升的第一突光團淬滅團探針(QF probe-Ι)和第二熒光團淬滅團探針(QF probe-2)，無菌水以及不同濃度的汞離子和銀離子。
[0084]雙功能擴增反應:將反應溶液分為A液、B液、C液和D液，總體積為50微升。其中A液包含0.25微升第一模版DNA、0.25微升第二模版DNA、I微升dNTPs(四種脫氧核糖核苷酸的混合物)、1微升IOX第一反應緩沖液、I微升目標金屬離子(Hg2+或Ag+)和6微升無菌水；B液包含0.3 微升DNA切割酶Nb.BbvCI>0.2 微升DNA聚合酶Klenow fragment (3’-5’exo_)；C液包含0.125微升QF probe-Ι和0.3微升QF probe-2,5微升IOX第二反應緩沖液、33.875微升(或33.7微升)的無菌水；D液包含0.5微升DNA切割酶Nb.BtsI和I微升DNA切割酶Nt.AlwI以及0.5微升BSA (牛血清蛋白，10mg/mL)。A液首先在95°C下孵育3分鐘，然后冷卻至37°C，再加入B液，使二者在37°C下反應60分鐘，再與C液混合后于37°C下反應15分鐘，接著加入D液在37°C下反應45分鐘，最后可通過熒光儀收集信號。
[0085]擴增原理結合圖1:第一步是第一模版DNA和第二模版DNA發生雜交反應，兩者之間有15個堿基互補，但是在3端處各有三個堿基錯配，分別是三個胸腺嘧啶和三個胞嘧啶。第二步是寡核苷酸鏈置換·擴增反應，當加入Hg2+和Ag+時，模板鏈3端的錯配堿基發生結合，形成T-Hg2+-T與C-Ag+-C的復合結構，這就為擴增反應提供了條件。如果不存在Hg2+和Ag+，則會由于3端的錯配導致擴增反應不能啟動。此后，在DNA聚合酶Klenowfragment (3’ -5’ exo_)和dNTPs (四種脫氧核糖核苷酸的混合物)的作用下，以第一模版DNA和第二模版DNA為擴增模板進行延伸，從而形成完整的雙鏈結構。隨后DNA切割酶Nb.BbvCI識別雙鏈結構的切刻酶識別位點(該切刻酶僅識別雙鏈結構)，并在該位點的下游第2個堿基處對新合成鏈進行切刻，這就產生了新的聚合酶復制位點。該位點可由聚合酶Klenow fragment (3? -5’ exo_)再次延伸，同時其鏈置換活力可將切刻后的下游寡核苷酸片段置換出來，而再次延伸后的序列又可被切刻酶Nb.BbvCI切刻，繼而再被聚合酶Klenowfragment (3’ -5’ exo_)延伸，這種反復的延伸和切刻循環即構成了鏈置換擴增反應,它能夠擴增產生大量的短的寡核苷酸片段。而且，此種雙功能模板能夠同時產生兩種不同序列的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸。第三步是雙功能熒光擴增反應，產生的寡核苷酸片段可分別同QF probe-Ι和QF probe-2探針 雜交結合。由于形成的雙鏈含有相應的識別位點，能夠分別被切刻酶Nb.BtsI和Nt.AlwI切割，導致QF probe-Ι和QF probe-2探針被切割成兩段，使得熒光團與淬滅團發生分離，從而產生強的熒光信號。此時寡核苷酸片段又能從雙鏈結構中分離出來，與新的未被切斷的QF probe探針結合,這樣就形成了一個切割-分離-雜交的循環中，熒光信號得到很大程度的增強。而且QF probe-Ι和QF ριχΛθ_2探針具有不同的熒光團，所以能夠產生不同發射波長的熒光，進而達到雙功能熒光擴增的目的。
[0086]實施例2
[0087]寡核苷酸鏈置換擴增反應驗證實驗.。
[0088]采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析對寡核苷酸鏈置換擴增反應進行驗證。
[0089]其結果如圖3所示，在不存在Hg2+和Ag+的情況下，即對照管電泳道(control道)未發現任何擴增的條帶；在僅存在Hg2+或Ag+的情況下，在其電泳道的20bp往下處能夠發現明顯的寡核苷酸目標條帶，這說明鏈取代擴增反應已經成功實現。在同時存在Hg2+和Ag+的情況下，寡核苷酸目標條帶也能夠明顯的被觀察到，而且其條帶明顯比單獨存在一種金屬離子時要亮，這說明在兩種金屬離子同時存在下時，成功擴增出兩種不同的寡核苷酸。總之，整個雙功能鏈取代擴增反應能夠很好地區分目標信號與對照信號，可行性非常好。
[0090]靈敏度實驗。
[0091]通過不同濃度的Hg2+和Ag+進行了檢測分析，驗證測試方法的靈敏度，結果如圖4A、圖4B、圖5A和圖5B所示。圖4A顯示了不同濃度Hg2+的熒光光譜曲線，表明該技術方案對不同濃度的Hg2+具有很好的區分度。為了評估其定量分析能力，我們采用520nm處的熒光強度作為縱坐標，Hg2+濃度的對數值為橫坐標擬合曲線，得到圖4B。圖4B呈現出良好的線性關系，其線性方程為F=-43.32+110.881og10C (相關系數為0.9958)，經過計算，該技術方案的檢測限可達到1.93皮摩爾每升。
[0092]圖5A顯示的是不同濃度Ag+的熒光光譜曲線，從圖中可以看出不同濃度下的熒光曲線具有很明顯的區分度。為了定量分析研究，我們采用582nm處的熒光強度為縱坐標，Ag+濃度的對數值為橫坐標擬合曲線，得到圖5B。圖5B表現出良好的線性關系，其線性方程為F=-63.56+91.331og10C (相關系數為0.9967)，經過計算，該技術方案的檢測限可達到15.80
皮摩爾每升。
[0093]因此這種測試方法在Hg2+和Ag+方面都具有很高的檢測靈敏度。[0094]特異性實驗和實際水樣分析。
[0095]為了評估Hg2+和Ag+的特異性，選用了 7種其他金屬離子(Cu2+，Ca2+，Cd2+，Fe3+，Pb2+，Mn2+，Zn2+)進行了檢測分析，檢測結果如圖6所示。
[0096]由圖6可以看出，在Hg2+和Ag+處具有強的熒光信號，而另外七種金屬離子則只具有微弱的熒光強度，表明該技術方案的特異性非常好。
[0097]此外，采用該檢測方法應用于實際水樣的檢測，該實際樣本為自來水。結果如表1所示。
[0098]
【權利要求】
1.一種雙功能適配體檢測試劑盒，用于同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測，其特征在于，包括: 第一模版DNA和第二模版DNA，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補配對的15個堿基，并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配，所述胸腺嘧啶的錯配在Hg2+的存在下，可以形成T-Hg2+-T的特殊配對結構，從而使得雜交后的所述第一模版DNA的3’末端能夠以所述第二模版DNA的5’端為模版擴增，所述胞嘧啶的錯配在Ag+的存在下，可以形成C-Ag+-C的特殊配對結構，從而使得雜交后的所述第二模版DNA的3’末端能夠以所述第一模版DNA的5’端為模版擴增； DNA聚合酶和第一 DNA切割酶，所述第一 DNA切割酶可以對擴增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還可以對擴增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第二寡核苷酸； 第一熒光團淬滅團探針和第二熒光團淬滅團探針，所述第一熒光團淬滅團探針包括第一探針序列和結合在所述第一探針序列上的第一熒光團和第一淬滅團，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團和所述第一淬滅團發生淬滅反應，所述第二熒光團淬滅團探針包括第二探針序列和結合在所述第二探針序列上的第二熒光團和第二淬滅團，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團和所述第二淬滅團發生淬滅反應，所述第一熒光團和所述第二熒光團不同； 第二 DNA切割酶、第三DNA切割酶和dNTPs，所述第二 DNA切割酶可以對雜交后的所述第一探針序列進行剪切并且剪切后所述第一熒光團和所述第一淬滅團分離，所述第三DNA切割酶可以對雜交后的所述第二探針序列進行剪切并且剪切后所述第二熒光團和所述第二淬滅團分離。
2.根據權利要求1所述的`雙功能適配體檢測試劑盒，其特征在于，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
3.根據權利要求1所述的雙功能適配體檢測試劑盒，其特征在于，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
4.根據權利要求1所述的雙功能適配體檢測試劑盒，其特征在于，所述第一熒光團為羧基熒光素，所述第二熒光團為四甲基羅丹明。
5.根據權利要求1所述的雙功能適配體檢測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow fragment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI,所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
6.一種雙功能適配體檢測方法，用于同時進行Hg2+和Ag+兩種金屬離子檢測，其特征在于，包括如下步驟: 將待測樣品、第一模版DNA和第二模版DNA混合后發生雜交反應得到雜交液，其中，所述第一模版DNA中含有與所述第二模版DNA互補配對的15個堿基,并且所述第一模版DNA和所述第二模版DNA通過所述15個堿基形成雜交后所述第一模版DNA的3’端以及所述第二模版DNA的3’端分別形成3個胸腺嘧啶的錯配和3個胞嘧啶的錯配； 向所述雜交液中加入dNTPS、DNA聚合酶和第一 DNA切割酶發生寡核苷酸鏈置換擴增反應，得到寡核苷酸擴增液，其中，胸腺嘧啶的錯配在Hg2+的存在下，形成T-Hg2+-T的特殊配對結構，從而使得雜交后的第一模版DNA的3’末端以第二模版DNA的5’端為模版擴增，胞嘧啶的錯配在Ag+的存在下，形成C-Ag+-C的特殊配對結構，從而使得雜交后的第二模版DNA的3’末端以第一模版DNA的5’端為模版擴增，所述第一 DNA切割酶對擴增出來的所述第一模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第一寡核苷酸，并且所述第一 DNA切割酶還對擴增出來的所述第二模版DNA的5’端序列的互補序列進行剪切形成第二寡核苷酸； 向所述寡核苷酸擴增液中加入第一熒光團淬滅團探針、第二熒光團淬滅團探針、第二DNA切割酶和第三DNA切割酶發生雙功能熒光擴增反應，得到熒光檢測液，其中，所述第一熒光團淬滅團探針包括第一探針序列和結合在所述第一探針序列上的第一熒光團和第一淬滅團，所述第一探針序列可以與所述第一寡核苷酸雜交，所述第一熒光團和所述第一淬滅團發生淬滅反應，所述第二熒光團淬滅團探針包括第二探針序列和結合在所述第二探針序列上的第二熒光團和第二淬滅團，所述第二探針序列可以與所述第二寡核苷酸雜交，所述第二熒光團和所述第二淬滅團發生淬滅反應，所述第一熒光團和所述第二熒光團不同，所述第二 DNA切割酶對雜交后的所述第一探針序列進行剪切并且剪切后所述第一熒光團和所述第一淬滅團分離，所述第三DNA切割酶對雜交后的所述第二探針序列進行剪切并且剪切后所述第二熒光團和所述第二淬滅團分離； 對所述熒光檢測液進行熒光檢測，完成所述雙功能適配體檢測方法。
7.根據權利要求6所述的雙功能適配體檢測方法，其特征在于，所述第一模版DNA為SEQ ID N0.1所示的序列，第二模版DNA為SEQ ID N0.2所示的序列。
8.根據權利要求6所述的雙功能適配體檢測方法，其特征在于，所述第一探針序列為SEQ ID N0.3所示的序列，所述第二探針序列為SEQ ID N0.4所示的序列。
9.根據權利要求6所述的雙功能適配體檢檢測方法，其特征在于，所述DNA聚合酶為DNA聚合酶Klenow frag ment,所述第一 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BbvCI,所述第二 DNA切割酶為DNA切割酶Nb.BtsI，所述第三DNA切割酶為DNA切割酶Nt.AlwI。
10.根據權利要求6所述的雙功能適配體檢檢測方法，其特征在于，向所述寡核苷酸擴增液中加入第一熒光團淬滅團探針、第二熒光團淬滅團探針、第二 DNA切割酶和第三DNA切割酶發生雙功能熒光擴增反應的操作中，還需要向其中加入牛血清白蛋白。
【文檔編號】G01N21/64GK103667448SQ201310542874
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月5日 優先權日:2013年11月5日
【發明者】張春陽, 朱桂池 申請人:中國科學院深圳先進技術研究院