SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒及方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體涉及一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR 檢測試劑盒及方法。
【背景技術】
[0002] 硒是一種人類和動物必需的微量元素，與許多疾病密切相關，如癌癥、神經退行性 疾病及心血管病等，并在一些重大疾病的防治中起到重要作用。
[0003] 在現有已發現的25種硒蛋白中，硒蛋白K(SelK)是2003年被Gladyshv實驗室鑒 定出的一種新型硒蛋白；SelK是一個含有94個核苷酸，大小為10. 6KD的小分子蛋白。關 于SelK的生物學功能尚不明確，近幾年發現SelK可能有如下功能：SelK在心肌細胞中參 與應對氧化應激；在人肝癌細胞中參與調節內質網應激；在受體介導的免疫細胞活化過程 中促進鈣流；參與內質網相關蛋白降解；參與調節巨噬細胞表面CD36棕櫚酰化；影響泡沫 細胞的形成和動脈粥樣化等。因此硒蛋白K的表達水平對于多種生命活動中的癥狀診斷具 有非常重要的參考價值。
[0004] 而現有對于SelK表達水平的檢測方法中，多通過傳統的蛋白質染色印跡或者熒 光定量PCR的方法進行。其中，熒光定量PCR可以快速實時的監測并計算模版的初始濃度， 為研宄蛋白在轉錄水平上的表達提供了便捷的一種方法。而現有的熒光定量PCR中的染料 法是屬于非特異性的檢測方法，不如熒光探針法對模版沒有特異性；同時，現有熒光探針法 的引物和探針多只適用于某一特定的局部組織或者細胞，在其他的組織細胞檢測中經常擴 增不到目的條帶，使用中存在不足。

【發明內容】

[0005] 本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種適用于各種人的細 胞或組織鑒定SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒及方法。
[0006] 為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：
[0007] 一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括特異性引物和熒光探 針；其中，
[0008] 所述特異性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1喊基序列的上游引物F和具有序列 表SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物R ;
[0009] 所述熒光探針具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且5'端標記有可淬滅的報告基 團，3'標記有BHQ熒光基團。
[0010] 采用本專利中的引物探針可以成功擴增出目的基因，擴增曲線良好，電泳結果顯 示目的條帶清晰；且引物探針反應性能良好，適用于各種人的細胞或組織鑒定SelK的表 達。
[0011] 本發明進一步還提出一種采用上述試劑盒進行SelK基因表達水平的熒光定量 PCR檢測方法，包括如下步驟：
[0012] 提取待測樣本RNA ;
[0013] 將所述待測樣本RNA進行反轉錄，得到反轉錄DNA ;
[0014] 以所述反轉錄DNA為模板，進行實時熒光PCR ;
[0015] 檢測PCR過程中的熒光信號；
[0016] 其中，所述實時熒光PCR過程中采用的引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序 列的上游引物F和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物R ;
[0017] 所述實時熒光PCR過程中采用的熒光探針具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且 5'端標記有可淬滅的報告基團，3'標記有BHQ熒光基團。
[0018] 本發明的上述檢測方法，實時反映靶基因擴增的過程，并根據內參或外參直接反 映出靶基因的拷貝數；具有靈敏度高、特異性強等優點；并且引物和探針基于硒蛋白表達 的mRNA的特定的區域設計，適用于各種人的細胞或組織鑒定SelK的表達。
【附圖說明】
[0019] 下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：
[0020] 圖1為本發明實施例SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測的熒光變化圖；
[0021] 圖2為本發明實施例SelK基因表達水平的熒光定量PCR擴增產物的電泳結果圖；
[0022] 圖3為圖1中熒光熒光曲線對應的擴增樣本和統計數據圖。
【具體實施方式】
[0023] 為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對 本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并 不用于限定本發明。
[0024] 本發明實施例提供一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測方法，包括如下步 驟：
[0025] S10,獲取待測樣本，并提取待測樣本的RNA ;
[0026] S20,以提取的待測樣本的RNA模板進行實時熒光RT-PCR ;
[0027] S30, RT-PCR過程中的熒光信號。
[0028] 本發明上述過程通過對提取的待測樣本的RNA進行擴增，并通過擴增過程中熒光 探針產生的熒光信號變化，從而便可以得知待測樣本中SelK基因表達水平；當然，基于實 時熒光RT-PCR進行，重點在于針對目的SelK基因的特異性引物和熒光探針。其中，本發明 的步驟S20中的特異性引物和熒光探針為：
[0029]
【主權項】
1. 一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于，包括特異性引物 和熒光探針；其中， 所述特異性引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的上游引物F和具有序列表 SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物R ; 所述熒光探針具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且5'端標記有可淬滅的報告基團， 3'標記有BHQ熒光基團。
2. 如權利要求1所述的SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于， 所述可淬滅的報告基團為FAM、HEX、TAMRA、ROX中的一種。
3. 如權利要求1或2所述的SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒還包括有陽性對照；所述陽性對照為人cDNA模板。
4. 如權利要求1或2所述的SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在 于，所述試劑盒還包括有陰性對照；所述陰性對照為RNase free dH20。
5. -種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟： 提取待測樣本RNA ; 將所述待測樣本RNA進行反轉錄，得到反轉錄DNA ; 以所述反轉錄DNA為模板，進行實時熒光PCR ; 檢測PCR過程中的熒光信號； 其中，所述實時熒光PCR過程中采用的引物包括具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列的 上游引物F和具有序列表SEQ. ID. No. 2堿基序列的下游引物R ; 所述實時熒光PCR過程中采用的熒光探針具有序列表SEQ. ID. No. 3堿基序列，且5'端 標記有可淬滅的報告基團，3'標記有BHQ熒光基團。
6. 如權利要求5所述的SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測方法，其特征在于，所 述可淬滅的報告基團為FAM。
【專利摘要】本發明提供了一種SelK基因表達水平的熒光定量PCR檢測試劑盒，包括特異性引物和熒光探針；其中，特異性引物包括具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的上游引物F和具有序列表SEQ.ID.No.2堿基序列的下游引物R；所述熒光探針具有序列表SEQ.ID.No.3堿基序列，且5’端標記有可淬滅的報告基團，3’標記有BHQ熒光基團。采用本發明中的引物探針可以成功擴增出目的基因，擴增曲線良好，電泳結果顯示目的條帶清晰；且引物探針反應性能良好，適用于各種人的細胞或組織鑒定SelK的表達。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號】CN104561288
【申請號】CN201410830420
【發明人】張仁利, 李瑞敏
【申請人】深圳市疾病預防控制中心
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月26日