焦磷酸測序法檢測cyp2e1基因多態性的引物對及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種焦磷酸測序法檢測CYP2E1基因多態 性的引物對，包含所述引物對的試劑盒及該試劑盒的應用。
【背景技術】
[0002] CYP2E1是代謝內源和外源性物質的細胞色素酶P450超家族中的一員，主要參與 亞硝胺及其前致癌物N-亞硝基二甲胺和N-亞硝基四吡咯烷的代謝，同時參與酒精的氧化 代謝和產生自由基而啟動脂質過氧化。
[0003] CYP2E1 基因多態性包括 C1053T (即 rs2031920 位點）、G1293C (即 rs3813867 位 點）等多種突變類型，它們與肺癌、肝癌和鼻咽癌等多種腫瘤的發生、發展密切相關。
[0004] 當前國內外廣泛使用的分子生物學檢測CYP2E1基因多態性的方法中，熒光定量 PCR存在著檢測通量的局限性和假陽性的缺點，所以都還不能真正滿足臨床診斷檢測的需 要。傳統的固相生物芯片（Biochip)或基因芯片技術存在著可重復性差、靈敏度不夠好以 及操作繁瑣的突出弱點。
[0005] 焦磷酸測序技術（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術，具備同時對大量 樣品進行測序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進行核苷酸分析和臨床檢驗提 供了非常理想的技術操作平臺。
【發明內容】
[0006] 發明目的：針對現有技術中存在的技術問題，本發明提出一種焦磷酸測序法 同時檢測CYP2E1基因多態性的引物對以及含有所述引物對的試劑盒，可以同時檢測 C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)兩種突變類型，具有高靈敏度、高特異性、高準 確度、檢測迅速等優點。
[0007] 技術方案：為實現上述技術目的，本發明提出了一種焦磷酸測序法同時檢 測CYP2E1基因多態性的引物對，所述的CYP2E1突變位點為C1053T (rs2031920)和 G1293C(rs3813867)中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對包括：
[0008] (1)對于 C1053T(rs2031920)突變位點：
[0009] 擴增引物為：
[0010] 上游引物：5，-GGCATAACTCAAAATCCACAAGTG-3，，
[0011] 下游引物：5' -CAGACCCTCTTCCACCTTCTATGA-3'，
[0012] 其中上游引物的5'端進行生物素標記；
[0013] 測序引物為：
[0014] 5' -AATTCATAGGTTGCAATT-3r ；
[0015] (2)對于 G1293C(rs3813867)突變位點：
[0016] 擴增引物：
[0017] 上游引物：5' -CCCCTTCTTGGTTCAGGAGAG-3'，
[0018] 下游引物：5' -GTCATTGGTTGTGCTGCACCTAA-3'，
[0019] 其中上游引物的Y端進行生物素標記；
[0020] 測序引物：
[0021] 5' -GCTGCACCTAACACTG-S， 。
[0022] 本發明進一步提出了一種焦磷酸測序法檢測CYP2E1基因多態性的試劑盒，所述 的CYP2E1突變位點為C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)中的任意一種或兩種，其 特征在于，所述試劑盒包含質控品和如下引物：
[0023] (1)對于 C1053T(rs2031920)突變位點：
[0024] 擴增引物：
[0025] 上游引物：5，-GGCATAACTCAAAATCCACAAGTG-3，，
[0026] 下游引物：5' -CAGACCCTCTTCCACCTTCTATGA-3'，
[0027] 其中上游引物的5'端進行生物素標記；
[0028] 測序引物：
[0029] 5' -AATTCATAGGTTGCAATT-3r ；
[0030] (2)對于 G1293C(rs3813867)突變位點：
[0031] 擴增引物：
[0032] 上游引物：5' -CCCCTTCTTGGTTCAGGAGAG-3'，
[0033] 下游引物：5' -GTCATTGGTTGTGCTGCACCTAA-3'，
[0034] 其中上游引物的5'端進行生物素標記；
[0035] 測序引物：
[0036] 5' -GCTGCACCTAACACTG-S， 。
[0037] 其中，所述質控品包括陽性對照品和陰性對照品，其中，所述的陽性對照品為含有 C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點的質粒的混合液，所述的陰性對照品 與陽性對照品相比，為不含C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點的質粒溶 液。
[0038] 本發明還提出了上述引物對及包含上述引物對的試劑盒在制備檢測CYP2E1基因 多態性的試劑中的應用。
[0039] 有益效果：與現有技術相比，本發明的焦磷酸測序法檢測CYP2E1基因多態性的試 劑盒能夠實現快速、簡便、高效、準確的檢測C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)兩 種基因多態性，為制備用于檢測C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點的試 劑提供了理論基礎。
【具體實施方式】
[0040] 實驗材料：
[0041] 引物由invitrogen公司合成；DNA提取試劑盒、多重PCR試劑盒及焦磷酸測序試 劑購置于QIAGEN公司。
[0042] 一種焦磷酸測序法檢測CYP2E1基因多態性的試劑盒，CYP2E1的突變位點為 C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)中的任意一種或兩種，包括質控品和如下引物：
[0043] (1)對于 C1053T(rs2031920)位點：
[0044] 擴增引物：
[0045] 上游引物：5' -GGCATAACTCAAAATCCACAAGTG-3'，
[0046] 下游引物：5' -CAGACCCTCTTCCACCTTCTATGA-3'，
[0047] 其中上游引物的5'端進行生物素標記；
[0048] 測序引物：
[0049] 5' -AATTCATAGGTTGCAATT-3，，
[0050] (2)對于 G1293C(rs3813867)位點：
[0051] 擴增引物：
[0052] 上游引物：5' -CCCCTTCTTGGTTCAGGAGAG-3'，
[0053] 下游引物：5' -GTCATTGGTTGTGCTGCACCTAA-3'，
[0054] 其中上游引物的5'端進行生物素標記；
[0055] 測序引物：
[0056] 5' -GCTGCACCTAACACTG-S， 。
[0057] 其中，質控品（質控品DNA)包括陽性對照品和陰性對照品，所述的陽性對照品 為含有C1053T(rs2031920)和G1293C(rs3813867)突變位點的質粒的混合液；所述的陰 性對照品作為陰性對照，與陽性對照品相比，陰性對照品為不含C1053T(rs2031920)和 G1293C(rs3813867)突變位點的質粒溶液。
[0058] 檢測方法包括如下步驟：
[0059] ( -）DNA 提取：
[0060] 1?26號樣本為中國人外周靜脈血（EDTA或肝素抗凝）或唾液及口腔粘膜采集的 樣本。對于外周靜脈血（EDTA或肝素抗凝）樣本，按照QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒的說明提取DNA。對于唾液及口腔粘膜采集的樣本，按照QIAGEN公司的 Gentra Puregene Buccal Cell Kit 試劑盒的說明提取 DNA。
[0061] (二）多重 PCR 擴增：
[0062] 按照如下方法對上述的1?26號樣本的DNA進行多重PCR擴增，采用的是QIAGEN 公司的多重Multiplex PCR試劑盒，反應體系如下：
[0063] Template DNA 或j貢控二 DNA 10μ1 2xQIAGEN Multiplex PCR Master Mix 25μ1 IQxPrimcr mix 5μ1 RNasc-free water 10μ1 終體積為50 μ?
[0064] 其中，2XQIAGEN Multiplex PCR Master Mix 中含熱啟動TaqDNA酶、MgC12和 dNTP Mix ; 10 XPrimer mix為包含上述兩種突變位點的引物對的混合物。
[0065] PCR 擴增程序：95°C 15min ;94°C 30s，55°C 90s，72°C 90s，35 個循環；72°C IOmin ; 4 C保溫。
[0066] 通過上述步驟，獲得PCR產物。
[0067] (三）焦磷酸測序
[0068] 首先，用微珠固定PCR產物，其主要是將生物素標記的PCR產物固定到鏈霉親和素 包被的瓊脂糖微珠 （Streptavidin Sepharose High Performance)上，包括如下步驟：
[0069] (1)輕搖包被鏈霉親和素的瓊脂糖微珠，直至獲得均質溶液；
[0070] (2)在一個試管中混合鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠總量（2 μ 1/樣品）與結合緩 沖液（40 μ 1/樣品），添加超純水至一定體積，該體積與后續所要添加優化好的生物素