本發明(ming)涉及(ji)(ji)一種干酪乳(ru)桿菌來源的(de)l-乳(ru)酸脫(tuo)氫酶及(ji)(ji)其應(ying)用(yong)，屬于生物工程技術領域。

背景技術：

苯(ben)乳(ru)酸(suan)(suan)(phenyllactateacid，pla)，系統名為(wei)2-羥基-3-苯(ben)基丙酸(suan)(suan)，是一種(zhong)高值有(you)機酸(suan)(suan)，其(qi)具有(you)兩種(zhong)對映異構(gou)體：l-pla和(he)d-pla。pla的(de)(de)(de)分(fen)子(zi)式為(wei)c9h10o3，相對分(fen)子(zi)質(zhi)量為(wei)166.17，其(qi)性(xing)質(zhi)穩定，熔點為(wei)121～125℃；pla在水中(zhong)溶(rong)解度較好，并且其(qi)在水溶(rong)液中(zhong)有(you)較好的(de)(de)(de)熱穩定性(xing)。l-pla和(he)d-pla都具有(you)廣譜抑菌效果，可作為(wei)天然抑菌劑，替(ti)代(dai)化學合成(cheng)的(de)(de)(de)防(fang)腐(fu)劑，而且可經聚合反應合成(cheng)聚苯(ben)乳(ru)酸(suan)(suan)新型(xing)高分(fen)子(zi)材料(liao)，替(ti)代(dai)聚乳(ru)酸(suan)(suan)高分(fen)子(zi)材料(liao)。因此，苯(ben)乳(ru)酸(suan)(suan)在化工、制藥、生物、材料(liao)和(he)食品等領(ling)域有(you)廣闊的(de)(de)(de)應用前(qian)景。

pla可由(you)多種微生物(wu)代(dai)謝(xie)產生，是菌(jun)(jun)(jun)體在代(dai)謝(xie)途徑中一個副產物(wu)，如(ru)大(da)多數的(de)(de)乳酸菌(jun)(jun)(jun)如(ru)植物(wu)乳桿菌(jun)(jun)(jun)(lactobacillusplantarum)，乳酸片球菌(jun)(jun)(jun)(pediococcusacidilactici)等，也有一些真(zhen)菌(jun)(jun)(jun)如(ru)白地霉(mei)(geotrichumcandidum)，熒光維克酵母(wickerhamiafluorescens)tk1可產pla，但現有的(de)(de)野生菌(jun)(jun)(jun)株(zhu)自產pla的(de)(de)濃度(du)很低。目前，pla可以(yi)通(tong)過(guo)化學(xue)和生物(wu)的(de)(de)方法(fa)(fa)合成，但由(you)于化學(xue)方法(fa)(fa)苛(ke)刻的(de)(de)反(fan)應條件、復雜的(de)(de)技術路(lu)線、副產物(wu)多不易分離(li)，尤其對環境造成污染(ran)等缺點，生物(wu)合成法(fa)(fa)因(yin)其高效性，反(fan)應條件溫和等優(you)點，近年來受到(dao)廣(guang)大(da)研究(jiu)者的(de)(de)青睞(lai)。

已(yi)有研究表明，微生物(wu)(wu)中(zhong)多種(zhong)l-乳(ru)酸(suan)(suan)(suan)(suan)脫(tuo)氫(qing)酶可不對(dui)(dui)稱(cheng)還(huan)原(yuan)苯(ben)(ben)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)生成l-pla，但是不同l-ldh不對(dui)(dui)稱(cheng)還(huan)原(yuan)苯(ben)(ben)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)能力(li)存在明顯差異，如賈(jia)江花(hua)等(deng)克(ke)隆(long)表達(da)了(le)來(lai)(lai)源于(yu)植物(wu)(wu)乳(ru)桿(gan)菌(jun)(lactobacillusplantarum)中(zhong)的(de)l1-ldh和l2-ldh基(ji)因(yin)(yin)，重組(zu)l1-ldh對(dui)(dui)苯(ben)(ben)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)比活(huo)力(li)為71.06u/mg，而(er)重組(zu)l2-ldh對(dui)(dui)苯(ben)(ben)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)比活(huo)力(li)僅為0.06u/mg，并(bing)未(wei)測定其(qi)對(dui)(dui)映(ying)體純(chun)度(du)。王穎等(deng)克(ke)隆(long)了(le)來(lai)(lai)源于(yu)bacillusmegateriumz2013513的(de)ldhl基(ji)因(yin)(yin)并(bing)在大腸桿(gan)菌(jun)中(zhong)實現表達(da)，測得粗酶液對(dui)(dui)苯(ben)(ben)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)的(de)酶活(huo)力(li)為3.4u/mg。在37℃、200r/min條(tiao)件下，25g/l(干重)重組(zu)菌(jun)經(jing)60min將70.32mmol/l苯(ben)(ben)丙(bing)酮(tong)(tong)酸(suan)(suan)(suan)(suan)全細胞轉(zhuan)(zhuan)化(hua)合(he)成50.59mmol/ll-pla，eep為96.89％，底(di)物(wu)(wu)摩爾轉(zhuan)(zhuan)化(hua)率(lv)僅為71.94％。因(yin)(yin)此，利(li)用分子生物(wu)(wu)學手段不斷挖掘出性狀優良的(de)l-ldh，對(dui)(dui)于(yu)獲得高純(chun)度(du)，高產量的(de)l-pla具有重要的(de)意義。

技術實現要素：

本發明的第一個目的是提(ti)供一種(zhong)來(lai)源于(yu)干(gan)酪(lao)乳桿菌(jun)(lactobacilluscasei)的l-乳酸(suan)脫氫酶，lcldh1，其氨基酸(suan)序列(lie)如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序(xu)列如(ru)seqidno.2所示；

(b)在(zai)(a)中的氨(an)基酸序(xu)列經過取代(dai)、缺失或添(tian)加一個或幾(ji)個氨(an)基酸且(qie)具有苯丙酮酸還原活(huo)性的由(you)(a)衍生的蛋白質。

本發明的第二個目的是提供編碼(ma)所述l-乳酸脫氫酶的基因。

在本發明(ming)的一種(zhong)實施(shi)方式中，所(suo)述基因序列如seqidno.1所(suo)示。

本發明的(de)第三(san)個(ge)目(mu)的(de)是提供(gong)一種基因工程菌(jun)(jun)，是以大腸桿菌(jun)(jun)為宿主，表達seqidno.1所示的(de)l-乳酸脫(tuo)氫酶基因。

在本發明的(de)一(yi)種實施方式中，所述基(ji)因工程菌(jun)以pet-22b(+)為(wei)載體(ti)。

在本發(fa)明的一(yi)種實施方(fang)式(shi)中，所述宿主為e.colibl21、e.colijm109、e.colidh5α、或e.colitop10。

本發明(ming)的(de)第四個目的(de)是(shi)(shi)提供構建所(suo)述基因(yin)(yin)工(gong)程(cheng)菌(jun)的(de)方法，是(shi)(shi)將seqidno.1所(suo)示基因(yin)(yin)與載體連(lian)接，轉化至大腸桿菌(jun)細胞中(zhong)。

在本發明的一種實施方式中，所述載體為(wei)pet-22b(+)。

在本(ben)發明的(de)一(yi)種實施方式中，所述宿主為e.colibl21(de3)。

本發明的(de)第五(wu)個目的(de)是提供生產所述乳酸脫氫酶的(de)方(fang)法，是將所述基因工程(cheng)菌(jun)接種至lb培養基中，培養至od600＝0.6～0.8，加入終濃(nong)度為0.3～0.5mmol/l的(de)iptg誘導6～10h。

在(zai)本發明的一種實施方(fang)式(shi)中，所述誘(you)導是在(zai)18～22℃進行(xing)誘(you)導。

本發明的第六個目(mu)的是提供所述l-乳酸脫氫酶的應用。

在本發明的一種實施方式中，所述應(ying)用(yong)是以苯丙酮酸為底(di)物(wu)，加入所述l-乳(ru)酸脫氫酶(mei)，轉化生產(chan)l-苯乳(ru)酸。

在本發(fa)明的一種實(shi)施實(shi)施方式中，所(suo)述(shu)應用是向每1mmol/l苯丙酮酸中加(jia)入3mg含(han)所(suo)述(shu)乳酸脫(tuo)氫酶的重組濕菌體(ti)，于30～37℃200～220rpm條件(jian)下反應30～120min。

本發(fa)明的(de)(de)(de)有(you)益(yi)效果(guo)：來源(yuan)于干酪乳桿菌(lactobacilluscasei)的(de)(de)(de)l-乳酸(suan)(suan)脫氫酶(mei)(mei)基因(yin)序列克隆，l-乳酸(suan)(suan)脫氫酶(mei)(mei)工程菌的(de)(de)(de)構建(jian)以(yi)及重組l-乳酸(suan)(suan)脫氫酶(mei)(mei)的(de)(de)(de)異源(yuan)表達(da)和活(huo)性(xing)測(ce)定的(de)(de)(de)方法(fa)。本發(fa)明構建(jian)的(de)(de)(de)重組菌株(zhu)e.coli/lcldh1在反應80min后可不(bu)對稱還原10mmol/l苯(ben)丙(bing)酮酸(suan)(suan)生成(cheng)8.59mmol/l的(de)(de)(de)l-苯(ben)乳酸(suan)(suan)，產率為85.9％，對映體(ti)過(guo)量值(eep)>99％。純化的(de)(de)(de)lcldh1對苯(ben)丙(bing)酮酸(suan)(suan)的(de)(de)(de)比活(huo)性(xing)為294.2u/mg。

附圖說明

圖(tu)1為重組lcldh1的sds-page分析；其中，m:proteinmarker；1:e.coli/pet22b全(quan)細胞(bao)(bao)(對照菌(jun))；2:e.coli/lcldh1全(quan)細胞(bao)(bao)；3純化后的lcldh1。

具體實施方式

lcldh1的(de)活性測定(ding)(ding)：總反應體系，包(bao)括50mmol/l乙酸鈉緩沖液(ph5.0)，0.2mmol/lnadh，8mmol/l苯丙酮酸，對照組中(zhong)不含(han)nadh，其(qi)他(ta)成分相同。混(hun)勻后(hou)于30℃保(bao)溫5min，加入適量(liang)的(de)酶(mei)液。檢測nadh在340nm處吸收值的(de)變化。酶(mei)活力(li)單(dan)位(u)定(ding)(ding)義為：在上述(shu)條件(jian)下，每分鐘催化氧化1μmolnadh所需要的(de)酶(mei)量(liang)。同時，采用bradford方法(fa)測定(ding)(ding)蛋白含(han)量(liang)。

底物(wu)和產物(wu)的檢測：反(fan)應(ying)結束后，取一定量的轉化液加入甲醇終止反(fan)應(ying)，進(jin)行反(fan)相hplc分析(xi)：色譜柱為prontosilc18(150mm×4.6mm×0.25μm)，流(liu)動(dong)相成分：0.05％三氟乙(yi)(yi)酸/水(shui)(a)和0.05％三氟乙(yi)(yi)酸/甲醇(b)混(hun)合(he)液。梯度(du)洗脫程序為：0～15min20％～65％b；15～16min65％～100％b；16～19min保持100％b；紫(zi)外光檢測器，柱溫：30℃；流(liu)速(su)1ml/min。檢測波長為210nm，ppa的保留(liu)時(shi)間11.372min，pla的保留(liu)時(shi)間為12.858min。

另取一部分(fen)轉化液于1ml乙(yi)酸(suan)乙(yi)酯中(zhong)進行萃取，上層(ceng)有機(ji)(ji)相(xiang)經無水硫酸(suan)鎂干燥后過0.22μm有機(ji)(ji)濾(lv)膜采用正(zheng)(zheng)相(xiang)hplc進行手性(xing)分(fen)析(xi)，色譜柱(zhu)為daicelod-h(250mm×4.6mm)，分(fen)析(xi)條件為：流動相(xiang)為正(zheng)(zheng)己烷(wan)/異丙醇/三氟乙(yi)酸(suan)(98:2:0.05，v/v)，流速(su)為1ml/min，檢測波長為210nm，柱(zhu)溫(wen)：30℃，d-pla和l-pla的保留時間分(fen)別為33.896min，35.806min。根據實驗數據計算(suan)對映體過量值：eep＝[l-pla-d-pla/(l-pla+d-pla)]×100％。

實施例1lcldh1基因的(de)克隆與表達質粒的(de)構建

根(gen)據(ju)l.caseibl23的(de)(de)l-ldh(cap07851)對應的(de)(de)核(he)苷酸序列設計(ji)如下引物：

lcldh1-f：5’-catatggtggcaagtattacggataa-3’，含(han)ndei酶切位(wei)點。

lcldh1-r：5’-ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt-3’，含(han)xhoi酶切位(wei)點。

提取干(gan)酪(lao)乳桿(gan)菌(jun)的總dna，以lcldh1-f和lcldh1-r為(wei)引物進行pcr擴增，pcr條件為(wei)：94℃4min；94℃30s，51℃30s，72℃1min10s，30個循環(huan)；72℃10min。將pcr產(chan)物用1％瓊脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)分析，割(ge)膠(jiao)回收目的條帶并與pucm-t載(zai)體連接(jie)(pucm-t-lcldh1)，轉(zhuan)化入e.colijm109中，經菌(jun)液(ye)pcr鑒定(ding)正確后送上海生工測(ce)序，得(de)到lcldh1核苷(gan)酸序列。將測(ce)序結果正確的pucm-t-lcldh1與pet-22b(+)質(zhi)粒(li)均用ndei和xhoi進行雙酶切，割(ge)膠(jiao)回收的酶切產(chan)物在(zai)t4dna連接(jie)酶的作用下進行連接(jie)，得(de)到重(zhong)(zhong)組(zu)(zu)質(zhi)粒(li)pet-22b(+)-lcldh1，并對重(zhong)(zhong)組(zu)(zu)質(zhi)粒(li)進行序列測(ce)定(ding)。

實(shi)施例2重(zhong)組(zu)菌e.coli/lcldh1的構建與誘導(dao)表達

將pet-22b(+)-lcldh1轉化(hua)(hua)入e.colibl21(de3)中，經含(han)(han)(han)有(you)amp的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)平板篩(shai)選(xuan)后(hou)，挑取陽性(xing)轉化(hua)(hua)子于(yu)2ml含(han)(han)(han)amp的(de)(de)(de)(de)(de)抗(kang)性(xing)lb液(ye)(ye)體培養(yang)(yang)基中，37℃220rpm搖(yao)床振蕩培養(yang)(yang)14～16h。按(an)2％的(de)(de)(de)(de)(de)接種量(liang)轉接于(yu)30ml相同培養(yang)(yang)基中，37℃220rpm搖(yao)床振蕩培養(yang)(yang)至對(dui)數生長(chang)中期(od600＝0.6～0.8)，加入iptg至終濃度為0.4mmol/l，20℃220rpm誘導(dao)培養(yang)(yang)8h。誘導(dao)結(jie)束后(hou)，離心收集菌(jun)體并用磷酸鹽緩沖液(ye)(ye)(ph＝7.0)洗滌數次，用于(yu)sds-page分析。以僅含(han)(han)(han)空(kong)pet-22b(+)的(de)(de)(de)(de)(de)菌(jun)株為對(dui)照(zhao)(zhao)，結(jie)果見圖1，重組菌(jun)e.coli/lcldh1(即e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1)在36.4kda處具有(you)大小與目(mu)的(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)相同的(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白條(tiao)帶，對(dui)照(zhao)(zhao)菌(jun)沒有(you)條(tiao)帶。利用液(ye)(ye)相色譜測定(ding)lcldh1轉化(hua)(hua)苯丙(bing)酮酸生成pla的(de)(de)(de)(de)(de)產量(liang)及測定(ding)產物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)對(dui)映選(xuan)擇性(xing)。對(dui)照(zhao)(zhao)組分別(bie)用僅含(han)(han)(han)空(kong)pet-22b(+)和無(wu)iptg誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)工程菌(jun)在相同條(tiao)件下培養(yang)(yang)。8000rpm，5min收集菌(jun)體。加入一定(ding)量(liang)的(de)(de)(de)(de)(de)破(po)碎液(ye)(ye)(20mmol/ltris-hcl，500mmol/lnacl)，超聲破(po)碎后(hou)，4℃，12000rpm，10min離心取上清(qing)液(ye)(ye)即為粗酶(mei)液(ye)(ye)，經測定(ding)，其(qi)酶(mei)活為93.99u/ml。經ni-nta親和層析和凝膠過濾層析純(chun)化(hua)(hua)破(po)碎液(ye)(ye)，測定(ding)純(chun)lcldh1的(de)(de)(de)(de)(de)比活性(xing)。經測定(ding)，純(chun)化(hua)(hua)后(hou)的(de)(de)(de)(de)(de)酶(mei)液(ye)(ye)的(de)(de)(de)(de)(de)比酶(mei)活為294.2u/mg。

實施例3重組菌全細(xi)胞催化苯(ben)丙酮酸生成l-pla

于1ml離(li)心管中加入(ru)300μl菌懸液(30mg濕(shi)菌體)和250μl磷酸鈉緩(huan)沖液(ph7.0)，37℃保溫5min，再(zai)依次加入(ru)50μl葡(pu)萄(tao)糖(終(zhong)濃度50mmol/l)和400μl苯丙(bing)酮酸(終(zhong)濃度10mmol/l)，反應(ying)1h后(hou)，取(qu)200μl反應(ying)液加入(ru)800μl甲醇終(zhong)止反應(ying)，過0.22μm有機(ji)濾膜，進(jin)行(xing)(xing)hplc分(fen)析；另(ling)取(qu)200μl反應(ying)液，用1ml乙酸乙酯進(jin)行(xing)(xing)萃取(qu)，上層有機(ji)相經無水硫酸鈉干燥后(hou)過0.22μm有機(ji)濾膜，進(jin)行(xing)(xing)對映(ying)選擇性(xing)分(fen)析。結(jie)果顯示，當體系反應(ying)40min后(hou)，l-pla的濃度為(wei)(wei)5.62mmol/l，產率為(wei)(wei)56.2％，eep>99％，當反應(ying)80min后(hou)，苯丙(bing)酮酸完全被消耗(hao)，產生8.59mmol/l的l-pla，產率為(wei)(wei)85.9％，eep>99％。

對照例1

具體實施(shi)方式同(tong)(tong)實施(shi)例2，區別(bie)在(zai)于(yu)，用僅(jin)含空pet-22b(+)和(he)無iptg誘(you)導的工程菌(jun)在(zai)相同(tong)(tong)條(tiao)件下(xia)誘(you)導表(biao)達，按照(zhao)實施(shi)例3測得(de)兩種工程菌(jun)催化苯丙(bing)酮酸，獲得(de)l-pla的濃度(du)僅(jin)為0.32mmol/l和(he)0.46mmol/l。

對照例2

合成編碼genbank登錄號為kte98134.1l-乳(ru)酸脫氫酶的(de)基(ji)因序列，將該基(ji)因命名為lcldh2，按照實施例1的(de)策略克(ke)隆該基(ji)因和構建表(biao)達質粒pet22b(+)-lcldh2，引(yin)物設(she)計為：

lcldh2-f:5′–catatgatggcaagaacaattggt–3′下劃線部(bu)分為ndeⅰ酶(mei)切(qie)位點(dian)

lcldh2-r:5′–ctcgagcttcattttttcaaaggtatc–3′下劃線部分為xhoⅰ酶(mei)切位點。

根據(ju)實(shi)施(shi)例(li)2的(de)策略，將lcldh2在e.colibl21(de3)中(zhong)進行異源(yuan)(yuan)表(biao)達，得(de)到重組(zu)(zu)菌e.coli/lcldh2。將重組(zu)(zu)菌按照實(shi)施(shi)例(li)2的(de)步驟進行異源(yuan)(yuan)表(biao)達得(de)到lcldh2，按照實(shi)施(shi)例(li)3將e.coli/lcldh2菌懸(xuan)液(ye)與(yu)10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應(ying)1h后進行液(ye)相檢測(ce)，結果產生3.5mmol/ll-pla，產率僅為35％，粗酶液(ye)的(de)酶活力為47.3u/mg。

對照例3

合成編碼genbank登(deng)錄號為cap07856.1的基因(yin)序列，將該(gai)(gai)基因(yin)命名(ming)為lcldh3，按照(zhao)實(shi)施例1的策略克隆(long)該(gai)(gai)基因(yin)和構建表達質粒(li)pet22b(+)-lcldh3。

lcldh3-f:5′–catatgatgcggaacaacggcaatat–3′下劃線部分為ndeⅰ酶切位點(dian)

lcldh3-r:5′–ctcgagagcttcttgagccttcttca–3′下劃線部分為xhoⅰ酶切位點。

根據(ju)實施例(li)2的策略，將lcldh3在e.colibl21(de3)中進行異(yi)源表達(da)，得(de)到重(zhong)組菌(jun)e.coli/lcldh3。將重(zhong)組菌(jun)按照實施例(li)2的步(bu)驟進行誘導表達(da)得(de)到lcldh3，按照實施例(li)3的步(bu)驟將e.coli/lcldh3菌(jun)懸液(ye)(ye)與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共同反應1h后進行液(ye)(ye)相(xiang)檢測(ce)，結果產(chan)生2.7mmol/ll-pla，產(chan)率為(wei)27％，粗酶液(ye)(ye)的酶活(huo)力為(wei)42.5u/mg。

對照例4

按照實施例1，將lcldh1連(lian)接至(zhi)pet28a(+)載體(ti)上，獲得重(zhong)組質(zhi)粒pet28a-lcldh1，將重(zhong)組質(zhi)粒導入bl21(de3)中(zhong)，得到重(zhong)組菌bl21/pet28a-lcldh1并(bing)進(jin)行誘導表達，按照實施例3將bl21/pet28a-lcldh1菌懸液與10mmol/l苯丙酮酸混勻，于37℃、220r/min共(gong)同(tong)反應1h后進(jin)行液相檢測，發現產(chan)生l-pla的濃度和lcldh1的對映選擇性相比于e.colibl21(de3)pet-22b(+)-lcldh1并(bing)沒有(you)提高。

雖(sui)然本發明(ming)(ming)已以(yi)較佳實施例公開(kai)如上，但其并非(fei)用以(yi)限定(ding)本發明(ming)(ming)，任何熟(shu)悉此技術的(de)人(ren)，在不脫離(li)本發明(ming)(ming)的(de)精(jing)神(shen)和(he)范圍(wei)內，都可(ke)做各(ge)種的(de)改動與修飾，因此本發明(ming)(ming)的(de)保(bao)護范圍(wei)應(ying)該以(yi)權利(li)要求書所界定(ding)的(de)為準。

sequencelisting

<110>江南大學(xue)

<120>一(yi)種干(gan)酪乳(ru)桿菌來源的l-乳(ru)酸(suan)脫氫酶(mei)及其應用

<160>8

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>978

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

gtggcaagtattacggataaggatcaccaaaaagttattctcgttggtgacggcgccgtt60

ggttcaagttatgcctacgcaatggttttgcaaggtatcgctcaggaaatcggaatcgtt120

gacattttcaaggacaagacaaagggtgacgcgattgacttgagcaacgcgctcccattc180

acaagtcctaagaagatttattcagctgaatacagcgatgctaaggatgctgatctggtt240

gttatcacagctggcgctcctcagaagcctggcgaaactcgtttggacttggttaacaag300

aacttgaagatcttgaagtccattgttgacccaatcgttgattccggctttaacggtatt360

ttcttagttgctgccaacccagttgacattttgacctatgcaacttggaaactttctggc420

ttcccgaagaaccgggttgttggttccggtacttcactggacaccgcccgcttccgtcag480

tccattgctgaaatggttaatgttgacgctcgttcggtccacgcttacatcatgggcgaa540

catggtgacactgaattccctgtatggtcccacgctaacattggtggcgttaccatcgct600

gaatgggttaaggctcatccagaaatcaaggaagacaagcttgttaagatgtttgaagac660

gttcgtgacgccgcttatgaaatcatcaaactcaagggtgcgaccttctatggtatcgca720

actgcccttgcccggatttcaaaggcaatccttaacgacgaaaatgcggttctgccactt780

tccgtttacatggatggtcaatatggcttgaacgacatctacatcggtaccccagctgtg840

atcaaccgtaatggtatccagaacatcctggaaatcccattgaccgatcacgaagaagaa900

tccatgcagaaatctgcttctcaattgaagaaggctctgaccgatgctttcgctaagaat960

gacatcgaaactcgtcag978

<210>2

<211>326

<212>prt

<213>人工(gong)序列

<400>2

valalaserilethrasplysasphisglnlysvalileleuvalgly

151015

aspglyalavalglysersertyralatyralametvalleuglngly

202530

ilealaglngluileglyilevalaspilephelysasplysthrlys

354045

glyaspalaileaspleuserasnalaleuprophethrserprolys

505560

lysiletyrseralaglutyrseraspalalysaspalaaspleuval

65707580

valilethralaglyalaproglnlysproglygluthrargleuasp

859095

leuvalasnlysasnleulysileleulysserilevalaspproile

100105110

valaspserglypheasnglyilepheleuvalalaalaasnproval

115120125

aspileleuthrtyralathrtrplysleuserglypheprolysasn

130135140

argvalvalglyserglythrserleuaspthralaargphearggln

0

serilealaglumetvalasnvalaspalaargservalhisalatyr

165170175

ilemetglygluhisglyaspthrglupheprovaltrpserhisala

180185190

asnileglyglyvalthrilealaglutrpvallysalahisproglu

195200205

ilelysgluasplysleuvallysmetphegluaspvalargaspala

210215220

alatyrgluileilelysleulysglyalathrphetyrglyileala

225230235240

thralaleualaargileserlysalaileleuasnaspgluasnala

245250255

valleuproleuservaltyrmetaspglyglntyrglyleuasnasp

260265270

iletyrileglythrproalavalileasnargasnglyileglnasn

275280285

ileleugluileproleuthrasphisglugluglusermetglnlys

290295300

seralaserglnleulyslysalaleuthraspalaphealalysasn

305310315320

aspilegluthrarggln

325

<210>3

<211>26

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>3

catatggtggcaagtattacggataa26

<210>4

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

ctcgagctgacgagtttcgatgtcatt27

<210>5

<211>24

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

catatgatggcaagaacaattggt24

<210>6

<211>27

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctcgagcttcattttttcaaaggtatc27

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>人工序(xu)列

<400>7

catatgatgcggaacaacggcaatat26

<210>8

<211>26

<212>dna

<213>人(ren)工(gong)序列

<400>8

ctcgagagcttcttgagccttcttca26