來自啤酒花的單萜糖基轉移酶及其利用方法
【專利摘要】本發明的目的在于，提供來自啤酒花的單萜糖基轉移酶及使用該酶的單萜糖苷的制造方法。本發明提供來自啤酒花的單萜糖基轉移酶及使用該酶的單萜糖苷的制造方法。本發明還提供轉導來自啤酒花的單萜糖基轉移酶基因的轉化體及該轉化體的制備方法。
【專利說明】來自啤酒花的單萜糖基轉移酶及其利用方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發明涉及具有將單萜進行糖基化的活性的蛋白質及編碼該蛋白質的多核苷酸、 利用該蛋白質的單萜糖苷的制造方法、高表達單萜糖基轉移酶的轉化體以及根據所述方法 制備的單萜的糖苷及其利用。此外，本發明還涉及抑制具有將單萜化合物進行糖基化的活 性的蛋白質的表達的植物及其利用。 【背景技術】
[0002] 類萜、特別是單萜（C10)、倍半萜（C15)等分子量較小的類萜類是植物的主要香氣 成分，不僅應用于食品、酒類的香味，還廣泛應用于直至化妝品、香水的工業產品中。已知以 芳樟醇為代表的單萜雖在植物細胞內合成，但一部分作為糖苷積累，例如已報道的有十字 花科擬南芥（Arabidopsis thaliana)的輕化芳樟醇（hydroxide Linalool)的糖苷（非專 利文獻1)。還已知不僅在模式植物中,在作為產業上重要的作物的大麻科啤酒花（Humulus lupulus)(非專利文獻2)、山茶科茶樹（Camellia sinensis)(非專利文獻3-6)、姜科姜 (Zingiber officinale)(非專利文獻7)中，也積累有單廠糖苷。而且，從在植物界中的廣泛 報道來看（非專利文獻8)，認為糖苷通常的形態是作為香氣成分的前體。對于將作為香氣 前體物質的萜糖苷的糖用酶或非酶方法切除，從而使香氣成分揮發的人工控制，也從產業 應用的見解上予以了研究（非專利文獻9)。
[0003] 但是，至今為止，雖然已從茶樹中分離出切斷單萜糖苷的糖的酶（β-櫻草糖苷 酶（β-primeverosidase))(非專利文獻10)，但對于在單廠上附加糖（進行糖基化）的 分子機制還不明了。雖報道了通過擬南芥的UDP-sugar依賴性糖基轉移酶（UDP-sugar dependent glycosyltransferase :UGT)的全面性的活性篩選，一部分UGT酶在試管內與 單萜反應，但未示出生理性作用、其活性的意義（非專利文獻11)。因蕓香科甜橙（Citrus sinensis)中也積累了單萜糖苷，所以，雖進行了對于單萜的UGT篩選，但還未成功鑒定出 具有活性的UGT酶基因（非專利文獻12)。
[0004] 大麻科啤酒花（Humulus lupulus)是啤酒的主要原料，主要產于德國、捷克所在的 歐洲、加拿大、美國所在的北美大陸。啤酒的香氣中，作為來源于啤酒花的香氣成分，可列舉 以芳樟醇為代表的單萜類。啤酒花的球花表皮中，存在用于貯存香氣成分而特殊分化的被 稱為蛇麻素的腺毛。認為很多香氣成分在蛇麻素中積累。另一方面，雖已報道了啤酒花、啤 酒中積累有作為香氣成分前體的芳樟醇、香葉醇的糖苷等萜類的糖苷，但對其生成酶還不 清楚（非專利文獻2、10及13)。
[0005] 專利文獻1 :國際公開公報W097/11184
[0006] 非專利文獻 1 :Aharoni et al (2003)Plant Celll5, 2866-2884
[0007] 非專利文獻2 :Kollmannsberger et al (2〇〇6)Mschr. Brauwissenschaft59, 83_89
[0008] 非專利文獻 3 :Guo et al (1994) Biosci. Biotech. Biochem. 58, 1532-1534
[0009] 非專利文獻 4 :Nishikitani et al (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 929-931
[0010] 非專利文獻 5 :Moon et al (1996) Biosci. Biotech. Biochem. 60, 1815-1819
[0011] 非專利文獻 6 :Ma et al (2001) Phytochemisty56, 819-825
[0012] 非專利文獻 7 :Sekiwa et al (1999) Biosci. Biotech. Biochem. 63, 384-389
[0013] 非專利文獻 8 :Winterhalter and Skouroumounis(1997)Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 55, 73-105
[0014] 非專利文獻 9 :Herman (2007) Angew. Chem. Int. Ed. 46, 5836-5863
[0015] 非專利文獻 10 :Mizutani et al (2002) Plant Physiol. 130, 2164-2176
[0016] 非專利文獻 11 :Caputi et al (2008) Chem. Eur. J. 14, 6656-6662
[0017] 非專利文獻 l2 :Fan et al(2〇10) Genome53, 816-823
[0018] 非專利文獻 13 :Nedjma, M. , et al (2006) Congress Proceedings of European Brewery Convention71, 1-13
【發明內容】

[0019] 本
【發明者】進行了深入研究，結果成功地鑒定了啤酒花中催化單萜的糖基化反應的 酶及編碼該酶的基因序列。本發明基于上述見解。
[0020] 即本發明如下。
[0021] [1] -種蛋白質，其選自以下（a)?（c)中的任一項，
[0022] (a)蛋白質，其由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列組成；
[0023] (b)蛋白質，其由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列中1?95個氨基酸發生缺失、 取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有將單萜化合物進行糖基化的活性；
[0024] (c)蛋白質，其具有相對于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序列 同一性的氨基酸序列，且具有將單萜化合物進行糖基化的活性。
[0025] [2]根據[1]中所述的蛋白質，其中，所述單萜化合物為香葉醇或芳樟醇。
[0026] [3] -種多核苷酸，其選自以下（a)?（e)，
[0027] (a)多核苷酸，其含有SEQ ID NO: 1、3或5的堿基序列；
[0028] (b)多核苷酸，其編碼由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0029] (c)多核苷酸，其編碼由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列中1?95個的氨基酸 發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成的蛋白質，且所述蛋白質具有將單萜化 合物進行糖基化的活性；
[0030] (d)多核苷酸，其編碼相對于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序 列同一性的氨基酸序列的蛋白質，且所述蛋白質具有將單萜化合物進行糖基化的活性；
[0031] (e)多核苷酸，其為與由SEQ ID N0:1、3或5的堿基序列的互補堿基序列組成的多 核苷酸在高嚴格條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有將單萜化合物進行糖基化的活性的蛋 白質。
[0032] [4] 一種非人轉化體，其轉導了 [3]中所述的多核苷酸。
[0033] [5]根據[4]中所述的轉化體，其中，所述多核苷酸為插入至表達載體的多核苷 酸。
[0034] [6]根據[4]中所述的轉化體，其為植物體。
[0035] [7] -種提取物，其為[4]中所述的轉化體的提取物。
[0036] [8] -種食品、香料、醫藥品或工業原料，其含有[7]中所述的提取物。
[0037] [9] -種具有對單萜化合物進行糖基化的活性的蛋白質的制造方法，其包括培養
[4]中所述的非人轉化體。
[0038] [10] -種單萜糖苷的制造方法，其包括：包含使[1]中所述的蛋白質與UDP-糖、 單萜化合物反應而對所述單萜化合物進行糖基化的工序。
[0039] [11]根據[10]中所述的方法，其中，所述UDP-糖為UDP-葡萄糖。
[0040] [12]根據[10]中所述的方法，其中，所述單萜化合物為香葉醇或芳樟醇。
[0041] 通過利用本發明的蛋白質及編碼該蛋白質的多核苷酸，可高效制造萜化合物的糖 苷。此外，因本發明的轉化體中萜化合物的糖苷含量高，所以，可從這些轉化體中高效提取、 純化萜化合物的糖苷。 【專利附圖】

【附圖說明】
[0042] 圖1 :表示啤酒花H1UGT的重組蛋白質表達的結果（SDS-PAGE)。
[0043] 圖2 :表示啤酒花H1UGT重組蛋白質的香葉醇糖基化活性。
[0044] 圖3 :表示啤酒花H1UGT的重組蛋白質的芳樟醇糖基化活性。 【具體實施方式】
[0045] 以下，詳細說明本發明。以下的實施方式是用于說明本發明的例示，其目的不是將 本發明僅限于該實施方式。本發明只要不脫離其主要內容，可以各種方式實施。
[0046] 另外，本說明書中引用的全部文獻及公開公報、專利公報及其他的專利文獻作為 參照編入本說明書中。此外，本說明書包含作為本申請優先權主張的基礎的2012年2月6 日申請的日本國專利申請（日本特愿號）的說明書及附圖中記載的內容。
[0047] 以下，詳細說明本發明。以下的實施方式是用于說明本發明的例示，其目的不是將 本發明僅限于該實施方式。本發明只要不脫離其主要內容，可以各種方式實施。
[〇〇48] 本
【發明者】首次闡明了負責啤酒花單萜化合物的糖基化反應的酶蛋白質為 H1UGT119、H1UGT127、H1UGT279 及 H1UGT251。
[0049] H1UGT119的CDS序列及推定氨基酸序列分別為SEQ ID NO: 1及2。H1UGT127的 ⑶S序列及推定氨基酸序列分別為SEQIDN0:3及4。而且，H1UGT279 的⑶S序列及推定 氨基酸序列分別為SEQ ID N0:5及6。此外，H1UGT251的⑶S序列及推定氨基酸序列分別 為SEQ ID N0:7及8。這些多核苷酸及酶可根據后述的實施例中記載的方法、公知的基因工 程的方法、公知的合成方法等獲得。
[0050] 1.來自啤酒花的單萜糖基轉移酶
[0051] 本發明提供選自以下（a)?（c)中任一項所述的蛋白質（以下稱為"本發明的蛋 白質"）。
[0052] (a)蛋白質，其由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列組成；
[0053] (b)蛋白質，其由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中1?95個氨基酸發
[0054] 生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有將單萜化合物進行糖基 化的活性；
[0055] (c)蛋白質，其具有與SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列有80%以上序列同一 性的氨基酸序列，且具有將單萜化合物進行糖基化的活性。
[0056] 上述（a)?（c)中所述的蛋白質中，"SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列"在某 些實施方式中為"SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列"、"SEQ ID N0:2或4的氨基酸序列"、 "SEQ ID N0:2或6的氨基酸序列"或"SEQ ID N0:4或6的氨基酸序列"。
[0057] 在其他實施方式中，上述（a)?（c)中所述的蛋白質中，"SEQ ID N0:2、4、6或8的 氨基酸序列"為"SEQ ID N0:8的氨基酸序列"。
[0058] 上述（b)或（c)中所述的蛋白質，代表性的為天然存在的SEQ ID N0:2、 4、6或8的多肽的突變體，但也包含使用例如"Sambrook&Russell，Molecular Cloning:A Laboratory Manual Vol. 3, Cold Spring Harbor Laboratory Press2001，'、 "Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sonsl987_1997，'、 "Nuc. Acids. Res.，10, 6487(1982) "、"Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409(1982) "、 "Gene，34,315(1985)"、"Nuc.Acids.Res.，13,4431 (1985)，，、"Proc.Natl.Acad.Sci. USA，82, 488 (1985) "等中記載的定點誘變法而人為獲得的蛋白質。
[0059] 本說明書中，作為"由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中1?95個氨基
[0060] 酸發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有將單萜化合物進行 糖基化的活性的蛋白質"，可列舉由SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列中，例如，1?95個、 1?90個、1?85個、1?80個、1?75個、1?70個、1?65個、1?60個、1?55個、1? 50個、1?49個、1?48個、1?47個、1?46個、1?45個、1?44個、1?43個、1?42 個、1?41個、1?40個、1?39個、1?38個、1?37個、1?36個、1?35個、1?34個、 1?33個、1?32個、1?31個、1?30個、1?29個、1?28個、1?27個、1?26個、1? 25個、1?24個、1?23個、1?22個、1?21個、1?20個、1?19個、1?18個、1?17 個、1?16個、1?15個、1?14個、1?13個、1?12個、1?11個、1?10個、1?9個 (1?多個）、1?8個、1?7個、1?6個、1?5個、1?4個、1?3個、1?2個或1個氛 基酸殘基發生缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有將單萜化合物進行糖 基化的活性的蛋白質。上述氨基酸殘基的缺失、取代、插入及/或附加的數量通常越小越優 選。
[0061] 此外，作為此種蛋白質，可列舉具有與SEQ ID N0:2、4、6或8的氨基酸序列有80% 以上、81 %以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、 89 %以上、90%以上、91 %以上、92%以上、93 %以上、94%以上、95%以上、96 %以上、97% 以上、98%以上、99%以上、99. 1%以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、99. 5%以 上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上或99. 9%以上序列同一性的氨基酸序列，且具有 將單萜化合物進行糖基化的活性的蛋白質。上述序列同一性的數值通常越大越優選。
[〇〇62] 在此，"將單萜化合物進行糖基化的活性"是指在作為苷元的單萜化合物的羥基上 附加 UDP糖中所含有的糖（進行糖基化）的活性。附加糖的羥基無特別限定。
[〇〇63] 將單萜化合物進行糖基化的活性可通過用如下公知的方法進行分析而確認，在包 含1?500ng (優選為50?200ng，最優選為100ng)本發明的蛋白質、1?1000 μ Μ(優選為 100?700 μ Μ，最優選為500 μ M) UDP糖（例如UDP-葡萄糖）及1?500 μ Μ (優選為100? 500 μ Μ，最優選為250 μ Μ)單萜化合物（例如芳樟醇或香葉醇）的ρΗ6. 0?8. 0的中性區的 緩沖液（例如磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液）中，在20?40°C的溫度下孵育后，純化所述 單廠，將純化的單廠進行LC-MS分析（液相色譜-串聯質譜（Liquid Chromatography-Mass Spectrometry))等。
[0064] 糖基化反應通常在1分鐘?12小時左右結束。
[〇〇65] 以下表示可相互取代的氨基酸殘基的例子。同一組中所含有的氨基酸殘基可相互 取代。A組：亮氨酸、異亮氨酸、正亮氨酸、纈氨酸、正纈氨酸、丙氨酸、2 -氨基丁酸、蛋氨酸、 鄰甲基絲氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、環己基丙氨酸；B組：天冬氨酸、谷氨酸、異天 冬氨酸、異谷氨酸、2 -氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C組：天冬酰胺、谷氨酰胺；D組：賴氨 酸、精氨酸、鳥氨酸、2,4 一二氨基丁酸、2,3 -二氨基丙酸；E組：脯氨酸、3 -羥基脯氨酸、 4 一羥基脯氨酸；F組：絲氨酸、蘇氨酸、高絲氨酸；G組：苯丙氨酸、酪氨酸。
[〇〇66] 本發明的蛋白質可通過使編碼該蛋白質的多核苷酸（參照后述的"本發明的 多核苷酸"）在適合的宿主細胞內表達而得到，也可通過Fmoc法（9-芴甲氧羰基法）、 tBoc法（叔丁氧羰基法）等的化學合成法制造。此外，還可利用Advanced Automation Peptide Protein Technologies 公司制、拍金埃爾默（Perkin Elmer)公司制、Protein Technologies 公司制、PerSeptive 公司制、Applied Biosystems 公司制、SHIMADZU 公司制 等的肽合成儀進行化學合成。
[0067] 本發明中，"單萜化合物"是指以以下的異戊二烯為結構單元的烴，除了由植物、昆 蟲及菌類等制作出的生物體物質以外，也包含化學合成的化合物。
[0068]
【權利要求】
1. 一種蛋白質，其選自以下（a)?（c)中的任一項， (a) 蛋白質，其由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列組成； (b) 蛋白質，其由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列中1?95個氨基酸發生缺失、取 代、插入及/或附加的氨基酸序列組成，且具有將單萜化合物進行糖基化的活性； (c) 蛋白質，其具有相對于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序列同一 性的氨基酸序列，且具有將單萜化合物進行糖基化的活性。
2. 根據權利要求1中所述的蛋白質，其中，所述單萜化合物為香葉醇或芳樟醇。
3. -種多核苷酸，其選自以下（a)?（e)， (a) 多核苷酸，其含有SEQ ID NO: 1、3或5的堿基序列； (b) 多核苷酸，其編碼由SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列組成的蛋白質； (c) 多核苷酸，其編碼由SEQ ID NO:2、4或6的氨基酸序列中1?95個的氨基酸發生 缺失、取代、插入及/或附加的氨基酸序列組成的蛋白質，且所述蛋白質具有將單萜化合物 進行糖基化的活性； (d) 多核苷酸，其編碼相對于SEQ ID N0:2、4或6的氨基酸序列具有80%以上序列同 一性的氨基酸序列的蛋白質，且所述蛋白質具有將單萜化合物進行糖基化的活性； (e) 多核苷酸，其為與由SEQ ID NO: 1、3或5的堿基序列的互補堿基序列組成的多核 苷酸在高嚴格條件下雜交的多核苷酸，且編碼具有將單萜化合物進行糖基化的活性的蛋白 質。
4. 一種非人轉化體，其轉導了權利要求3中所述的多核苷酸。
5. 根據權利要求4中所述的轉化體，其中，所述多核苷酸為插入至表達載體的多核苷 酸。
6. 根據權利要求4中所述的轉化體，其為植物體。
7. -種提取物，其為權利要求4中所述的轉化體的提取物。
8. -種食品、香料、醫藥品或工業原料，其含有權利要求7中所述的提取物。
9. 一種具有對單萜化合物進行糖基化的活性的蛋白質的制造方法，其包括培養權利要 求4中所述的非人轉化體。
10. -種單萜糖苷的制造方法，其包括：包含使權利要求1中所述的蛋白質與UDP-糖、 單萜化合物反應而對所述單萜化合物進行糖基化的工序。
11. 根據權利要求10中所述的方法，其中，所述Μ)Ρ-糖為UDP-葡萄糖。
12. 根據權利要求10中所述的方法，其中，所述單萜化合物為香葉醇或芳樟醇。
【文檔編號】A61K8/97GK104093837SQ201380008332
【公開日】2014年10月8日 申請日期:2013年2月5日 優先權日:2012年2月6日
【發明者】小埜榮一郎, 鶴岡伸夫 申請人:三得利控股株式會社