一種簡便有效的懸浮細胞擴培操作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于細胞工程領域，具體涉及一種懸浮細胞擴培操作方法。
【背景技術】
[0002] 懸浮培養是游離的單細胞或細胞團按照一定的細胞密度懸浮在液體培養基中進 行培養的方法。為使細胞不斷增殖，培養一定時間必須進行擴培。擴培的方法是取培養瓶 中一小部分懸浮細胞，按一定的稀釋比例轉移到成分相同的新鮮培養基中，需要較準確的 控制懸浮細胞和培養基的量。整個懸浮細胞擴培操作必須滿足無菌操作要求。在實驗室搖 瓶研宄階段，細胞擴培操作中懸浮細胞和培養基的無菌轉移一般采用移液器和已滅菌的量 筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）。當移液體積較小（如200mL以下）時，一般采用移液 器進行液體無菌轉移。由于移液管的體積限制，當移液體積較大時，用移液器操作會顯得特 別繁瑣，需要移液多次才能完成一個細胞擴培過程，操作效率低，在多次移液之后，容易忘 記移液次數，導致移液體積不準。因此，當移液體積較大（如200mL以上）時，一般用已滅 菌的量筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）進行液體無菌轉移。當移液體積較大，用已滅 菌的量筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）進行液體無菌轉移時，需要提前對量筒（或其 他可滅菌的帶刻度的容器）進行滅菌，增加實驗量和實驗成本。在操作過程中，需要在懸浮 細胞、培養液、無菌量筒（或其他已滅菌的帶刻度的容器）和培養瓶之間進行液體的反復轉 移，增加染菌風險。無菌操作是細胞培養最基本也是最重要的要求，超凈工作臺或生物安全 柜雖可控制空氣潔凈度到百級，但并不是無菌環境。減少液體反復轉移的次數可顯著縮短 無菌液體與帶菌空氣的接觸時間，減少染菌幾率。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種簡便、有效、安全的懸浮細 胞擴培操作方法。
[0004] 本發明的目的通過以下技術方案實現：
[0005] 一種簡便有效的懸浮細胞擴培操作方法，其步驟如下：
[0006] 1)復蘇一支293F細胞，加入到37°C水浴預熱的培養基中，放入CO2培養箱培養；
[0007] 2)進行第一次擴培：取20ml細胞懸浮液，向細胞懸浮液中倒入80g培養基，旋緊 培養瓶蓋，放入CO 2體積濃度為8%、37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養；
[0008] 3)進行第二次擴培：將新的2L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入400g的 培養基，再清零天平，繼續倒入IOOg懸浮細胞液，旋緊培養瓶蓋，細胞放入CO 2體積濃度為 8%、37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養；
[0009] 4)進行第三次擴培：將新的3L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入2000g的 培養基，再清零天平，繼續倒入500g懸浮細胞液，旋緊培養瓶蓋混勻，再將一個新的3L培養 瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，將混勻的細胞倒入1250g到新的3L培養瓶，旋緊瓶蓋，兩瓶 細胞一起放入CO 2體積濃度為8%、37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養。
[0010] 根據本發明的方法，優選地，所述步驟1)中，CO2培養箱的培養條件為：co 2體積濃 度為8%、37°C、搖床轉速140rpm。
[0011] 根據本發明的方法，優選地，所述步驟1)中，細胞培養3天。
[0012] 根據本發明的方法，優選地，所述培養基為FreeStyle? 293 Expression Medium， Gibco 12338〇
[0013] 與現有的懸浮細胞擴培操作方法相比，本發明的方法具有以下優勢：
[0014] (1)為控制實驗成本，質量稱取設備的精度和最大量程都不必太高，精度在0. lg， 最大量程在3000g即可，這樣的設備市場售價在100元左右，能很好實現設備成本的控制；
[0015] (2)質量稱取設備放入超凈工作臺或生物安全柜里專用，能更好的避免污染風 險；
[0016] (3)不需要對量取器材進行滅菌處理，當天可完成細胞擴培操作；傳統操作中需 要提前一天對器材進行滅菌處理，烘干后第二天進行實驗操作；相比傳統操作方法，本發明 的方法使實驗時間縮短一倍；
[0017] (4)傳統操作方法中在對量取器材進行滅菌處理過程和烘干過程中，需要消耗電 力和人力資源，從長遠統計來看，本發明可以顯著減少能源消耗和提高生產率。
【附圖說明】
[0018] 圖1是懸浮細胞擴培的活細胞密度。
[0019] 圖2是懸浮細胞擴培的細胞活率。
【具體實施方式】
[0020] 下面結合具體實施例進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的應用范圍。
[0021] 37°C水浴預熱培養基（FreeStyle? 293 Expression Medium，Gibco 12338)，從 液氮中取出293F細胞（BIOWIT C0004)，手握解凍，與預熱的IOml培養基混勻，IOOOrpm離 心5分鐘，棄上清，IOml預熱的培養基重懸，取樣計算活細胞密度和細胞活率，在無菌搖瓶 中將活細胞密度稀釋到5X10 5cellS/ml，放入CO2培養箱培養，CO2培養箱條件設置為：8% CO2 (體積濃度）、37°C、搖床轉速140rpm。細胞培養3天后，取樣計算活細胞密度和細胞活 率。將細胞懸浮液用移液器精確分為兩份，每份20ml。其中一份為實驗組，用天平稱量的方 法進行細胞擴培；另一份為對照組，用體積量取的方法進行細胞擴培。實驗組和對照組都為 3天擴培一次，擴增倍數都為5倍。每次擴培前測定活細胞密度和細胞活率，擴培3次后，量 筒量取培養體系的體積。
[0022] 實驗組：第一次擴培時，將原培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入80g的培養 基（與以上培養基相同），旋緊培養瓶蓋，細胞放入8% CO2 (體積濃度）、37°C、轉速HOrpm 的二氧化碳培養箱中培養。第二次擴培時，將新的2L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零， 倒入400g的培養基（與以上培養基相同），再清零天平，繼續倒入IOOg懸浮細胞液，旋緊培 養瓶蓋，細胞放入8% CO2 (體積濃度）、37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養。第三 次擴培時，將新的3L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入2000g的培養基（與以上培 養基相同），再清零天平，繼續倒入500g懸浮細胞液，旋緊培養瓶蓋混勻，再將一個新的3L 培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，將混勻的細胞倒入1250g到新的3L培養瓶，旋緊瓶蓋， 兩瓶細胞一起放入8% CO2 (體積濃度）、37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養。
[0023] 對照組采用常規體積量取法進行擴培。
[0024] 實驗結果：
[0025] 1.每次細胞擴培時，取樣計算活細胞密度，數據見圖1，發現用天平稱量進行懸浮 細胞擴培與用量筒量取進行懸浮細胞擴培對活細胞密度的影響一致，兩者沒有差異。
[0026] 2.每次細胞擴培時，取樣計算細胞活率，數據見圖2,發現用天平稱量進行懸浮細 胞擴培與用量筒量取進行懸浮細胞擴培對細胞活率的影響一致，兩者沒有差異。
[0027] 3.培養結束后，用量筒對培養體系進行定量，最終體積相差很小，幾乎沒有區別， 數據見下表。
[0028]
【主權項】
1. 一種簡便有效的懸浮細胞擴培操作方法，其步驟如下： 1) 復蘇一支293F細胞，加入到37°C水浴預熱的40ml培養基中，放入CO2培養箱培養； 2) 進行第一次擴培：取20ml細胞懸浮液，向細胞懸浮液中倒入80g培養基，旋緊培養 瓶蓋，放入CO2體積濃度為8%、37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養； 3) 進行第二次擴培：將新的2L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入400g的培養 基，再清零天平，繼續倒入IOOg懸浮細胞液，旋緊培養瓶蓋，細胞放入CO 2體積濃度為8 %、 37°C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養； 4) 進行第三次擴培：將新的3L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入2000g的培養 基，再清零天平，繼續倒入500g懸浮細胞液，旋緊培養瓶蓋混勻，再將一個新的3L培養瓶旋 開瓶蓋后放入天平上清零，將混勻的細胞倒入1250g到新的3L培養瓶，旋緊瓶蓋，兩瓶細胞 一起放入CO 2體積濃度為8 %、37 °C、轉速HOrpm的二氧化碳培養箱中培養。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，CO2培養箱的培養條件為： CO2體積濃度為8%、37°C、搖床轉速140rpm。
3. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟1)中，細胞培養3天。
4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述培養基為Freestyle ? 293 ExpressionMedium,Gibco 12338。
【專利摘要】本發明提供了一種懸浮細胞擴培操作方法，其步驟如下：1)復蘇一支293F細胞，加入到37℃水浴預熱的培養基中，放入CO2培養箱培養；2)進行第一次擴培：取20ml細胞懸浮液，向細胞懸浮液中倒入80g培養基，旋緊培養瓶蓋，放入CO2體積濃度為8％、37℃、轉速140rpm的二氧化碳培養箱中培養；3)進行第二次擴培：將新的2L培養瓶旋開瓶蓋后放入天平上清零，倒入400g的培養基，再清零天平，繼續倒入100g懸浮細胞液，旋緊培養瓶蓋，細胞放入CO2體積濃度為8％、37℃、轉速140rpm的二氧化碳培養箱中培養；4)進行第三次擴培。本發明的方法簡便有效。
【IPC分類】C12N5-071
【公開號】CN104560863
【申請號】CN201410836525
【發明人】賀煒華
【申請人】佛山安普澤生物醫藥有限公司
【公開日】2015年4月29日
【申請日】2014年12月29日