專利名稱：新的果糖基肽氧化酶的制作方法
技術領域：
本發明涉及具有果糖基肽氧化酶活性的新蛋白、編碼所述蛋白的DNA、用于生產所述蛋白的方法、使用所述蛋白測量糖化蛋白的方法以及包含所述蛋白的用于測量糖化蛋白的試劑。
背景技術：
糖化蛋白包含在生物樣品例如體液和毛發中，體液包括血液等。血液中存在的糖化蛋白的濃度取決于溶解在血清中的糖、例如葡萄糖的濃度，并且最近，在臨床診斷領域中，測量血液中的糖化蛋白——血紅蛋白Alc的濃度(非專利文獻1)，被用于診斷和監測糖尿病。作為測量這種血紅蛋白Alc的方法，已經知道的有使用高效液相色譜(HPLC)的儀器分析方法(非專利文獻幻、使用抗原-抗體反應的免疫分析法(例如非專利文獻幻等，但是在近年中，已經開發了酶分析法，例如，已經開發了使用蛋白酶和果糖基肽氧化酶的方法 (專利文獻1)。酶分析法能夠適用于通用自動化分析儀，并且因為操作也簡單，它們的開發越來越多。在酶分析法中使用的果糖基肽氧化酶，是一種催化在分子氧的存在下通過氧化切開酮糖衍生物中的C-N鍵而產生鄰酮醛糖(α-酮基醛)、肽和過氧化氫的反應的酶，所述酮糖衍生物由葡萄糖的半縮醛與肽的N-端氨基之間的反應產生的葡萄糖胺的Amadori重排所產生。在如

圖1中所示的酶分析法的情形中，一種方法是已知的，其中首先用蛋白酶降解血紅蛋白Alc，并從血紅蛋白的β-鏈的N-端產生α-果糖基纈氨酰組氨酸(在后文中稱為α-FVH)；接下來，使果糖基肽氧化酶作用于所產生的α-FVH，將產生的過氧化氫在過氧化物酶存在下應用于氧化縮合以產生醌色素，并且使用分光光度計通過比色法測定產生的量(專利文獻1)。然而，作為蛋白酶處理的副產物，形成了 ε -果糖基賴氨酸和含有它的糖化肽，并且已經指出，當果糖基肽氧化酶作用于它們時，存在著血紅蛋白Alc的測量值可能高于真實值的風險(專利文獻2)。已經從細菌、真菌和植物發現果糖基肽氧化酶。例如源自于Achaetomiella 屬、毛殼屬(Chaetomium)(專利文獻幻、彎孢霉屬(Curvularia)(專利文獻幻、薔薇科 (Rosaceae)、葡萄科(Vitaceae)、傘形科(Apiaceae)(專利文獻 4)、姜科(Zingiberaceae) (專利文獻幻等的果糖基肽氧化酶是已知的。然而，到目前為止報道的果糖基肽氧化酶具有缺點，例如(1)針對α -糖化二肽(α -果糖基纈氨酰組氨酸)的活性與針對α -糖化氨基酸 (例如α-果糖基纈氨酸)的活性相比不一定高；(2)如上所述，除了 N-端α-糖化二肽之外，它也作用于其中糖連接到賴氨酸的 ε -氨基上的ε -糖化氨基酸(ε -果糖基賴氨酸)，并增加血紅蛋白Alc測量中的測量值； 以及
(3)在使用酶的測量方法的情形中，酶在測量或儲存過程中變得不穩定。為了克服這些缺點，已經報道了由于在果糖基肽氧化酶中人工導入突變而對 ε -果糖基賴氨酸的反應性降低的酶(專利文獻4)、也是由于導入突變而耐熱性增加的酶 (非專利文獻4)等。然而，以高水平同時克服上面提到的(1)至C3)的缺點的酶的存在，仍是未知的。非專利文獻1 :Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 第 36 卷， p. 299-308(1998).非專利文獻2 :Chromatogr. Sci.，第 10 卷，p. 659 (1979).非專利文獻3 日本臨床檢查自動化學會雜志，第18卷，第4號，p. 620(1993).非專利文獻4:Appl. Microbiol. Biotechnol.，第 78卷，第5號，p. 775-781 (2008).專利文獻1 特開2001-95598號公報。專利文獻2 國際公布WO 2004/104203號單行本。專利文獻3 特開2003-2；35585號公報.專利文獻4:國際公布WO 2004/038033號單行本。專利文獻5 國際公布WO 2004/038034號單行本。

發明內容
[本發明待解決的問題]有鑒于上面提到的問題，完成了本發明。本發明的目的是提供對α-糖化二肽 (α-果糖基纈氨酰組氨酸)具有高特異性并具有非常穩定的果糖基肽氧化酶活性的蛋白。 此外，本發明的另一個目的是提供編碼該蛋白的DNA、含有該DNA的重組DNA、用該重組DNA 轉化的轉化體、使用該轉化體等生產具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白的方法，以及使用該蛋白測量糖化蛋白的方法和包含該蛋白的用于測量糖化蛋白的試劑。[解決問題的手段]本發明涉及下列(1)到(17)(1)下列[1]到[4]任一項中的蛋白[1]包含SEQ ID NO=I所顯示的氨基酸序列的蛋白；[2]包含在SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；[3]包含與SEQ ID NO 1所顯示的氨基酸序列具有80%或更高同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；以及[4]由在保藏號FERM ΒΡ-11026下保藏的大腸埃希氏桿菌(Escherichia coll) XLl-Blue MRF'菌株所攜帶的表達質粒編碼的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；(2) (1)的蛋白，其包含SEQ ID NO 3所顯示的氨基酸序列；(3)下列[1]到[3]任一項的 DNA [1]編碼(1)的蛋白的DNA;[2]包含SEQ ID NO 2所顯示的核苷酸序列的DNA ；以及[3]在嚴緊條件下與包含與SEQ ID NO 2所顯示的核苷酸序列的互補核苷酸序列的DNA雜交的DNA，其中DNA編碼具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；
(4) (3)的DNA，其編碼包含SEQ ID NO 3所顯示的氨基酸序列的蛋白；(5) (3)的DNA，其包含SEQ ID NO 4所顯示的核苷酸序列；(6) 一種重組DNA，其包含(3)到(5)任一項的DNA ；(7) 一種轉化體，其包含(6)的重組DNA ；(8) 一種用于生產⑴或(2)的蛋白的方法，其中將(7)的轉化體在培養基中進行培養，蛋白產生并積累在培養物中，并從培養物收集蛋白；(9) 一種用于測量樣品中的糖化蛋白的方法，其中方法包含將樣品與蛋白酶反應以形成糖化肽，然后將形成的糖化肽與(1)或(2)的蛋白反應，并測量由糖化肽與蛋白之間的反應所形成的物質或在糖化肽與蛋白之間的反應中所消耗的物質；(10) (9)的測量方法，其中糖化蛋白是糖化血紅蛋白；(11) (10)的測量方法，其中糖化血紅蛋白是血紅蛋白Alc ；(12) 一種用于測量糖化蛋白的試劑，其包含蛋白酶和⑴或(2)的蛋白；(13) (12)的試劑，其還包含用于測量由⑴或(2)的蛋白與從糖化蛋白形成的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；(14) (13)的試劑，其中產物是過氧化氫；(15) (12)到(14)任一項的試劑，其中糖化蛋白是糖化血紅蛋白；(16) (15)的試劑，其中糖化血紅蛋白是血紅蛋白Alc ；以及(17)在保藏號FERM BP_11(^6下保藏的大腸埃希氏桿菌(Escherichia coll) XLl-Blue MRF，菌株。[本發明的效果]本發明提供了對α -糖化二肽(α _果糖基纈氨酰組氨酸)具有高特異性并具有非常穩定的果糖基肽氧化酶活性的蛋白、編碼該蛋白的DNA、用于生產該蛋白的方法，以及使用該蛋白測量糖化蛋白的方法和包含該蛋白的用于測量糖化蛋白的試劑。附圖簡述圖1顯示了血紅蛋白Alc的酶法測量的方案圖。圖2顯示了 FP0X-9的氨基酸序列。上面有圓圈標記的氨基酸顯示了相對于產果糖基肽氧化酶真菌(遺傳來源)的氨基酸序列來說突變的位點。圖3顯示了 FP0X-9的DNA序列。上面有圓圈標記的核苷酸顯示了相對于產果糖基肽氧化酶細菌(遺傳來源)的DNA序列來說突變的位點。圖4顯示了 FP0X-15的氨基酸序列。上面有圓圈標記的氨基酸顯示了相對于產果糖基肽氧化酶細菌(遺傳來源)的氨基酸序列來說突變的位點，下劃線的氨基酸顯示了相對于FP0X-9的氨基酸序列來說突變的位點。圖5顯示了 FP0X-15的DNA序列。上面有圓圈標記的核苷酸顯示了相對于產果糖基肽氧化酶細菌(遺傳來源)的DNA序列來說突變的位點，下劃線的核苷酸顯示了相對于 FP0X-9的DNA序列來說突變的位點。執,行本發明的方式1.本發明的蛋白本發明的蛋白的實例包括[1]包含SEQ ID NO=I所顯示的氨基酸序列的蛋白；
[2]包含在SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；[3]包含與SEQ ID NO=I所顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；以及[4]由在保藏號FERM BP_11(^6下保藏的大腸埃希氏桿菌(Escherichia coll) XLl-Blue MRF'菌株所攜帶的表達質粒編碼的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。在上述中，包含具有一個或多個氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白，可以例如使用位點特異性誘變方法通過將位點特異性突變導入包含SEQ ID N0:1所顯示的氨基酸序列的蛋白的編碼DNA來獲得，所述位點特異性誘變方法描述在《分子克隆實驗指南》第二版(Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)(在后文中簡稱《分子克隆》第二版)；《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology), John Wiley & Sons (1987-1997)(在后文中簡稱《分子生物學現代方法》)；Nucleic Acids Research,10,6487(1982) ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,79,6409(1982) ；Gene,M' 315(1985) ；Nucleic Acids Research, 13,4431 (1985)；和 Proc. Natl. Acad. ki. USA，82, 488(1985)等。盡管對缺失、取代或添加的氨基酸的數量沒有特別限制，但它是通過已知方法例如上面提到的位點特異性誘變方法能夠缺失、取代或添加的氨基酸的數量，并且該數量是一到幾十，優選為1到20、更優選為1到10、更加優選為1到5。當一個或多個氨基酸被缺失、取代或添加到SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列時， 一個或多個氨基酸可以在同一序列的任何位置處缺失、取代或添加。能夠發生氨基酸缺失或添加的氨基酸位置包括例如位于SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列的N-端側和C-端側的一個到幾個氨基酸。缺失、取代或添加可以同時發生，并且被取代或添加的氨基酸可以是天然存在類型或非天然存在類型的氨基酸。天然存在類型的氨基酸的實例包括L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺、L-谷氨酸、甘氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-賴氨酸、L-精氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、 L-酪氨酸、L-纈氨酸和L-半胱氨酸。下面，顯示了可互相取代的氨基酸的實例。包含在同一個組中的氨基酸可互相取代。A組亮氨酸，異亮氨酸，正亮氨酸，纈氨酸，正纈氨酸，丙氨酸，2-氨基丁酸，甲硫氨酸，0-甲基絲氨酸，叔丁基甘氨酸，叔丁基丙氨酸，環己基丙氨酸 B組天冬氨酸，谷氨酸，異天冬氨酸，異谷氨酸，2-氨基己二酸，2-氨基辛二酸C組天冬酰胺，谷氨酰胺D組賴氨酸，精氨酸，鳥氨酸，2,4- 二氨基丁酸，2，3_ 二氨基丙酸E組脯氨酸，3-羥基脯氨酸，4-羥基脯氨酸F組絲氨酸，蘇氨酸，高絲氨酸G組苯丙氨酸，酪氨酸此外，為了使本發明的蛋白具有果糖基肽氧化酶活性，期望蛋白與SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列具有80 %以上、優選90 %以上、更優選94 %以上、更優選98 %以上、特別優選99%以上的同源性。氨基酸序列和核苷酸序列的同源性可以使用Karlin和Altshul的BLAST算法 [Pro. Natl. Acad. Sci. USA,90, 5873(1993)]或 FASTA[Methods Enzymo1. ,183,63(1990)1 來確定。基于該BLAST算法，已經開發了被稱為BLASTN和BLASTX的程序[J. Mol. Biol.， 215,403 (1990)]。當通過基于BLAST的BLASTN分析核苷酸序列時，參數被設置成例如得分 (score) = 100和字長(wordlength) = 12。當通過基于BLAST的BLASTX分析氨基酸序列時，參數被設置成例如得分(score) = 50和字長(wordlength) = 3。當使用BLAST和 Gapped BLAST程序時，使用每個程序的缺省參數。包含與SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列具有80%以上、優選90%以上、更優選 94%以上、更加優選98%以上或特別優選99%以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白，也是本發明的蛋白。本發明的蛋白是，例如，包含SEQ ID NO :3所顯示的氨基酸序列的蛋白。作為證實本發明的蛋白具有果糖基肽氧化酶活性的手段，人們可以通過DNA重組方法生產表達本發明的蛋白的轉化體，使用該轉化體生產本發明的蛋白，然后使用α-FVH 作為底物，測量通過與底物的反應所形成的過氧化氫。本發明的蛋白具有下列性質(a)作用使用分子氧氧化糖化肽，以生成鄰酮醛糖(α _酮基醛)、肽和過氧化氫。(b)底物特異性對α -FVH的高反應性和對ε -果糖基賴氨酸(在后文中簡稱為 ε -FK)的低反應性。可以通過例如使用α -FVH和ε -FK作為底物并測量對α -FVH的活性與對ε -FK 的活性的比率(α -FVH/ ε -FK)，來證實本發明的蛋白對α -FVH的高反應性和對ε -FK的低反應性。對于本發明蛋白的果糖基肽氧化酶活性的最適PH和穩定的ρΗ范圍沒有特別限制，最適PH優選為約6. 0至7. 0，并且對于在40°C處理10分鐘的穩定ρΗ優選為pH6. 0至 9. 0。對于作用的最適溫度范圍沒有特別限制，并且優選為約30°C至50°C。蛋白的熱穩定性越高，蛋白越優選，并且優選使用例如在50°C處理15分鐘后殘余活性為25%以上的蛋白。果糖基肽氧化酶活性的測量通過下述方法進行，并且將在1分鐘內從α -FVH產生 1 μ mol過氧化氫的酶量定義為1個單位(U)。用于測量活件的試劑的制備溶液A 著色溶液溶液A-I :4-氨基安替比林在離子交換水中的溶液，濃度為2. 4mmol/L。溶液A-2 =N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N’ -琥珀酰乙二胺(EMSE)在離子交換水中的溶液，濃度為32mmol/L。溶液B:過氧化物酶溶液過氧化物酶(110U/mg，由東洋紡織社制造)在0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7. 0)中的溶液，濃度為ang/mL。
溶液C 底物溶液α -FVH或ε -FK (由PEPTIDE研究所制造)在0. lmol/L磷酸鹽緩沖液(ρΗ7· 0)中的溶液，濃度為10mmol/mL。測量稈序將50 μ L溶液Α_1、50 μ L溶液Α_2、2 μ L溶液B禾口 20 μ L溶液C混合，并加水到 200 μ L，然后將其在30°C預溫育5分鐘，然后加入1 μ L酶溶液，使混合物在30°C反應30分鐘，在讀板器(infinite F200，由Tecan制造)上測量550nm處的吸光度。空白值在使用離子交換水代替底物溶液(C溶液)制備的溶液上進行測量。然后，向上述測量體系加入各種不同量的過氧化氫，測量550nm處的吸光度，產生顯示出過氧化氫量與吸光度之間的關系的校正曲線，并從該校正曲線確定酶的單位數(酶效價)。攜帶有包含SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列的蛋白的表達質粒(表達質粒) 的大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)XLl-Blue MRF’菌株(大腸埃希氏桿菌XLl-Blue MRF' /pTrcFPOX-9)，保藏于獨立行政法人產業技術綜合研究所國際專利生物保藏中心。保藏物的特定說明內容如下所述。(a)保藏機構的名稱和地址名稱獨立行政法人產業技術綜合研究所國際專利生物保藏中心地址日本國茨城縣筑波市東1 丁目1番地1中央第6 (郵政編碼305-8566)(b)接收日期(保藏日期)2008年9月19日(c)接收號(保藏號):FERM BP-11026在上述保藏號FERM BP-110 下保藏的大腸埃希氏桿菌XLl-Blue MRF，菌株、該細菌菌株所攜帶的表達質粒以及由該質粒編碼的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白，也包含在本發明中。2.本發明的DNA本發明的DNA的實例包括[1]編碼前面1下的[1]到[3]的本發明蛋白的DNA ；[2]包含SEQ ID NO 2所顯示的核苷酸序列的DNA ；以及[3]在嚴緊條件下與所包含的核苷酸序列與SEQ ID NO :2所顯示的核苷酸序列互補的DNA雜交、并且編碼具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白的DNA。在本文中，“雜交”是指目標DNA與具有特定核苷酸序列的DNA或該DNA的一部分雜交。因此，具有特定核苷酸序列的DNA核苷酸序列或該DNA的一部分，可以是其長度可用作Northern或Southern印跡分析的探針、或可用作PCR分析的寡核苷酸引物的DNA。用作探針的DNA包括至少100個核苷酸以上、優選200個核苷酸以上或更優選500個核苷酸以上的DNA ；并且它們也可以是至少10個核苷酸以上或優選15個核苷酸以上的DNA。DNA雜交實驗的方法是公知的。可以例如按照下列文獻中的描述確定雜交條件并進行實驗《分子克隆》(Molecular Cloning)第二版、第三版Q001)，《通用和分子細菌學方法》(Methods for General and Molecular Bacteriology,ASM Press) (1994),《免疫學方法手冊》(Immunology methods manual, Academic press) (Molecular)，以及許多其他標準教科書。
上面提到的嚴緊條件的實例包括下列條件將其上固定化有DNA的濾膜與探針 DNA在含有50%甲酰胺、5xSSC (750mmol/L氯化鈉和75mmol/L檸檬酸鈉)、50mmol/L磷酸鈉 (pH 7. 6),5xDenhardt' s溶液、10%硫酸葡聚糖和20 μ g/L變性鮭魚精子DNA的溶液中， 在42°C下溫育過夜，以及在溫育后，將濾膜在例如0. 2xSSC溶液中、在約65°C下清洗；并且， 也可以使用嚴緊性較低的條件。可以通過調整甲酰胺的濃度(隨著甲酰胺濃度的降低，條件的嚴緊性變低)或通過改變鹽濃度和溫度條件，來修改嚴緊條件。低嚴緊條件的實例包括下列條件在含有6xSSCE QOxSSCE :3mol/L氯化鈉、0. 2mol/L磷酸二氫鈉和0. 02mol/L EDTA, pH 7. 4),0.5% SDS、30%甲酰胺和100 μ g/L變性鮭魚精子DNA的溶液中，在37°C下進行過夜溫育，然后使用lxSSC、0. 1% SDS溶液在50°C下進行清洗。嚴緊性更低的條件的實例包括下述條件雜交在上面提到的低嚴緊條件下使用高鹽濃度的溶液(例如，5xSSC) 進行，然后進行清洗。也可以通過添加或改變用于抑制雜交實驗的背景的阻斷試劑，來設置上面描述的各種條件。在添加上面提到的阻斷試劑后，可以改變雜交條件以使條件相容。上面提到的能夠在嚴緊條件下雜交的DNA，包括當例如使用程序例如上面描述的 BLAST和FASTA、根據上面提到的參數進行計算時，所包含的核苷酸序列與SEQ ID NO :2所顯示的核苷酸序列具有至少80%以上、優選90%以上、更優選94%以上、更加優選98%以上或特別優選99%以上的同源性的DNA。可以如下驗證在嚴緊條件下與上述DNA雜交的DNA是編碼具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白的DNA 制備表達該DNA的重組DNA，將該重組DNA導入宿主細胞，培養所獲得的微生物，純化從培養物獲得的蛋白，并通過使用純化的蛋白作為酶源和α-FVH作為底物測量與底物的反應所產生的過氧化氫。本發明的DNA的實例包括包含SEQ ID NO :3所顯示的氨基酸序列的蛋白的編碼 DNA,以及包含SEQ ID NO 4所顯示的核苷酸序列的DNA。3.本發明的轉化體本發明的轉化體的實例包括使用含有前面2的DNA的重組DNA通過已知方法轉化宿主細胞所獲得的轉化體。宿主細胞的實例包括細菌、酵母、動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞，優選為細菌，更優選為原核細胞，更加優選為屬于埃希氏桿菌屬Escherichia)的微生物。4.本發明的DNA的制備本發明的DNA可以從例如微生物例如絲狀真菌、優選從屬于曲霉屬 (Aspergillus)或裸胞殼屬(Emericella)的微生物、或特別優選從屬于構巢裸胞殼 (Emericella nidulans)等的微生物，使用可以根據SEQ ID NO :2所顯示的核苷酸序列設計的探針來獲得。或者，根據各種遺傳序列數據庫，可以搜索與SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列的編碼DNA的核苷酸序列具有85%以上、優選90%以上、更優選95%以上、更加優選98%以上以及特別優選99%以上的同源性的序列，并且也可以根據通過搜索獲得的核苷酸序列， 按照上面描述的方法從具有核苷酸序列的生物體的染色體DNA、cDNA文庫等獲得本發明的 DNA或在本發明的生產方法中使用的DNA。DNA的核苷酸序列可以如下測定原樣使用所獲得的DNA，或通過將它用適合的限制性酶切開，通過常規方法插入到載體中，將得到的重組DNA導入宿主細胞，然后使用慣常使用的核苷酸序列分析方法例如雙脫氧方法[Proc. Natl. Acad. Sci. ,USA, 74, 5463 (1977)] 或核苷酸序列分析儀例如373A DNA測序儀(由Perkin Elmer制造)進行分析。用于插入本發明的DNA的載體的實例包括pBluescript II KS(+)(由Mratagene 制造)、pDIRECT[Nucleic Acids Res. ,18,6069(1990)], pCR-Script Amp SK(+)(由 Stratagene 制造)、pT7Blue(由 Novagen, Inc.制造)、pCR II (由 Invitrogen Corp.制造)和 pCR-TRAP (由 GenHunter Corp.制造)。作為宿主細胞，可以使用屬于埃希氏桿菌屬等的微生物。屬于埃希氏桿菌屬的微生物的實例包括大腸埃希氏桿菌XLl-Blue、大腸埃希氏桿菌XL2-Blue、大腸埃希氏桿菌 DH1、大腸埃希氏桿菌MC1000、大腸埃希氏桿菌ATCC 12435、大腸埃希氏桿菌W1485、大腸埃希氏桿菌JM109、大腸埃希氏桿菌HB101、大腸埃希氏桿菌No. 49、大腸埃希氏桿菌W3110、 大腸埃希氏桿菌NY49、大腸埃希氏桿菌MP347、大腸埃希氏桿菌匪522、大腸埃希氏桿菌 BL21和大腸埃希氏桿菌ME8415。作為導入重組DNA的方法，可以使用任何用于將DNA導入上述宿主細胞的方法， 其實例包括使用鈣離子的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA，迎，2110 (1972)]、原生質體方法 (特開昭 63-248394)和電穿孔[Nucleic Acids Res. ,16,6127 (1988) ] 在所獲得的DNA作為核苷酸序列測定的結果是部分DNA的情況下，可以使用該部分DNA作為探針，通過在染色體DNA文庫上進行Southern雜交等，來獲得全長DNA。此外，也可以根據所測定的該DNA的核苷酸序列，使用由PerS^tive Biosystems 制造的8905型DNA合成儀等通過化學合成來制備所需DNA。如上所述獲得的DNA的實例是具有SEQ ID NO 2所顯示的核苷酸序列的DNA。5.用于產生在本發明的生產方法中使用的轉化體的方法在本發明DNA的基礎上，根據需要制備含有本發明蛋白的編碼區的適合長度的 DNA片段。通過取代蛋白編碼部分的核苷酸序列中的核苷酸以獲得在宿主中表達的最適密碼子，可以獲得具有提高的蛋白生產率的轉化體。通過將DNA片段插入到適合的表達載體中啟動子的下游，產生重組DNA。可以通過將重組DNA導入適合于表達載體的宿主細胞，來獲得生產本發明蛋白的重組體。作為宿主細胞，可以使用任何宿主細胞例如細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、昆蟲細胞和植物細胞，只要其能夠表達目標基因即可。所使用的表達載體是在上面提到的宿主細胞中能夠自主復制或整合到染色體中， 并在能夠轉錄本發明的DNA的位置處含有啟動子的表達載體。在使用原核生物例如細菌作為宿主細胞的情況下，含有本發明的DNA的重組DNA 優選為能夠在原核生物中自主復制，并在同時由啟動子、核糖體結合序列、本發明的DNA和轉錄終止序列構成的重組DNA。還可以包含調控啟動子的基因。表達載體的實例是pCold I (由 TAKARA BIO Inc.制造)、pCDF_lb 和 pRSF-lb (都由 Novagen Inc.制造)、pMAL_c2x (由 New England Biolabs Inc.制造)、pGEX_4T_l (由 GE Healthcare Biosciences 制造)、pTrcHis (由 Invitrogen Corp.制造)、pSE280 (由 Invitrogen Corp. ^ijit)、pGEMEX-1 (由 Promega Corp. ^ijit)、pQE-30 (由 Qiagen Inc.制造)、pET-3 (由 Novagen Inc.制造)、pKYPIO (特開昭 58-110600)、pKYP200 [Agric. Biol. Chem.，堅，669 (1984) ]、pLSAl [Agric. Biol. Chem.，53, 277 (1989) ], pGELl [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82,4306 (1985) ], pBluescript II SK(+)、pBluescript II KS (-) (由 Mratagene 制造)、pTrS30 [從大腸埃希氏桿菌 JM109/pTrS30 (FERM BP-5407)制備]、 pTrS32 [從大腸埃希氏桿菌 JM109/pTrS32 (FERM BP-5408)制備]、pPAC31 (WO 98/12343)、 pUC19 [Gene，迎，103 (1985)]、pSTV28(由 TAKARA BIO Inc.制造)、pUC118 (由 TAKARA ΒΙΟ Inc.制造)和 pPAl (特開昭 63-233798)。可以使用任何啟動子，只要它能夠在宿主細胞例如大腸埃希氏桿菌中起作用即可。其實例包括源自于大腸埃希氏桿菌、噬菌體等的啟動子，例如iin啟動子(P^J、!^啟動子(Pk) >PL啟動子、Pk啟動子和Pse啟動子，以及SPOl啟動子、SP02啟動子和penP啟動子。也可以使用具有人工設計的變化的啟動子，例如其中將兩個Ptep串聯排列的啟動子、M 啟動子、lacT7啟動子和let I啟動子。此外，也可以使用用于在屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)的微生物中表達的xylA 啟動子[App 1. Microbiol. Biotechnol. ,35, 594-599 (1991)]、用于在屬于棒狀桿菌屬 (Corynebacterium)的微生物中表達的 P54-6 啟動子[Appl. Microbiol. Biotechnol. ,53, 674-679(2000)]等。優選使用其中Siine-Dalgarn0序列、即核糖體結合序列與起始密碼子之間的距離經過適當調整(例如6到18個核苷酸)的質粒。在其中本發明的DNA已被連接到表達載體的重組DNA中，轉錄終止序列不總是必需的；然而，轉錄終止序列優選置于結構基因的直接下游。這種重組DNA的實例是pET21_plul440。原核生物的實例包括屬于下列屬的微生物埃希氏桿菌屬、沙雷氏菌屬(Serratia)、芽孢桿菌屬、短桿菌屬(Brevibacterium)、棒狀桿菌屬、微桿菌屬 (Microbacterium)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、月旨環酸芽孢桿菌屬(Alicyclobacillus)、魚腥藻屬(Anabaena)、組囊藻屬(Anacystis)、 節桿菌屬(Arthrobacter)、固氮菌屬(Azotobacter)、著色菌屬(Chromatium)、歐文氏菌屬(Erwinia)、甲基桿菌屬(methylobacterium)、席藻屬(Phormidium)、紅細菌屬(Rhodobacter) , Τ fx MMM (Rhodopseudomonas) > tl ^M (Rhodospirillum) > 柵藻屬(Scenedesmus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、聚球藻屬(Synechoccus)禾口發 酵單胞菌屬(Zymomonas)。例如，它們是大腸埃希氏桿菌XLl-Blue、大腸埃希氏桿菌XL2-Blue、大腸埃希氏桿菌DH1、大腸埃希氏桿菌DH5a、大腸埃希氏桿菌MC1000、 大腸埃希氏桿菌KY3276、大腸埃希氏桿菌W1485、大腸埃希氏桿菌JM109、大腸埃希氏桿菌HB101、大腸埃希氏桿菌No. 49、大腸埃希氏桿菌W3110、大腸埃希氏桿菌NY49、 大腸埃希氏桿菌MP347、大腸埃希氏桿菌匪522、大腸埃希氏桿菌BL21、枯草芽孢桿菌 (Bacillus subtil is) ATCC 33712、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、產氨短桿菌 (Brevibacterium ammoniagenes) > Brevibacterium immariophilum ATCC 14068、角軍 H 短桿菌(Brevibacterium saccharolyticum)ATCC 14066、黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)ATCC 14067、乳糖發酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869、谷氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032、谷氨酸棒狀桿菌 ATCC 14297,嗜乙酰乙酸棒狀桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870、嗜氨微桿菌 (Microbacterium ammoniaphilum)ATCC 15354、無花果沙雷氏菌(Serratia ficaria)、 (Serratia fonticola) Λ ^^^ W R^ (Serratia liquefaciens) Λ f^M 沙雷氏菌(Serratia marcescens)、假單胞菌(i^seudomonas) sp. D-0110、放射形土壤桿菌(Agrobacterium radiobacter)、毛根土壤桿菌(Agrobacterium rhizogenes)、覆盆子土壤桿菌(Agrobacterium rubi)、柱胞魚腥藻(Anabaena cylindrica)、桶形魚腥藻 (Anabaena doliolum)、水華魚腥藻(Anabaena flos-aquae)、金黃色節桿菌(Arthrobacter aurescens)、梓樣色節桿菌(Arthrobacter citreus)、球形節桿菌(Arthrobacter globiformis)、裂烴谷氨酸節桿菌(Arthrobacter hydrocarboglutamicus)、邁索節桿菌(Arthrobacter mysorens)、煙草節桿菌(Arthrobacter nicotianae)、石錯節桿菌(Arthrobacter paraffineus)、原玻璃蟲黽節桿菌(Arthrobacter protophormiae)、 Arthrobacter roseoparaffinus、硫石黃節桿菌(Arthrobacter sulfureus)、產服節桿菌(Arthrobacter ureafaciens)、布氏著色菌(Chromatium buderi)、微溫著色菌 (Chromatium tepidum)、酒色著色菌(Chromatium vinosum)、沃氏著色菌(Chromatium warmingii)、Chromatium fluviatile、P麓夏孢歐文氏菌(Erwinia uredovora)、古月蘿卜歐文氏菌(Erwinia carotovora)、菠蘿歐文氏菌(Erwinia ananas)、草生歐文氏菌(Erwinia herbicola)、Erwinia punctata、地生歐文氏菌(Erwinia terreus)、羅得西亞甲基桿菌 (methylobacterium rhodesianum)、扭脫甲基桿菌(methylobacterium extorquens)、席藻(Phormidium)sp. ATCC 四409、莢膜紅細菌(Rhodobacter capsulatus)、類球紅細菌 (Rhodobacter sphaeroides)、胚素紅假單胞菌(Rhodopseudomonas blastica)、海洋紅假單胞菌(Rhodopseudomonas marina)、沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、需鹽紅螺菌(Rhodospirillum salexigens)、嗜鹽紅螺菌(Rhodospirillum salinarum)、產二素鏈霉菌(Streptomyces ambofaciens)、金霉素鏈霉菌(Streptomyces aureofaciens)、金色鏈霉菌(Streptomyces aureus)、殺真菌素鏈霉菌(Streptomyces fungicidicus)、灰產色鏈霉菌(Streptomyces griseochromogenes)、 灰色鏈霉菌(Sti^ptomyces griseus)、變鉛青鏈霉菌(Sti^ptomyces livickns)、橄欖灰鏈霉菌(Streptomyces olivogriseus)、枝鏈霉菌(Streptomyces rameus)、田無鏈霉菌 (Streptomyces tanashiensis)、葡萄色鏈霉菌(Streptomyces vinaceus)禾口運動發酵單胞菌(Zymomonas mobilis)。作為將重組DNA導入原核生物的方法，可以使用任何方法，只要它能夠將DNA導入上面提到的宿主細胞中即可，其實例包括使用鈣離子的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 幽，2110 (1972)]、原生質體方法(特開昭63-248394)和電穿孔方法[Nucleic Acids Res.， 邊，6127 (1988)]。在使用酵母菌株作為宿主細胞的情況下，可以使用YEpl3 (ATCC 37115)、 YEp24 (ATCC 37051)、YCp50 (ATCC 37419)、pHS19 和 pHS15 作為表達載體。作為啟動子，可以使用任何啟動子，只要它能夠在酵母菌株中起作用即可，其實例包括啟動子例如PH05啟動子、PGK啟動子、GAP啟動子、ADH啟動子、gal 1啟動子、gal 10 啟動子、熱休克多肽啟動子、MF α 1啟動子和CUP 1啟動子。宿主細胞的實例包括屬于酵母菌屬(Saccharomyces)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)、克魯維酵母菌屬(Kluyveromyces)、絲孢酵母屬 (Trichosporon)、許旺酵母屬Schwanniomyces)、畢赤酵母屬(Pichia)和假絲酵母屬 (Candida)的酵母菌株，具體實例包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克魯維酵母(Kluyveromyces lactis)、3 芽絲 包酵母(Trichosporon pullulans) > Schwanniomyces alluvius、EL斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)和產朊假絲酵母(Candida utilis)。作為將重組DNA導入酵母的方法，可以使用任何方法，只要它能夠將DNA導入酵母中即可，其實例包括電穿孔方法[Methods Enzymo 1. , 1M，182 (1990)]、原生質球方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,4889 (1984)]和乙酸鋰方法 Γ.Τ. Bacteriol. , 153, 163(1983)]。在使用動物細胞作為宿主細胞的情況下，可以使用pcDNAI、pcDM8 (可以從 Funakoshi Co.，Ltd.商購)、pAGE107 (特開平 03-22979)、pAS3_3 (特開平 02-227075)、 dCDM8「Nature, 329,840 (1987) 1、pcDNAI/Amp (由 Invitrogen Corp.制造)、pREP4(由 Invitrogen Corp.制造)、pAGE103 [J. Biochem. , 101,1307 (1987) ]、pAGE210、pAMo、pAMoA 等作為表達載體。作為啟動子，可以使用任何啟動子，只要它在動物細胞中起作用即可，其實例包括巨細胞病毒(CMV)的立即早期(IE)基因啟動子、SV40早期啟動子或金屬硫蛋白啟動子、反轉錄病毒的啟動子、熱休克啟動子、SRa啟動子等。此外，人類CMV的IE基因的增強子可以與啟動子組合使用。宿主細胞的實例包括小鼠骨髓瘤細胞、大鼠骨髓瘤細胞、小鼠雜交瘤細胞、人類細胞的Namalwa細胞和Namalwa KJM-I細胞、人類胚胎腎細胞、人類白血病細胞、非洲綠猴腎細胞、源自中華倉鼠的CHO細胞、和HBT5637 (特開昭63-299)。小鼠骨髓瘤細胞包括SP2/0和NSO ；大鼠骨髓瘤細胞包括YB2/0 ；人類胚胎腎細胞包括HEK293(ATCC CRL-1573)；人類白血病細胞包括BALL-I ；非洲綠猴腎細胞包括COS-I和 C0S-7。作為將重組DNA導入動物細胞的方法，可以使用任何方法，只要它能夠將DNA導入動物細胞中即可，其實例包括電穿孔方法[CytOtechnOlOgy，l，133(1990)]、磷酸鈣方法(特開平 02-227075)、脂轉染方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84 7413 (1987)]以及在 Virology, 52,456(1973)中描述的方法。在使用昆蟲細胞作為宿主的情況下，可以例如使用在下述文獻中描述的方法來生產蛋白《桿狀病毒表達載體，實驗室手冊》(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual), W. H. Freeman and Company, New York (1992)；《分子生物學現代方法》(Current Protocols in Molecular Biology)；《分子生物學實驗室手冊》(Molecular Biology, A Laboratory Manual) ；Bio/Technology,6,47(1988)等。具體來說，可以通過將重組基因轉移載體和桿狀病毒共同導入昆蟲細胞以在昆蟲細胞的培養上清液中獲得重組病毒，然后使用重組病毒感染昆蟲細胞，來生產蛋白。在該方法中使用的基因轉移載體的實例包括pVL1392、pVL1393和 PBlueBacIII (者β由 Invitrogen Corp.帝[J造)。作為桿狀病毒，可以使用感染夜蛾科盜夜蛾亞科(Noctuidae Hadeninae)昆蟲的病毒——苜蓿銀紋夜蛾(Autographa californica)核型多角體病毒。作為昆蟲細胞，可以使用草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢細胞、源自于蠶卵巢的培養細胞等。草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的卵巢細胞包括Sf9和Sf21 (《桿狀病毒表達載體，實驗室手冊》(Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual))；粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)的卵巢細胞包括High 5 和 BTI-TN-5B1-4 (Invitrogen Corp.)； 源自于蠶卵巢的培養細胞包括家蠶(Bombyx mori)N4。用于將上面提到的重組基因轉移載體和上面提到的桿狀病毒共同導入昆蟲細胞中以制備重組病毒的方法的實例，包括磷酸鈣方法(特開平02-22707 和脂轉染方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA,Μ，7413 (1987)]。在使用植物細胞作為宿主細胞的情況下，可以使用Ti質粒或煙草花葉病毒載體作為表達載體。作為啟動子，可以使用任何啟動子，只要它能夠在植物細胞中起作用即可，其實例包括花椰菜花葉病毒(CaMV)的35S啟動子和水稻肌動蛋白1啟動子。宿主細胞的實例包括煙草、土豆、番茄、胡蘿卜、大豆、油菜、苜蓿、水稻、小麥、大麥等的植物細胞。作為將重組載體導入植物細胞的方法，可以使用任何方法，只要它能夠將DNA導入植物細胞即可，其實例包括使用土壤桿菌的方法(特開昭59-140885，特開昭60-70080， WO 94/00977)、電穿孔方法(特開昭60-251887)和使用粒子槍(基因槍)的方法(特許第 2606856 號和特許第 No. 2517813 號)。6.生產本發明蛋白的方法可以通過將使用上述5的方法獲得的轉化體在培養基中進行培養，使本發明的蛋白在培養物中形成和積累，并從培養物收集蛋白，來生產本發明的蛋白。上面提到的用于生產本發明的蛋白的轉化體的宿主可以是任何宿主，例如細菌、 酵母、動物細胞、昆蟲細胞或織物細胞，并且其優選為細菌、更優選為屬于埃希氏桿菌屬的微生物，更加優選為屬于大腸埃希氏桿菌的微生物。在使用酵母、動物細胞、昆蟲細胞或植物細胞進行表達的情況下，可以獲得附有糖或糖鏈的蛋白。在培養基中培養上面提到的轉化體的方法，可以按照培養宿主的通用方法來進行。作為培養使用原核生物例如大腸埃希氏桿菌或真核生物例如酵母作為宿主獲得的轉化體的培養基，可以使用天然培養基和合成培養基中的任一種，只要它是含有能夠被生物體同化的碳源、氮源、無機鹽等、并且轉化體能夠在其中有效培養的培養基即可。作為碳源，可以使用能夠被生物體同化的任何碳源，并且可以使用糖類例如葡萄糖、果糖、蔗糖、含有它們的糖蜜、淀粉或淀粉水解物，有機酸例如乙酸和丙酸，以及醇類例如乙醇和丙醇。作為氮源，可以使用氨、有機或無機酸的銨鹽例如氯化銨、硫酸銨、乙酸銨和磷酸銨、和其他含氮化合物，以及蛋白胨、肉類抽提物、酵母提取物、玉米漿、酪蛋白水解物、大豆餅、大豆餅水解物和各種發酵性微生物細胞，及其消化產物。
作為無機鹽，可以使用磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鎂、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸銅、碳酸鈣等。培養通常在有氧條件下進行，例如通過振搖培養或深部通氣攪拌培養。培養溫度優選為15至40°C，培養時間通常為5小時至7天。在培養過程中pH維持在3.0至9.0。pH 的調節通過使用有機或無機酸、堿溶液、尿素、碳酸鈣、氨等來進行。當需要時，在培養過程中可以向培養基添加抗生素例如氨芐青霉素和四環素。當對使用誘導型啟動子作為啟動子的表達載體所轉化的微生物進行培養時，在需要時可以向培養基添加誘導物。例如，當對使用k啟動子的表達載體所轉化的微生物進行培養時，可以向培養基添加異丙基- β -D-硫代半乳糖吡喃糖苷等；并且當對使用iin啟動子的表達載體所轉化的微生物進行培養時，可以向培養基添加吲哚丙烯酸等。作為培養使用動物細胞作為宿主獲得的轉化體的培養基，可以使用一般使用的培養基，例如 RPMI1640 培養基[J. Am. Med. Assoc. ,199,519(1967)], Eagle' s MEM 培養基 「Science, 122,501 (1952) 1、DMEM 培養基[Virology, 8, 396 (1959)]和 199 培養基[Proc. Soc. Biol. Med. ,73,1 (1950)]，或已經向這些培養基添加過胎牛血清等的培養基。培養通常在pH6至8、25°C至40°C、存在5% CO2等的條件下進行1至7天。在需要時，可以在培養過程中向培養基添加抗生素例如卡那霉素、青霉素和鏈霉
ο作為培養使用昆蟲細胞作為宿主獲得的轉化體的培養基，可以使用一般使用的培養基，例如TNM-FH培養基(由Pharmingen，Inc.制造)、Sf-900 II SFM培養基(由Life Technologies, Inc.制造)、ExCell 400 和 ExCell 405 ( 二者均由 JRH Biosciences，Inc. 制造)和 Grace' s 昆蟲培養基「Nature，195，788 (1962) 1。培養通常在pH6至7、25°C至30°C等的條件下進行1至5天。在需要時，可以在培養過程中向培養基添加抗生素例如慶大霉素。使用植物細胞作為宿主獲得的轉化體，可以作為細胞或在分化成植物細胞或植物器官后進行培養。作為培養轉化體的培養基，可以使用一般使用的培養基，例如Murashige 和Skoog(MQ培養基、White培養基以及已經向這些培養基中添加了植物激素例如植物生長素和細胞分裂素的培養基。培養通常在pH5至9、25°C至40°C的條件下進行3至60天。在需要時，可以在培養過程中向培養基添加抗生素例如卡那霉素和潮霉素。用于生產本發明的蛋白的方法，包括在宿主細胞內生產的方法、分泌到宿主細胞外的方法以及在宿主細胞外膜上生產的方法。待生產的蛋白的結構可以根據所選的方法而變。當本發明的蛋白在宿主細胞中或宿主細胞外膜上產生時，可以通過使用Paulson 等的方法[J. Biol. Chem.，264，17619 (1989) 1、Lowe 等的方法[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227(1989) ；Genes Develop.，i，1288 (1990)]或在特開平 05-336963、WO 94/23021 中描述的方法等，將蛋白主動分泌到宿主細胞外。具體來說，可以使用遺傳工程技術，將信號肽添加到含有本發明蛋白的活性位點的蛋白的上游，通過產生這種形式的蛋白將本發明的蛋白主動分泌到宿主細胞外。也可以按照特開平02-227075中描述的方法，利用使用二氫葉酸還原酶基因等的基因擴增系統，來增加生產水平。此外，通過將已導入基因的動物或植物細胞重新分化，可以構建已導入基因的動物(非人類轉基因動物)或植物(轉基因植物)，并且這可用于生產本發明的蛋白。當生產本發明蛋白的轉化體是動物或植物時，可以通過按照通用方法飼養或培養動物或植物，使蛋白形成并積累，并且從動物或植物收集蛋白，來生產蛋白。使用動物生產本發明的蛋白的方法，包括例如在按照已知方法通過基因導入而構建的動物中生產本發明蛋白的方法[Am. J.Clin. Nutr.，63,639S (1996) ； Am. J. Clin. Nutr.,63,627S(1996) ；Bio/Technology,9,830(1991)] 在動物的情況下，可以通過例如飼養已經導入本發明的DNA或在本發明的生產方法中使用的DNA的非人類轉基因動物，使蛋白在動物形成并積累，以及從動物回收蛋白，來生產本發明的蛋白。蛋白在動物中形成和積累的場所包括動物的乳汁(特開昭 63-309192)、蛋等。作為在該方法中使用的啟動子，可以使用任何啟動子，只要它能在動物中起作用即可，例如可以適合地使用乳腺細胞特異性啟動子如α酪蛋白啟動子、β酪蛋白啟動子、β乳球蛋白啟動子和乳清酸性蛋白啟動子。使用植物生產本發明蛋白的方法，包括例如按照已知方法對已導入編碼本發明蛋白的DNA的轉基因植物進行培養[組織培養，巡(1994)；組織培養，11(1995) ；Trends Biotechnol.，邊，45 (1997)]，使蛋白在植物中形成和積累，并從植物收集蛋白，從而生產蛋白的方法。作為用于分離/純化通過使用產生本發明蛋白的轉化體所生產的本發明蛋白的方法，可以使用分離和純化酶的通用方法。例如，當本發明的蛋白在細胞中以可溶狀態生產時，在培養完成后通過離心收集細胞，將其懸浮在水性緩沖液中，然后使用超聲波破碎機、French壓力器、Manton Gaul in均漿機、Dynomill等進行破碎，以獲得無細胞提取物。從無細胞提取物離心所獲得的上清液中，可以單獨或組合使用用于分離和純化酶的通用方法來獲得純化的制備物。通用方法包括溶劑萃取、使用硫酸銨等鹽析、脫鹽、 使用有機溶劑沉淀、使用樹脂例如二乙基氨基乙基(DEAE)-瓊脂糖或DIAION HPA-75 (由三菱化成社制造)進行陰離子交換層析、使用樹脂例如S-瓊脂糖FF(由GE Healthcare Biosciences制造)進行陽離子交換層析、使用樹脂例如丁基瓊脂糖和苯基瓊脂糖進行疏水層析、使用分子篩進行凝膠過濾、親和層析、層析聚焦以及電泳例如等電聚焦。當蛋白在細胞中以不溶體形式生產時，同樣地收集和破碎細胞，離心以獲得沉淀級份，在通過常用方法從沉淀級份中回收蛋白后，使用蛋白變性劑將蛋白的不溶體溶解。通過用不含蛋白變性劑的溶液或所含蛋白變性劑的濃度低至不使蛋白變性的溶液對溶解的溶液進行稀釋或透析，將蛋白構造成具有正常的三維結構，然后使用與上述相同的方法分離和純化蛋白，可以獲得純化的制備物。當本發明的蛋白或其衍生物例如糖修飾的形式被分泌到細胞外時，可以從培養上清液中回收蛋白或其衍生物例如糖附加體的形式。具體來說，將培養物用與上述相似的方式例如離心進行處理，以獲得可溶級份，并且可以通過使用與上述相似的分離和純化方法，從可溶級份中獲得純化的制備物。以上述方式獲得的蛋白的實例包括含有SEQ ID NO :1所顯示的氨基酸序列的蛋白。此外，本發明的蛋白可以作為與另一種蛋白的融合蛋白來生產，并使用對融合蛋白具有親和性的物質，利用親和層析來純化。例如，本發明的蛋白可以按照Lowe等的方法 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227 (1989) ；Genes Develop. ,4,1288(1990)]或在特開平 05-336963和WO 94/23021中描述的方法，作為與蛋白A的融合蛋白來生產，并使用免疫球蛋白G通過親和層析來純化。本發明的蛋白也可以作為與Flag肽的融合蛋白來生產，并使用抗Flag抗體通過親和層析來純化[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,8227 (1989) ；Genes Develop. ,4, 1288 (1990)]，或者它可以作為與聚組氨酸的融合蛋白來生產，并使用對聚組氨酸具有高親和性的金屬配位的樹脂，通過親和層析來純化。此外，可以使用針對蛋白自身的抗體，通過親和層析來純化蛋白。本發明的蛋白可以基于上面獲得的蛋白的氨基酸序列信息，通過化學合成方法例如Fmoc方法(芴基甲氧羰基方法)和tBoc方法(叔丁氧羰基方法)來生產。此外， 蛋白可以使用來自 Advanced ChemTechΛ Perkin-ElmerΛ Pharmacia、Protein Technology Instrument、SynthecelI-VegaΛ PerSeptive、Shimadzu Corporation 等公司的月太合成儀進行化學合成。7.使用本發明的蛋白測量糖化蛋白的方法本發明的蛋白通過作用于糖化蛋白被蛋白酶作用后從糖化蛋白所產生的糖化肽而具有產生過氧化氫的特點；因此，它們可用于測量各種類型樣品中的糖化蛋白。具體來說，可以通過將樣品與蛋白酶反應以產生糖化肽，將產生的糖化肽與本發明的蛋白反應，并測量由糖化肽與本發明的蛋白之間的反應所產生的物質或在糖化肽與本發明的蛋白之間的反應中所消耗的物質，來測量樣品中的糖化蛋白。與樣品中糖化蛋白的測量相關的反應可以如下所述在水性介質中進行。本發明的糖化蛋白是例如糖化血紅蛋白例如血紅蛋白 Alc或糖化白蛋白；它優選為糖化血紅蛋白，特別優選為血紅蛋白Ale。本發明的測量方法描述如下。待測量的樣品和對象對于在本發明的測量方法中使用的樣品沒有具體限制，只要它們含有糖化蛋白即可，其實例包括生物樣品例如全血、血漿、血清、血細胞、細胞樣品、尿液、腦脊液、汗液、淚液、唾液、皮膚、黏膜和毛發以及食物。作為樣品，全血、血漿、血清、血細胞等是優選的，全血、血細胞等是特別優選的。全血包括來自于全血的血細胞級份與血漿混合的樣品。對于這些樣品來說，可以使用進行過預處理例如溶血、分離、稀釋、濃縮和純化的樣品。血紅蛋白是由α-鏈和β-鏈的兩個多肽構成的四聚體，分子量為64，500。血紅蛋白α-鏈的N-端三個氨基酸的序列是纈氨酸-亮氨酸-絲氨酸，β-鏈的N-端三個氨基酸的序列是纈氨酸-組氨酸-亮氨酸。血紅蛋白Alc被定義為其中β-鏈的N-端纈氨酸被糖化的血紅蛋白。此外，已知血紅蛋白在分子中具有多個糖化位點(The Journal of Biological Chemistry(1980)，256，3120-3127)。通過使蛋白酶作用于含糖化血紅蛋白的樣品，產生了糖化氨基酸和/或糖化寡肽，例如源自于其中鏈N-端纈氨酸殘基被糖化的糖化血紅蛋白的α-果糖基纈氨酸 (在后文中簡稱為α-FV)和α-FVH，源自于其中α -鏈N-端纈氨酸殘基被糖化的糖化血紅蛋白的α-FV和α-果糖基纈氨酰亮氨酸(在后文中簡稱為a-FVL)，以及源自于α-鏈和/或β-鏈內的賴氨酸殘基的ε-氨基的糖化的ε H此外，當樣品是全血時，也從全血中糖化血紅蛋白之外的糖化蛋白、例如糖化白蛋白產生糖化氨基酸，例如ε-Π(。因此，當使蛋白酶作用于含純化血紅蛋白的樣品或含全血的樣品時，產生了例如 a -FVH、a -FV、ε -FK禾口 a -FVL，其中a -FVH禾口 a -FVL源自于糖化血紅蛋白，a -FVH特異性源自于血紅蛋白Ale。因此，當測量血紅蛋白Alc時，人們可以特異性測量a-FVH。本發明的蛋白對 a -FVH具有高度反應性，并對ε -FK具有低反應性；因此，能夠有效測量血紅蛋白Ale。蛋白酶作為可以在本發明中使用的蛋白酶，可以使用任何蛋白酶，只要它能作用于樣品中包含的待測糖化蛋白即可，其實例包括源自于動物、植物和微生物的蛋白酶、金屬蛋白酶、內切蛋白酶、外切蛋白酶、絲氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、酸性蛋白酶、堿性蛋白酶和巰基蛋白酶。源自于動物的蛋白酶的實例包括彈性蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、牛胰蛋白酶、源自于豬肝的亮氨酸氨肽酶、組織蛋白酶、需鈣蛋白酶、I型蛋白酶、XX型蛋白酶(以上由Sigma制造)、氨肽酶M、羧肽酶A(以上由Boehringer Marmheim制造)和胰液素(由 Wako Pure Chemical Industries Ltd.和 Sigma 制造)。源自于植物的蛋白酶的實例包括激肽釋放酶、無花果蛋白酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、菠蘿蛋白酶、羧肽酶W(以上由Sigma制造)、木瓜蛋白酶W-40和菠蘿蛋白酶F(以上由 Amano Enzyme Inc.制造)。源自于微生物的蛋白酶的實例包括下列(1至(14)。(1)源自于芽孢桿菌的蛋白酶枯草桿菌蛋白酶、VIII型蛋白酶、IX型蛋白酶、X型蛋白酶、XV型蛋白酶、XXIV型蛋白酶、XXVII型蛋白酶、XXXI型蛋白酶、VII型蛋白酶、源自于地衣芽胞桿菌(Bacillus licheniformis)的蛋白酶(以上由Sigma制造)、嗜熱菌蛋白酶 (由和光純藥工業社制造)、0rientase-90N、0rientase-10NL、0rientase-22BF、Orientase Y> 0rientase-5BL> Nucleisin(HBI Enzymes Inc. ) > Proleather
酶 NL “Amano”、蛋白酶 S “Amano”G、蛋白酶 N “Amano”G(以上由 Amano Enzyme Inc.制造)、GODO-BNP, GODO-BAP, GODO高純度蛋白酶(以上由合同酒精社制造)、Protin-AClOF, Protin-NL10、Protin-NC25、Protin-NY10、Protin-PC10F、Protin-PS10、Deskin、D印irays、 Biosoke、Thermoase-PCIOF、嗜熱菌蛋白酶(以上由大和化成社制造)、Toyozyme NEP、中性蛋白酶(以上由東洋紡織社制造)、Neutrase、Esperase、Savinase、Dyrazym, Bio-Feed Pro、Alcalase、NUE、Pyrase、Clear Lens-Pro、Evelase、Novozyme-FM、volan (以上由 Novo Nordisk Bioindustry 制造)、Enzylon-NBS、Enzylon-SA (以上由洛東化成工業社制造)、 Nagarse> Biopullase APL-30、Biopullase SP-4FG、Biopullase XL-416F、Biopullase AL-15FG、果膠酶 XP-534(以上由 Nagase ChemteX Corp.制造)、Aroase AP-10、蛋白酶 YB(以上藥品工業社制造)、Colorase-N、Colorase-7089、Belon ff(以上由樋口商會社制造)、Chirazyme P-1、分散酶(以上由Roche制造)、&itilysin (以上由Boehringer Mannheim制造)、蛋白酶N、蛋白酶細菌枯草桿菌蛋白酶(以上由Fluka制造)、鏈霉蛋白酶E (由科研制藥社制造)等。(2)源自于曲霉的蛋白酶XIII型、XIX型、XXIII型蛋白酶(以上由Sigma制造)、 Sumiζyme-MP、Sumiζyme-AP、Sumizyme-LP L>Sumizyme-LP20>Sumizyme-FP>Enζyme Ρ_3(以上由新日本化學工業株式會社制造)、0rientase-20A、Orientase-ONS、0rientase_0N5、 Tetrase S (以上由 HBI Enzymes Inc.制造)、Umamizyme G、Neurase A、Neurase F3G、蛋白酶-A “Amano”G、蛋白酶K “Amano”、蛋白酶M “Amano”G、蛋白酶P “Amano”3G(以上由天野酶制品工業會社制造)、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶、Morsin、AO蛋白酶、肽酶(以上由 Kikkoman 制造)、Protin-F、Protin-FN、Protin-FA(以上由大和化成社制造)、Denapsin 2P、Denazyme-SA-7、Denazyme_AP、Denazyme AP(以上由Nagase ChemteX Corp.制造)、蛋白酶 YP-SS、Pantidase-NP-2、Pantidase-P (以上由 Yakult 藥品工業社制造)、Sakanase (由科研制藥社制造)、Flavorzyme (由 Novo Nordisk Bioindustry 制造),Belon PS (由樋口商會社制造)、蛋白酶6 (由Fluka制造)、蛋白酶A5 (由協和化成社制造)等。(3)源自于根霉(Rhizopus)的蛋白酶=XVIII型蛋白酶(由Sigma制造)、肽酶R、 Neurase F (以上由天野酶制品工業會社制造)、XP-415 (由Nagase ChemteX Corp.制造)寸。(4)源自于青霉(Penicillium)的蛋白酶PD酶(由Kikkoman Corp.制造)、蛋白酶B "Amano"(由天野酶制品工業會社制造)、Deoxin 1(由Nagase ChemteX Corp.制造)等。(5)源自于鏈霉菌的蛋白酶XIV型蛋白酶(也稱為鏈霉蛋白酶)、XXI型蛋白酶 (以上由Sigma制造)、Actinase-AS、Actinase-AF、Actinase-E (以上由科研制藥社制造)、 嗜堿性蛋白酶(由東洋紡織社制造)、鏈霉蛋白酶E(由Roche、Calbiochem-Novabiochem和 Sigma制造)、鏈霉蛋白酶(由Boehringer Mannheim制造)等。(6)源自于葡萄球菌Staphylococcus)的蛋白酶XVII型蛋白酶(由Sigma制造)、內切蛋白酶Glu-C(由Boehringer Mannheim制造)、V8蛋白酶(由TAKARA和和光純藥社制造)等。(7)源自于梭菌(Clostridium)的蛋白酶梭菌蛋白酶、非特異性中性蛋白酶、IA 型膠原酶(以上由Sigma制造)等。(8)源自于溶桿菌(Lysobacter)的蛋白酶內切蛋白酶Lys-C (由Sigma制造)寸。(9)源自于奇果菌(Grifola)的蛋白酶金屬內肽酶(由Sigma制造)。 (10)源自于酵母菌的蛋白酶蛋白酶A (由Sigma制造)、羧肽酶Y (由Boehringer Mannheim 制造)等。(11)源自于麥軸梗霉(Tritirachium)的蛋白酶蛋白酶K(由Sigma、Roche和和光純藥社制造)等。(12)源自于棲熱菌(Thermus)的蛋白酶氨肽酶T(由Boehringer Mannheim制造)等。(13)源自于假單胞菌的蛋白酶內切蛋白酶Asp-N(由和光純藥工業社制造)等。(14)源自于無色菌(AchromcAacter)的蛋白酶賴氨酰內肽酶、無色肽酶(以上由和光純藥社制造)、AP-I (由TAKARA制造)等。
在本發明的測量方法中，源自于芽孢桿菌、曲霉、鏈霉菌和麥軸梗霉的蛋白酶是優選的，因為它們對人類血紅蛋白的效應大，并且源自于芽孢桿菌的蛋白酶是特別優選的。金屬蛋白酶的實例包括嗜熱菌蛋白酶和蛋白酶N。內切蛋白酶的實例包括嗜熱菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。外切蛋白酶的實例包括氨肽酶和羧肽酶。絲氨酸蛋白酶的實例包括耐熱蛋白酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶、纖溶酶和彈性蛋白酶。半胱氨酸蛋白酶的實例包括木瓜蛋白酶和胱天蛋白酶。酸性蛋白酶的實例包括胃蛋白酶和組織蛋白酶D。堿性蛋白酶的實例包括Orientase 22BF。巰基蛋白酶的實例包括木瓜蛋白酶、無花果蛋白酶和菠蘿蛋白酶。反應溶液中的蛋白酶濃度優選為0. 01U/mL至100，000U/mL,更優選為0. lU/mL至 10，000U/mL。此外，在本發明中可以組合使用兩種以上類型的酶。在本發明中使用的蛋白酶優選是無色的，例如蛋白酶的l，000U/mL水性溶液在 300nm至800nm波長處的吸光度優選為IOOmAbs以下、更優選為0至lOmAbs。作為蛋白酶， 優選的是通過各種類型的層析、鹽析、透析、活性炭處理等純化、并且其上述吸光度被降低的蛋白酶。在本發明的測量方法中，反應溶液中酶、即本發明蛋白的濃度優選為0.01U/mL 至 1，000U/mL,更優選為 0. lU/mL 至 100U/mL。測量方法本發明的樣品中的待測糖化蛋白可以通過連續執行下列步驟⑴到(iii)來測量(i)通過將樣品與蛋白酶進行反應來產生糖化肽；(ii)將形成的糖化肽與本發明的蛋白進行反應；以及(iii)測量步驟(ii)中形成或消耗的物質。上面提到的步驟⑴到(iii)可以在水性介質中進行。水性介質的實例包括去離子水、蒸餾水和緩沖溶液；并且緩沖溶液是優選的。在緩沖溶液中使用的緩沖劑的實例包括三(羥甲基)氨基甲烷緩沖劑(Tris緩沖劑)、磷酸緩沖劑、硼酸緩沖劑和Good’ s緩沖劑。Good’ s緩沖劑的實例包括2-嗎啉乙磺酸(MES)、雙(2_羥乙基)亞氨基三(羥甲基)甲烷(Bis-Tris)、N-乙酰胺基)亞氨基二乙酸(ADA)、哌嗪-N，N，-雙乙磺酸) (PIPES)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(ACEQ、3_嗎啉-2-羥基丙磺酸(M0PS0)、N，N_雙 (2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、3-嗎啉丙磺酸(MOPS)、N-[三(羥甲基)甲基]_2_氨基乙磺酸(TES)、2-W-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]乙磺酸(HEPEQ、3-[N，N-雙(2-羥基乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸(DIPSO)、N-[三(羥基甲基)甲基]-2-羥基-3-氨基丙磺酸(TAPSO)、哌嗪-N, N，-雙(2-羥基-3-丙磺酸)(P0PS0)、3-[4_(2_羥基乙基)_1_哌嗪基]-2-羥基丙磺酸(HEPPSO)、3-W-(2-羥基乙基)-1-哌嗪基]丙磺酸[(H)EPPS]、N-[三 (羥基甲基)甲基]-甘氨酸(Tricine)、N，N-雙(2-羥基乙基)甘氨酸(Bicine)、N_三(羥基甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、N-環己基-2-氨基乙磺酸(CHES)、N-環己基-3-氨基-2-羥基丙磺酸(CAPSO)和N-環己基-3-氨基丙磺酸(CAPS)。對緩沖劑的濃度沒有具體限制，只要它適合于測量即可，但是濃度優選為 0. 001mol/L 至 2. 0mol/L、更優選為 0. 005mol/L 至 1. 0mol/L。
對于每個步驟中的反應來說，反應溫度是例如10°C至50°C、優選為20°C至40°C， 并且反應時間是1秒至60分鐘，優選為1至10分鐘。如果蛋白酶不影響步驟(ii)的反應，它不必在執行步驟⑴的反應后特意失活； 但是，可以進行加熱、冷卻、離心、膜過濾、添加抑制劑等，以使酶在步驟(ii)中不起作用。在步驟(ii)中，由于糖化肽與本發明的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白之間的反應而在反應溶液中形成的產物包括過氧化氫、鄰酮醛糖(α-酮基醛)和肽。此外，在步驟(ii)中，被糖化肽與本發明的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白之間的反應所消耗的物質是例如氧分子。在步驟(ii)中消耗的氧分子通過例如使用氧電極的電化學測量方法來測量。在本發明的步驟(ii)中產生的過氧化氫可以使用例如光學技術或電化學技術來測量。光學技術的實例包括吸光度法和發光法。具體實例包括使用測量過氧化氫的試劑的光學測定和使用過氧化氫電極的電化學測定。用于測量過氧化氫的試劑是用于將所產生的過氧化氫轉變成可檢測物質的試劑。 可檢測物質的實例包括色素和光；并且色素是優選的。當可檢測物質是色素時，用于測量過氧化氫的試劑包括過氧化活性物質例如過氧化物酶和氧化發色型色原體。氧化發色型色原體的實例包括氧化偶聯型色原體和無色型色原體，其在后面描述。當可檢測物質是光時，用于測量過氧化氫的試劑包括化學發光物質。生物發光物質包括在化學發光物質中，其實例包括魯米諾、異魯米諾、光澤精、吖啶酯和草酸酯。當使用含有過氧化活性物質例如過氧化物酶和氧化發色型色原體的試劑作為測量過氧化氫的試劑時，可以通過將過氧化氫與氧化發色型色原體在過氧化活性物質存在下進行反應以形成色素，然后測量形成的色素，來測量過氧化氫。此外，當使用含有化學發光物質的試劑測量過氧化氫時，可以通過將過氧化氫與化學發光物質進行反應以形成光子， 然后測量形成的光子，來測量過氧化氫。氧化偶聯型色原體是在過氧化活性物質例如過氧化物酶存在下與過氧化氫反應、 通過氧化偶聯反應產生色素的色原體。氧化偶聯型色原體的具體實例包括偶聯劑例如 4-氨基安替比林和酚類或苯胺類氫供體。偶聯劑和酚類或苯胺類氫供體化合物在過氧化氫和過氧化活性物質存在下經歷氧化偶聯，以產生色素。偶聯劑的實例包括4-氨基安替比林G-AA)和3-甲基_2_苯并噻唑啉酮腙。酚類氫供體的實例包括苯酚、4-氯苯酚、3-甲基苯酚和3-羥基-2，4，6_三碘苯甲酸(HTIB)。苯胺類氫供體的實例包括N-(3_磺丙基)苯胺、N-乙基-N_(2-羥基_3_磺丙基)-3-甲基苯胺(TOOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲基苯胺(MAOS)、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺(DAOS)、N-乙基-N-(3-磺丙基)_3_甲基苯胺(TOPS)、N-(2-羥基-3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、N，N-二甲基-3-甲基苯胺、N, N- 二(3-磺丙基)_3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)_3_甲氧基苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-磺丙基)-3，5-二甲氧基苯胺、N-(3-磺丙基)-3，5- 二甲氧基苯胺、N-乙基-N- (3-磺丙基)-3，5 二甲基苯胺、N-乙基-N- (2-羥基-3-磺丙基)-3-甲氧基苯胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)苯胺、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-琥珀酰乙二胺(EMSE)、N-乙基-N-(3-甲基苯基)-N，-乙酰基乙二胺、N-乙基-N-(2-羥基-3-磺丙基)-4-氟_3，5- 二甲氧基苯胺(F-DAOS)、N-[2-(琥珀酰氨基) 乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(MASE)和N-乙基-N-[2-(琥珀酰氨基)乙基]-2-甲氧基-5-甲基苯胺(Et-MASE)。無色型色原體是在過氧化活性物質例如過氧化物酶存在下通過與過氧化氫反應自身產生色素的色原體。具體實例包括10-N-羧甲基氨甲酰基-3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪(CCAP)、10-N-甲基氨甲酰基_3，7-雙(二甲基氨基)-10H-吩噻嗪 (MCDP)、N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’_雙(二甲基氨基)二苯胺鈉鹽(DA-64)、10-(羧甲基氨基羰基)-3，7-雙(二甲基氨基)吩噻嗪鈉鹽(DA-67)、4，4’_雙(二甲基氨基)二苯胺、 雙[3-雙(4-氯苯基)甲基-4- 二甲基氨基苯基]胺(BCMA) N，N，N，，N，，N”，N” -六-3-磺丙基-4，4’，4”-三氨基三苯基甲烷(TPM-PQ、二氨基聯苯胺、羥基苯基丙酸、四甲基聯苯胺和鄰苯二胺。在過氧化氫的測量中，對于過氧化活性物質的濃度沒有具體限制，只要它適合于測量即可；并且，當過氧化物酶用作過氧化活性物質時，濃度優選為lU/mL至100U/mL，更優選為2U/mL至50U/mL。對于氧化發色型色原體的濃度沒有具體限制，只要它適合于測量即可；并且它優選為0. 01g/L至10g/L,更優選為0. 02g/L至5g/L。當使用過氧化氫電極測量過氧化氫時，對于所使用的電極沒有具體限制，只要它是允許使用過氧化氫傳遞電子的材料即可，其實例包括鉬、金和銀。作為測量方法，可以使用已知方法例如電流測定法、電勢測定法和電量測定法。通過在電極與氧化酶或底物之間的反應中介入電子傳遞物質，也可以測量得到的氧化或還原電流或其電量。任何具有傳遞電子功能的物質都可以用作電子傳遞物質，其實例包括物質例如二茂鐵衍生物和醌衍生物。此外，通過在電極與氧化酶反應所產生的過氧化氫之間介入電子傳遞物質，可以測量得到的氧化或還原電流或其電量。在步驟(ii)中，鄰酮醛糖(α-酮基醛)與過氧化氫一起產生；因此，也可以通過測量產生的鄰酮醛糖(α-酮基醛)來測量樣品中的血紅蛋白Ale。通過使葡萄糖氧化酶作用于α-酮基醛，并通過也測量產生的過氧化氫，可以獲得高靈敏性測量(特開 )。制備樣品的方法在需要時，可以從生物樣品分離待測量的含有糖化蛋白的樣品。分離方法包括離心、過濾和使用血細胞分離膜的方法。例如，通過離心進行的分離方法可以將全血分離成血細胞和血漿或血清。在需要時，可以用等滲溶液例如生理鹽水溶液洗滌血細胞，以獲得已從其中除去源自血漿的組分的洗過的血細胞。當使用血細胞作為樣品時，可以通過用低滲溶液稀釋含有血細胞的樣品例如全血、血細胞或洗過的血細胞，來進行溶血。可以使用任何低滲溶液，只要它能引起血細胞溶血即可；其實例包括水和緩沖液，并且低滲溶液優選含有添加劑例如表面活性劑。表面活性劑的實例包括非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、陰離子型表面活性劑和兩性表面活性劑。用于制備洗過的血細胞的方法包括下述方法。從健康人和糖尿病患者收集血液，通過倒轉進行混合，然后在25°C離心(3，OOOrpm) 5分鐘。在離心后，除去上清血漿。對于一份下層部分的血細胞層，加入四份生理鹽水溶液，通過倒轉將其混合，并在25°C離心(3，OOOrpm) 5分鐘。離心后，除去上清生理鹽水溶液。在重復該清洗操作三次后，向一份洗過的血細胞層加入九份蒸餾水，這將產生洗過的血細胞。用于測量糖化蛋白的試布丨和試劑念本發明的用于測量糖化蛋白的試劑和用于測量糖化蛋白的試劑盒，可用于本發明的測量糖化蛋白的方法中。本發明的用于測量糖化蛋白的試劑可以采取試劑盒的形式作為適合于儲存、運輸和配送的形式。試劑盒形式的實例包括雙試劑系統和三試劑系統。本發明的用于測量糖化蛋白的試劑包括蛋白酶以及本發明的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。此外，本發明的用于測量糖化蛋白的試劑可以包括用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的實例包括過氧化氫、鄰酮醛糖(α-酮基醛) 和肽。用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑的實例，包括用于測量過氧化氫的試劑、用于測量鄰酮醛糖(α-酮基醛)的試劑和用于測量肽(Val-His)的試劑；并且用于測量過氧化氫的試劑是優選的。本發明的用于測量待測糖化蛋白的試劑盒的實例，包括下述實施方案的試劑盒-試劑盒1(雙試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列兩種試劑(1)包含蛋白酶的試劑；以及(2)包含本發明的蛋白的試劑。-試劑盒2(雙試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列兩種試劑(1)包含蛋白酶的試劑；以及(2)包含本發明的蛋白的試劑，以及用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。-試劑盒3(雙試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列兩種試劑(1)包含蛋白酶的試劑和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；以及(2)包含本發明的蛋白的試劑。-試劑盒4(雙試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列兩種試劑(1)包含蛋白酶的試劑和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；以及(2)包含本發明的蛋白的試劑，以及用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。-試劑盒5 (三試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列三種試劑(1)包含蛋白酶的試劑；
(2)包含本發明的蛋白的試劑；以及(3)用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。-試劑盒6(三試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列三種試劑(1)包含蛋白酶的試劑和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；(2)包含本發明的蛋白的試劑；以及(3)用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。-試劑盒7 (三試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列三種試劑(1)包含蛋白酶的試劑；(2)包含本發明的蛋白的試劑和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；以及(3)用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。-試劑盒8(三試劑系統試劑盒)試劑盒包含下列三種試劑(1)包含蛋白酶的試劑和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；(2)包含本發明的蛋白的試劑和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑；以及(3)包含用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑的試劑。在本發明的用于測量的試劑和試劑盒中使用的每種蛋白酶、本發明的蛋白、糖化蛋白、和用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑的實例，包括上面所提到的。當用于測量由本發明的蛋白與從糖化蛋白產生的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑是用于測量過氧化氫的試劑時，用于測量過氧化氫的試劑的實例包括上面提到的用于測量過氧化氫的試劑。當使用氧化偶聯類型色原體作為測量過氧化氫的試劑時，偶聯劑和酚類或苯胺類氫供體可以包含在同一試劑中；并且它們優選包含在分開的試劑中。本發明的用于測量的試劑和用于測量的試劑盒還可以包含用于測量的標準品例如標準蛋白。當需要時，本發明的用于測量的試劑和用于測量的試劑盒可以包含緩沖劑、穩定劑、防腐劑、影響物質除去劑、非特異性反應抑制劑、表面活性劑等。緩沖劑的實例包括上面提到的緩沖劑。穩定劑的實例包括乙二胺四乙酸(EDTA)、蔗糖、氯化鈣、氨基酸、白蛋白、葡聚糖和鹽類例如乙酸鈣。防腐劑的實例包括疊氮化鈉和抗生素。用于影響物質除去劑的實例包括用于消除抗壞血酸影響的抗壞血酸氧化酶。非特異性反應抑制劑的實例包括聚合化合物例如硫酸葡聚糖。表面活性劑的實例包括非離子型表面活性劑、陽離子型表面活性劑、 陰離子型表面活性劑和兩性離子表面活性劑。本發明的用于測量的試劑和試劑盒可以是冷凍干燥狀態或溶解在反應溶液中的狀態。當使用冷凍干燥狀態的試劑盒時，試劑盒可以在溶解于上面提到的水性介質或反應溶液中以后使用。當使用冷凍干燥狀態的試劑盒時，如果需要，用于溶解冷凍干燥試劑等的試劑可以包含在試劑盒中。本發明的用于測量的試劑盒中蛋白酶的含量，優選為在溶解于水性介質中的狀態下提供0. 01U/mL至1，000，000U/mL的濃度、更優選為0. lU/mL至100，000U/mL的濃度的含量。本發明的用于測量的試劑盒中本發明蛋白的含量，優選為在溶解于水性介質中的狀態下提供0. 01U/mL至10，000U/mL的濃度、更優選為0. lU/mL至1，000U/mL的濃度的含量。試劑盒中的過氧化物酶和氧化偶聯型色原體的含量，當使用含有過氧化物酶和氧化偶聯型色原體的試劑作為測量過氧化氫的試劑時，優選其含量將在溶解于水性介質中的狀態下分別提供lU/mL至600U/mL和0. 5g/L至40g/L的濃度、更優選分別為2U/mL至150U/ mL和lg/L至20g/L的濃度。本文中引用的所有現有技術參考文獻在本說明書中引為參考。 實施例在下文中顯示了實施例，但本發明不應被解釋為受限于此。[實施例1]用于果糖基肽氧化酶基因的表達系統的構建選擇構巢裸胞殼(Emericella nidulans)KY125菌株作為生產對α -FVH具有相對高活性并對ε -FK具有低活性的酶的真菌。接下來，使用參考構巢曲霉(Aspergillus nidulans)FGSC A4菌株的DNA序列 (Nature, 438,1105(2005))制備的引物(SEQ ID NO :5和6)，通過PCR方法擴增了全長果糖基肽氧化酶基因，所述構巢曲霉是與構巢裸胞殼有親緣關系的真菌，其全基因組序列已被解碼。當使用DNA測序儀對該DNA序列進行解碼時，KY125菌株的果糖基肽氧化酶基因在6個外顯子之間含有5個內含子。通過交疊PCR方法擴增了單獨的外顯子部分(Nucleic Acids Res.，16，7351 (1988))，并將它們相連，構建了只由外顯子構成的成熟形式的果糖基肽氧化酶基因。通過對該DNA序列進行解碼，發現成熟形式的果糖基肽氧化酶基因由 1317bp和438個氨基酸構成。為了構建用于表達構巢裸胞殼KY125菌株的果糖基肽氧化酶基因的系統，將上面獲得的果糖基肽氧化酶基因插入到pTrc99A表達載體(4，176-bp,由GE Japan制造) 的NcoI和BamHI限制性酶位點中。使用該重組DNA (質粒)(pTrcFP0X_l)轉化大腸桿菌 XLl-Blue (由Funakoshi Corp.制造)。通過將該轉化體在含有50mg/L氨芐青霉素的LB 培養基中培養過夜，在這些細菌中獲得了具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。[實施例2]果糖基氧化物肽酶的構建在實施例1中獲得的果糖基肽氧化酶基因中導入隨機突變。隨機突變的導入使用來自Mratagene的GeneMorph II隨機誘變試劑盒進行。使用pTrcFPOX-Ι作為模板DNA和與相應于果糖基肽氧化酶基因的5’ -側上游部分和3’ -側下游部分的區域對應的引物 (SEQ ID N0:5和6)，通過PCR方法同時進行核苷酸取代的導入和全長擴增。使用NcoI和BamHI切開PCR產物，然后使用PureLink PCR純化試劑盒 (Invitrogen Corp.)將其純化，并連接到pTrc99A的NcoI和BamHI位點中，然后將其用于轉化大腸桿菌XLl-Blue菌株。挑取當在含有含50mg/L氨芐青霉素的LB培養基的平板上培養過夜時生長的菌落 (轉化體)。使用含有含50mg/L氨芐青霉素的2mL LB培養基的M孔培養板(由住友酚醛塑料株式會社制造)，將它們在30°C培養18小時。向培養基添加BugBuster (由Novagen 制造)，并且在細菌細胞裂解和離心后，使用該上清溶液作為酶源，測量對兩種類型的底物 (ε 和α-FVH)的酶活性。同時，從每個轉化體制備質粒，并使用DNA測序儀解碼果糖基肽氧化酶基因部分的核苷酸序列。然后，將酶活性、耐熱性和底物特異性的變化與核苷酸序列(氨基酸序列) 的變化相關聯。在這種情況下，作為a -FVH活性或耐熱性增加的果糖基肽氧化酶，獲得了在實施例1所獲得的果糖基肽氧化酶中，71位Ser被Tyr取代、109位Lys被Arg取代、94位Ile 被Met取代、269位Phe被Ile取代、104位Glu被Lys取代的果糖基肽氧化酶(在后文中稱為FP0X-9)。FP0X-9的氨基酸序列顯示在SEQ ID NO 1中，編碼該氨基酸序列的核苷酸序列顯示在SEQ ID NO :2中。接下來，獲得了通過FP0X-9中59位的Ser被Gly取代所產生的FP0X-10，FP0X-10 中58位的Met和105位的Gly分別被Phe和Lys取代所產生的FP0X-11, FP0X-11中183 位的Gly被Glu取代所產生的FP0X-13，以及FP0X-13中302位的Pro被Leu取代所產生的FP0X-14。此外，獲得了通過FP0X-14中272位的Asn被Asp取代所產生的FP0X-15。 FP0X-15的氨基酸序列和編碼該氨基酸序列的核苷酸序列分別顯示在SEQ ID NO 3和SEQ ID NO :4 中。作為從這些操作積累的取代，如表1中所示，針對a-FVH的活性連續增加。 FPOX-15的a -FVH活性增加到FP0X-9的約4倍。相反，FPOX-15對ε -FK的活性降低到 FP0X-9的約70%。因此，FP0X-15的a -FVH/ ε -FK比率變為約7. 3，該值與FP0X-9的值相比增加了約5. 6倍。此外，即使在50°C熱處理15分鐘，FP0X-15仍保留約80%的酶活性， 因此熱穩定性也極大增加。表 權利要求
1.下列[1]到[4]任一項中的蛋白[1]包含SEQID NO 1所顯示的氨基酸序列的蛋白；[2]包含在SEQID NO :1所顯示的氨基酸序列中具有一個或多個氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；[3]包含與SEQID NO :1所顯示的氨基酸序列具有80%以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；以及[4]由在保藏號FERMBP-110 下保藏的大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli) XLl-Blue MRF'菌株所攜帶的表達質粒編碼的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。
2.權利要求1的蛋白，其包含SEQID NO :3所顯示的氨基酸序列。
3.下列[1]到[3]任一項的DNA[1]編碼權利要求1的蛋白的DNA；[2]包含SEQID NO 2所顯示的核苷酸序列的DNA ；以及[3]在嚴緊條件下與包含SEQID NO :2所顯示的核苷酸序列的互補核苷酸序列的DNA 雜交的DNA，其中所述DNA編碼具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。
4.權利要求3的DNA，其編碼包含SEQID NO :3所顯示的氨基酸序列的蛋白。
5.權利要求3的DNA，其包含SEQID NO 4所顯示的核苷酸序列。
6.一種重組DNA，其包含權利要求3到5任一項的DNA。
7.一種轉化體，其包含權利要求6的重組DNA。
8.一種用于生產權利要求1或2的蛋白的方法，其中將權利要求7的轉化體在培養基中進行培養，蛋白產生并積累在培養物中，并從培養物收集蛋白。
9.一種用于測量樣品中的糖化蛋白的方法，其中方法包含將樣品與蛋白酶反應以形成糖化肽，然后將形成的糖化肽與權利要求1或2的蛋白反應，并測量由糖化肽與蛋白之間的反應所形成的物質或在糖化肽與蛋白之間的反應中所消耗的物質。
10.權利要求9的測量方法，其中糖化蛋白是糖化血紅蛋白。
11.權利要求10的測量方法，其中糖化血紅蛋白是血紅蛋白Ale。
12.一種用于測量糖化蛋白的試劑，其包含蛋白酶和權利要求1或2的蛋白。
13.權利要求12的試劑，其還包含用于測量由權利要求1或2的蛋白與從糖化蛋白形成的糖化肽之間的反應所形成的產物的試劑。
14.權利要求13的試劑，其中產物是過氧化氫。
15.權利要求12到14任一項的試劑，其中糖化蛋白是糖化血紅蛋白。
16.權利要求15的試劑，其中糖化血紅蛋白是血紅蛋白Ale。
17.在保藏號FERMBP-110 下保藏的大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli) XLl-Blue MRF，菌株。
全文摘要
本發明提供了選自下面[1]到[4]的蛋白[1]具有SEQ ID NO1所顯示的氨基酸序列的蛋白；[2]具有在SEQ ID NO1所顯示的氨基酸序列中缺失、取代或添加至少一個氨基酸殘基所產生的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；[3]具有與SEQ ID NO1所顯示的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列、并具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白；以及[4]通過使用大腸埃希氏桿菌(Escherichia coli)XL1-Blue MRF’菌株(在保藏號FERM BP-11026下保藏)所攜帶的表達質粒產生的具有果糖基肽氧化酶活性的蛋白。
文檔編號C12N5/10GK102232111SQ20098014838
公開日2011年11月2日 申請日期2009年10月8日 優先權日2008年10月9日
發明者相阪和夫, 鈴木惠子 申請人:協和梅迪克斯株式會社