一組用于干酪乳桿菌的實時熒光定量pcr檢測的特異性引物和探針及檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物檢測方法技術領域，具體涉及一組用于干酪乳桿菌的實時熒光 定量PCR檢測的特異性引物和探針及相應的定量PCR檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 益生菌是一類有利于人體健康的活性微生物食品原料，目前常用的益生菌有嗜酸 乳桿菌和雙歧桿菌兩大類，與干酪乳桿菌一起被稱為"健康三益菌"，但國內目前對于干酪 乳桿菌研宄的不多。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei)能夠耐受有機體的防御機制，其 中包括口腔中的酶，胃液中低PH值和小腸的膽汁酸等，所以干酪乳桿菌進入人體后可以在 腸道內大量存活，從而起到調節腸內菌落平衡、促進人體的消化吸收等作用。同時，干酪乳 桿菌具有高效降膽固醇，并且能誘導產生抗菌素，促進細胞分裂，產生抗體免疫及抗癌等作 用。干酪乳桿菌還具有緩解乳糖不耐癥，增強人體免疫，緩解過敏，降低膽固醇以及預防癌 癥和抑制腫瘤生長等益生保健作用。因此檢測干酪乳桿菌的含量對于檢測干酪和乳酸菌中 有益菌含量，增強機體免疫力至關重要。
[0003] 乳桿菌種類多，表型相似，很難快速準確區分，傳統的定量檢測方法依靠特定的微 生物培養基對食品中活菌進行分離和計數，測試過程需要進行培養基準備、平板培養、菌落 計數、生化鑒定等步驟，所以整個檢測顯得復雜、費時，且準確率低。因此，迫切需要研宄建 立快速、準確、靈敏的檢測新方法。實時熒光定量PCR技術以其較高的可重復性、靈敏性以 及準確性在微生物定量以及乳酸菌定量研宄領域得到廣泛應用。
[0004] 實時焚光定量PCR (Fluorescence quantitative PCR)技術從常規PCR定性檢測 邁上量化的臺階，實現了 PCR技術從定性到定量的飛躍，避免了傳統PCR定量鑒定中交叉污 染的問題，它相對常規PCR技術先進、操作簡便，實現了實時監測、絕對定量和快速檢測的 目的，同時具有靈敏度高、特異性好、操作便捷等優點，因此非常適合乳酸菌的檢測。采用 乳桿菌種特異性、定量檢測方法，可以簡化益生菌的檢測程序、提高檢測效率，能提高我國 益生菌的檢測能力，完善保健食品的質量監管，并為益生菌產業的長遠發展提供技術保障。

【發明內容】

[0005] 本發明提供了一組用于干酪乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探 針及相應的定量PCR檢測試劑盒。能廣泛應用于快速、靈敏、特異性好的檢測干酪乳桿菌。
[0006] 本發明提供一組用于干酪乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測的特異性引物和探針， 探針采用Taqman探針，所述引物和探針的核苷酸序列如下：
[0007] 上游引物：5 ' -CCGCGTGATGAGGATATTTATG-3 '
[0008] 下游引物：5 ' -AGACTTGCGAGCAAACTGGC-3 '
[0009] 探針：5' -CGCCAAACGGCAAGTGCCAGA-3' ；
[0010] 所述引物和探針擴增的目標核苷酸序列參見序列表中SEQ ID No. 2。
[0011] 上述引物和探針的衍生序列也為本發明的保護范圍，所述衍生序列包括引物序列 的互補鏈序列，同時還可以向5'端和3'端方向延伸一至數個堿基或刪減一至數個堿基得 到的序列。
[0012] 優選地，所述探針的5'端熒光報告基團是FAM、TET、J0E、HEX或VIC，3'端標記的 是熒光淬滅基團TAMRA、DABCYL或BHQ。
[0013] 本發明還提供一種干酪乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括 權利要求1所述的引物和探針。
[0014] 本發明的第三個目的是提供上述試劑盒在定量檢測干酪乳桿菌含量中的應用。
[0015] 優選地，所述應用為定量檢測益生菌酸奶、干酪中干酪乳桿菌含量。
[0016] 本發明的第四個目的是提供干酪乳桿菌的實時熒光定量PCR檢測方法，步驟如 下：
[0017] (1)制備標準品：將干酪乳桿菌polA保守基因片段插入到載體PMD18-T中，獲得 含有polA保守基因片段的重組質粒，以此作為標準品；所述干酪乳桿菌polA保守基因片 段參見序列表中SEQ ID No. 1的第165-458位核苷酸序列；
[0018] (2)標準曲線繪制；
[0019] (3)使用權利要求1所述的特異性引物和探針對待測樣品和標準品采用相同的反 應體系進行實時熒光PCR擴增；
[0020] (4)通過標準曲線和待測樣品的Ct值進行益生菌乳制品中干酪乳桿菌的快速定 量檢測。
[0021] 優選地，所述干酪乳桿菌polA保守基因片段是通過以下引物擴增得到的：
[0022] 上游引物為 5' -ATCCTGACGAAAACAGCAATGA-3'，
[0023] 下游引物為 5' -TTCAGTGCCCATAGCCTTCA-3'。
[0024] 優選地，步驟（3)中所述引物和探針的用量均為1. 0 y 1。
[0025] 優選地，步驟（3)中所述實時熒光PCR擴增的反應條件為：94°C預變性2分鐘， 94°C 15秒、60°C 40s并收集熒光信號，40個循環。
[0026] 本發明提供用于對干酪乳桿菌進行定性、定量檢測的引物和探針，可以通過提取 待檢測樣品的DNA或者提取RNA將反轉錄得到的cDNA結合實時熒光定量PCR檢測技術， 可達到快速、準確、靈敏、特異性好的定量待測標本中干酪乳桿菌含量的目的。本發明所提 供的引物和探針可對乳制品和干酪中的干酪乳桿菌含量進行定性、定量分析，對判斷乳制 品及干酪中干酪乳桿菌的含量具有重要意義，本發明將在食品微生物檢測領域發揮重要作 用。
【附圖說明】
[0027] 附圖用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與本發明的實 施例一起用于解釋本發明，并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0028] 圖1為引物和探針體系優化實驗結果；其中，a代表上下游引物1.6UL，探針 1. 6 y L ;b代表上下游引物2 y L，探針0. 8 y L ;c代表上下游引物1. 6 y L，探針0. 8 y L ;d代 表上下游引物1 u L，探針1. 6 y L ;e代表上下游引物2 y L，探針1. 6 y L ;f代表上下游引物 2 y L，探針1. 0 y L ;g代表上下游引物1 y L，探針0. 8 y L ;h代表上下游引物1. 6 y L，探針 1. 0 y L ;i代表上下游引物1 y L，探針1. 0 y L ;
[0029] 圖2為靈敏度實驗結果；其中，a代表質粒濃度為1.00X 108COpies/ml、b代表 質粒濃度為1. 〇〇X 107copies/ml、c代表質粒濃度為1. 00X 106copies/ml、d代表質粒濃 度為1.00X 105COpies/ml、e代表質粒濃度為1.00X 104COpies/ml、f代表質粒濃度為 L 00X 103copies/ml、g 代表質粒濃度為 L 00X 102copies/ml ;
[0030] 圖3為特異性實驗結果，其中出現標準擴增曲線的為干酪乳桿菌質粒，未出現標 準擴增曲線的為嗜熱鏈球菌、乳雙歧桿菌、長雙歧桿菌、植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪 乳桿菌、保加利亞乳酸菌、嗜酸乳桿菌、卷曲乳酸菌、嗜酸乳酸菌、陰性對照；
[0031] 圖4為干酪乳桿菌標準曲線。
【具體實施方式】
[0032] 以下的實施例便于更好地理解本發明，但并不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法；所用引物、探針和所用序列測定工作均由生工生物工 程（上海）股份有限公司合成和完成。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為 自常規生化試劑商店購買得到的。
[0033] 實施例1干酪乳桿菌（DNA polymerase I gene) polA基因標準品的制備
[0034] 要建立實時熒光定量PCR方法，首先必須制備方法所需的外部標準品，標準品應 包含高度保守、特異的序列，要保證反應的高特異性。P〇lA基因序列具有高度的保守型，其 特別功能區有豐富的半胱氨酸和四個獨一無二的插