專利名稱：用于體內轉化皮質甾類前體藥物的催化性單克隆抗體的制作方法
技術領域：
本發明涉及名稱為“抗體酶”的催化性單克隆抗體，其可用于體內轉化皮質甾類前體藥物，還涉及所述抗體在制備用于治療急性腎上腺皮質功能不全的藥物中的應用。本發明也涉及用于制備所述抗體酶的方法。
背景技術：
急性腎上腺皮質功能不全是非常危險的病癥，并且經常具有致命的后果。它可以在膿毒癥，急性氣喘危象，創傷，手術，血容量減少病癥和燒傷后的休克和虛脫狀態，心肌梗塞，肺栓塞，嚴重的水腫狀態(血管神經性水腫，聲門水腫，肺水腫)，急性胰腺炎，血清注射后的過敏性反應，轉輸意外，藥物過敏反應，嚴重的變應性反應，中風，兒童期急性中毒和意外的中毒，肝炎和肝昏迷，甲狀腺毒性和艾迪生危象，閉塞性血栓脈管炎。
目前使用的治療方法包括用高劑量的皮質甾類靜脈治療。但是，皮質甾類在這樣的治療用途中的臨床應用還沒有被合適的臨床研究證實，相反，絕大部分的臨床試驗沒有給出清楚的功效結果。所使用的產品的藥物動力學特性可以決定這種不確定性，另一方面這既不能歸因于方法學的誤差也不能歸因于在所述的療法中來自類固醇的藥理學活性的缺乏。由于皮質甾類是水不溶性的，它們必須與親水載體綴合，以便可以將它們注射。但是，它們的生物學活性只有在分離親水部分之后才能保持，從而釋放皮質甾類，以這種方式，它們可以穿過細胞膜并且結合到胞質受體上。可的松分子和親水部分之間的鍵的體內斷裂是非常慢的，因為該分子是中等穩定性的，并且在血流中不存在特異性酯酶。因此，活性成分的生物利用率不是立即的，并且只有在幾個小時之后才能觀察到治療應答，導致患者生存的危險性。
皮質甾類仍然是治療需要應急措施的急性綜合癥的可選擇的藥物，盡管其作用機理目前還沒有被完全澄清并且尚未獲得對其功效的他覺查明的對照研究。類似于急性腎上腺皮質功能不全，過敏性休克，血容量減少休克和心源性休克，喉水腫和其它病狀的情形通常用高劑量的可的松藥物(500毫克到10克)通過靜脈途徑治療，并且在24小時過程中每隔1-2小時重復給藥，直到患者產生臨床應答。在危象之后的幾天進一步以較低劑量將該治療延長，直到達到癥狀的控制和生命參數的恢復。隨后，以低劑量維持治療通常是必要的，甚至通過口服途徑。而且，眾所周知，也可以將皮質甾類廣泛地用于治療退化，炎性和瘤形成類型的亞急性和慢性疾病，例如腎小球性腎炎，腎改變，系統性紅斑狼瘡，關節炎，類風濕性心肌炎，支氣管哮喘，變應性疾病，腸道和肝臟疾病，真皮改變，淋巴瘤，霍奇金疾病，心包炎，天皰瘡，紅皮病和其它病癥。在這些病例中延長治療和高劑量對于在作用位點獲得活性成分的合適的濃度也是必要的，結果導致皮質甾類典型的副作用。
在延長治療之后產生的不利影響主要包括對腦垂體和腎上腺功能的抑制，氫的和電解的體內平衡的紊亂，高血壓，高血糖，糖尿，對感染的增強的敏感性，骨質疏松癥和神經病。已經證實這樣的不良反應是由于藥物內在的活性，但是皮質甾類的動力學特性也對整個副反應有強烈的影響。成為這些特性使得這樣的治療方案強制性的，如下文解釋的。
現有技術為了克服用皮質甾類進行應急治療的缺陷，已經嘗試了幾種治療方案，例如針對敗血癥性休克。為了調節急性全身性炎癥，已經使用了阻止細胞因子類型的炎癥介質或滅活內毒素的單克隆抗體。但是，在急性過程中牽涉到的這些分子是特別多的和豐富的，僅僅選擇性抑制這些分子中的一個或一些在治療上是不夠的，因此已經放棄了所述的治療方案。用于澄清糖皮質激素的作用機制的最近的藥理學研究顯示通過刺激或抑制DNA轉錄而抑制炎性過程的不同方面(細胞因子，氧化氮，前列腺素，白三烯的產生，粘著分子在細胞表面的表達等等)，這些藥物通過與它們的特異性胞質受體的相互作用能夠控制炎癥。根據這些結果，皮質甾類在應急治療中的使用有待重新估價。另一方面，這類藥物的一些特性，特別是結構特性不允許充分利用其真正的治療能力，并且由于該理由其臨床療效仍然值得懷疑。
眾所周知，為了產生其特有的作用，藥物必須在其作用位點達到合適的濃度，所述的濃度取決于給藥的產品的量和該物質的吸收程度和其它動力學參數。特別是吸收過程受例如分子的形式和尺寸，離子化程度，在親脂溶劑中的溶解性等因素的影響。
就皮質甾類而言，它們是親脂分子，因此它們必須穿過細胞膜并且結合到其胞質受體上以便利用其藥理學活性。這一方面構成了其治療應用的主要問題。所述化合物的親脂性顯然阻礙了在含水溶劑中的溶解性，及其在血流中的擴散，因此使它們在作用位點的利用率遭致損害。為了克服這個缺點，已經通過共價鍵將該類分子綴合到特定的親水分子(載體)上，允許其溶解。例如，對于可的松，已經用磷酸，硫酸，琥珀酸，半琥珀酸或乙酸，叔丁乙酸，丙酮化合物，雙乙酸，六丙酮基團將位置11，17或21酯化。
不幸的是，如果一方面這個酯鍵使該物質成為可溶的并且允許其給藥和在血液循環中擴散，同時阻礙了其通過細胞膜。因此該產品只有在前體藥物的酯鍵斷裂并且釋放親脂活性成分之后才能利用其藥理學活性。另一方面，該生物體沒有能夠斷裂這種類型的鍵的酯酶，因此水解過程是非常緩慢的并且該活性成分的生物利用率同樣是不足的。很明顯，對于其中需要應急治療作用的病狀，這樣的藥物動力學特性經常產生負結果。
因此，需要具有某種形式的活性成分，所述成分可溶解于水性藥物制劑，例如注射制劑中，并且一旦在血流中，便能以親脂形式迅速得到利用以便快速穿過細胞膜并且發揮其自身的藥理學作用。
催化性單克隆抗體和其在活化前體藥物中的用途是熟知的，例如公開在化學文摘(114)610w，(119)210716q，(121)195943g和(122)28553d中。一般的方案是基于催化性單克隆抗體(抗體酶)的開發，該抗體可以針對模擬參加化學反應的化合物的過渡態的分子結構的半抗原而產生。在參加化學反應的分子的起始和最終排列中存在其中構成原子和所有分子的勢能達到最大值的中間體構型。該構型相應于過渡態并且趨向于確保反應的最終排列以便使勢能恢復到較低的水平。
抗皮質甾類的抗體酶或其衍生物是未知的。
在抗體酶的制備中遇到的問題是要查明合適的半抗原的化學結構。
WO8910754公開了能夠斷裂酯鍵的催化性單克隆抗體，并且在任何情況下都可以體內活化前體藥物。在這篇現有技術中所提供的教導旨在解決激活或滅活肽類生物分子的問題，并且提供一系列的肽類半抗原。
WO9302703具體地涉及抗腫瘤治療，其中皮質甾類是以前沒有預見的。
WO9416734涉及一種治療方法，其中通過一種復合結構將效應分子中的藥物釋放到預定的細胞位點，所述的結構提供了連接到細胞位點上的第一種反應劑，以擴增的模式連接到所述的第一種反應劑上的第二種反應劑，效應分子又連接到所述的第二種反應劑上，此后釋放活性組分。這些反應劑具有抗體作為形成不同鍵的官能團，但是也可以把它們比作抗體。該效應分子可以是藥物并且可以連接到載體分子，例如蛋白質上。該藥物也可以是前體藥物，因為也提供了釋放活性部分的酶促劑；或該效應分子可以是催化前體藥物轉化的酶。
活性組分的選擇性釋放出現在受體位點或其附近，并且在任何情況下都有將活性藥物引導到作用位點的作用。該具體教導針對在腫瘤的診斷或治療中的有效的引導分子。
JP94220072公開了抗抗生素的抗體酶。
在設計對完整的一類藥物，而不是對單個的化合物有效的過渡態的合適的同系物需要具有唯一的標準。而且，也需要具有這樣的同系物，不依賴于綴合到甾類分子上的親水部分。
具體的問題在于在可的松前體藥物中酯功能的快速水解，因為在生物體中不存在能夠釋放所討論的藥物的特異性酯酶。關于獲得抗酯形式的前體藥物的抗體酶的問題的一般性術語都包括在現有技術中膦酸功能被指明為模擬過渡態，也描述了與載體蛋白質偶聯的基團。但是，沒有對本領域的技術人員指明關于怎樣將偶聯基團定位到甾類分子和其中與過渡態的模擬基團的關系這樣的關鍵問題。
因此，所使用的半抗原的類型是非常關鍵的，并且過渡態的偶聯和模擬基團的相互位置是更關鍵的。
WO8910754除了提到一般性的計算機模擬技術，特別是詳細地講了某些蛋白質，例如人腎素，HIV gp120被膜蛋白的選定的肽鍵的斷裂。
WO9302703論述了免疫抑制，抗病毒，抗腫瘤和細胞毒性劑的前體藥物的具體問題，選擇酯化藥物的部分以便保護可能的前體藥物免受內源性酯酶的破壞，并且僅在隨后，一旦已經達到了合適的治療水平，便釋放活性成分。在某一方面，技術問題是本發明所解決的問題的反面，其中水解必須在最短的可能的時間內完成，因為必須在應急治療方法中，而不是在慢性治療起作用。
發明摘要現在已經發現適合于生產抗皮質甾類水溶性前體藥物的抗體酶的半抗原是在羥基上攜帶磷酸基團的甾類結構的化合物，所述的基團在相應的皮質甾類中綴合到親水載體上，和在甾類骨架的位置C-3上攜帶適合于與大分子綴合的化學基團，所述的化學基團是離所述的磷酸基團可能最遠的。
因此，本發明的目的之一是通式(I)的化合物R-[A]-OR-PO3X2(I)其中A是皮質甾類激素的甾類核；R是連接到孕烷環A的C-3位上的化學基團并且適合于與免疫原大分子綴合；PO3X2是連接到21-或17-位置的羥基上的磷酸基團(其在相應的皮質甾類激素上攜帶親水分子)；X是氫或藥物上可接受的陽離子。
通過R與適合于在動物中產生抗體應答的分子適當地綴合的通式(I)的化合物構成了半抗原，從該半抗原將得到特異性抗皮質甾類的不同水溶性前體藥物的催化性單克隆抗體(抗體酶)。
所述的抗體酶或其片段或其工程化的片段是本發明的另一個目的。
本發明的另一個目的是抗體酶對于制備適用于治療急性腎上腺皮質功能不全的藥物的應用。
由于活性成分的較高的生物利用率由本發明所獲得的主要優點在于獲得即時的治療效果的可能性，在應急情況下，這將允許使所治療的患者成功地獲得較高存活率。
由于可即時獲得皮質甾類的藥理學作用，所以有可能以低劑量使用。
由于活性成分的較高的生物利用率，使用較低劑量的可能性和減少治療時間的機會能使以上列出的慢性疾病得到有效的治療，以避免副作用。
本發明的這些和其它的目的將借助于實施例進行更詳細的公開。
發明詳述在通式(I)的化合物中，(A)是天然的或合成的皮質甾類的甾族核。
腎上腺皮質激素的例子是皮質醇，氟代可的松，去炎松，地塞米松，強的松，可的松和倍他米松。
適合于與免疫原大分子綴合的R化學基團的例子是疊氮基，對-苯偶氮基-β-D-乳糖苷(Lac)，對-苯偶氮基-β-D-葡糖苷(Glu)，對-苯偶氮基-胂酸鹽(Ars)，三硝基苯磺酸鈉(TNBS)，二硝基苯磺酸鈉(DNBS)，二硝基苯基(DNP)和S-乙酰-巰基琥珀酸酐。其中，疊氮基團是優選的。
水溶性皮質甾類前體藥物的例子是用于注射制劑中的那些。優選的例子是倍他米松磷酸鈉，倍他米松磷酸鈉和乙酸鈉，乙酸可的松，皮質醇磷酸鈉，皮質醇琥珀酸鈉，乙酸可的松，乙酸地塞米松，地塞米松磷酸鈉，乙酸強的松，甲基強的松琥珀酸鈉，乙酸強的松，強的松磷酸鈉，叔丁乙酸強的松，氟羥脫氫皮質醇丙酮化合物，二乙酸氟羥脫氫皮質醇，氟羥脫氫皮質醇六丙酮化合物。21-半琥珀酸皮質醇，21-乙酸皮質醇，21-磷酸皮質醇，17-半琥珀酸皮質醇，17-乙酸皮質醇，17-磷酸皮質醇是更優選的實施例。
從各個活性成分，即，從藥理學活性的甾類或其商品衍生物開始制備通式(I)的化合物。例如，在需要的位置已經攜帶磷酸酯基團的活性成分是商品或可以從熟知的方法制備。然后，根據文獻描述的常規方法插入選定的R基團。
一旦獲得了通式(I)的化合物(半抗原)，將它與免疫原大分子綴合。這樣的大分子的例子是KLH，BSA，卵白蛋白，甲狀腺球蛋白，雞IG，多糖。
然后將半抗原-載體綴合物用于免疫接種動物，利用常規方法從該動物獲得催化性單克隆抗體(抗體酶)。
本發明的目的之一是抗皮質甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶或其片段或其工程化片段。
通常，將免疫接種動物的脾細胞與骨髓瘤細胞系融合，在選擇雜交瘤和陽性克隆之后，純化抗體酶。
用于獲得抗體酶的程序不是關鍵的并且對于選擇動物，免疫接種方案，特定的骨髓瘤細胞系(或其它無限增殖化細胞)沒有特別的限制。
本發明的抗體酶的純化方法絕對是常規的并且在本領域技術人員的正常能動性范圍內。
本發明的第一個優選的實施方案涉及在位置21取代的可的松半抗原。它是化合物21β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-酮-3-亞肼基-4’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯，也就是通式(I)的化合物，其中(A)是可的松的甾族組分，R是3-亞肼基-4’-疊氮苯甲酰胺基團，X
該化合物構成了半抗原。
可以觀察到用作為半抗原的化合物的分子結構不具有對應于可的松的任何前體藥物的親水部分的側鏈。代替對于每個現存的可的松前體藥物合成過渡態的類似物，本發明允許對于每個確定的活性成分提供不依賴于親水殘基的每種前體藥物的斷裂反應的過渡態的類似物。
因此，該抗體將識別由除了甾族組分以外的斷裂點代表的分子的部分，而可以是半琥珀酸鹽，磷酸鹽或其它熟知的載體之一的親水部分不太重要。根據相同的原理，也可以將其它可的松衍生物用作為治療劑，例如不同于可的松的甲基強的松，其在位置6-α存在甲基基團，只有當連接到半琥珀酸殘基(半琥珀酸強的松，URBASON(R)SOLUBILE，8，20，40，250毫克)時才能用于注射制劑。
對于半抗原分子，磷酸基團存在于-21位置，模擬酯基團的水解的過渡態，是在空間上與四元碳類似的。
打算用于與載體蛋白建立鍵的基團連接到位置3，在該分子中它代表與位置21或17最遠的碳原子，其上存在親水取代基。
根據本發明，催化性抗體能夠識別靠近反應中心的甾族分子的重要部分。事實上，將大分子載體連接到位置C3的疊氮化物上，使得分子的該組分可用于免疫識別，其中反應必須真正發生。于是，所激發的抗體便可識別C21的結合位點和甾類分子的主要部分。
通過將商品二氫可的松-21-磷酸酯與4-疊氮苯甲酸的酰肼縮合已經獲得了半抗原；已經從4-氨基苯甲酸開始通過下面的反應步驟制備了后一化合物與水中的硝酸重氮酸化，隨后與氮化鈉反應以獲得4-疊氮苯甲酸；后者用鹽酸甲醇酯化；在中間體甲基酯的甲醇中進行肼解反應。通過在密閉管瓶中將溶于甲醇(3毫升)的等摩爾量(2毫摩爾)的反應劑加熱到90℃，3小時進行半抗原與二氫可的松-21-磷酸酯的縮合，直到獲得澄清的溶液，通過溶劑蒸發將半抗原以固體形式從中分離出來。根據在RMN光譜上連接到C-4上的乙烯基信號的移動推斷出在反應混合物中半抗原的存在。
由于其低分子量，作為類似物合成的分子缺乏免疫原能力，而所說的免疫原能力是當它們與大分子載體綴合時獲得的。在通常的實驗條件下，更經常使用的分子載體是蛋白質。于是，將修飾的甾類(半抗原)綴合到蛋白質上以便保證需要的分子區(抗原決定簇)的最大的顯露已成為必需的。在優選的實施方案中，KLH是選定的蛋白質。
綴合到大分子載體上的模式取決于在半抗原分子上可利用的官能團的類型。用半抗原化學修飾蛋白質的不同方法是可獲得的，并且一般可以使用，然后選擇最有效的。通過吸收分光光度法估測取代的摩爾比。
根據不同的治療方案，通過皮下注射途徑(與完全和不完全弗氏佐劑)和通過腹膜內途徑，將半抗原-蛋白質載體綴合物用于免疫接種8-10周齡的Balb/c小鼠。
在治療期結束時，抽取動物的血清以驗證產生了針對抗原的免疫應答，然后產生需要的催化活性。
一旦選擇了產生較高抗體應答的動物，根據常規的方法進行單克隆抗體的制備(將脾細胞與骨髓瘤細胞融合，通過下文公開的放射性測定方法篩選雜交瘤家族，選擇陽性克隆，純化抗體)。
為了使催化性抗體的效力最大化，可以采取不同的策略進行-修飾過渡態的類似物；-從在噬菌體上表達的合并文庫選擇抗體(噬菌體顯示)；-借助于位點特異性誘變修飾以前用標準方法獲得的催化性單克隆抗體。
本發明的抗體酶具有抗皮質甾類激素的水溶性前體藥物的催化活性，因此它們可用于治療腎上腺皮質功能不全，特別是應急治療，其中該藥物的最快的作用是必需的。
因此，本發明的目的之一是抗皮質甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶對于制備用于治療用可的松藥物可治愈的病狀的藥物的應用。具體地說，本發明的應用包括在治療急性腎上腺皮質功能不全，膿毒癥，急性氣喘危象，創傷，手術，血容量減少病癥和燒傷后的休克和虛脫狀態，心肌梗塞，肺栓塞，嚴重的水腫狀態(血管神經性水腫，聲門水腫，肺水腫)，急性胰腺炎，血清注射后的過敏性反應，轉輸意外，藥物過敏反應，嚴重的變應性反應，中風，兒童期急性中毒和意外的中毒，肝炎和肝昏迷，甲狀腺毒性和艾迪生危象，閉塞性血栓脈管炎中的應用。
本發明的另一個目的是抗皮質甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶對于制備用于治療退化，炎性和瘤形成類型的亞急性和慢性疾病，例如腎小球性腎炎，腎改變，系統性紅斑狼瘡，關節炎，類風濕性心肌炎，支氣管哮喘，變應性疾病，腸道和肝臟疾病，真皮改變，淋巴瘤，霍奇金疾病，心包炎，天皰瘡，紅皮病和其它病癥的藥物的應用。
抗體酶的給藥將由主治醫生根據病狀的類型，患者的狀態和有關的前體藥物的類型確定次數和劑量。
本發明的抗體酶可以與相應的前體藥物同時給藥或以由有經驗的醫生確立的一定的順序給藥。
方便的是，將本發明的抗體酶配制為藥物組合物，所述的組合物也包括在本發明的范圍內。該組合物含有有效量的抗體酶，該有效量根據所述前體藥物的比活性來確定。
本發明的組合物含有與藥物上可接受載體和賦形劑混合的抗體酶，并且可以以熟知的方法例如在Remington’s藥物科學手冊(美國紐約Mack出版社出版)中描述的方法制備。
可注射的組合物是優選的。
本發明也包括藥盒，它以分離的形式含有一種包括合適量的本發明的抗體酶的藥物組合物和一種包括藥物上有效量的(對抗體酶而言)皮質甾類的水溶性前體藥物的藥物組合物。
下面的實施例進一步說明本發明。實施例a)半抗原21β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-酮-3-亞肼基-4’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯的制備通過將50毫克3-疊氮苯甲酰基肼和150毫克的非純化的21-磷酸皮質醇蒸發至干獲得標題化合物。
b)與KLH綴合將20毫克KLH(六聚體，分子量450000克/摩爾)溶解于10mM碳酸氫鉀，pH7.4，5毫升至終濃度為4毫克/毫升。
將未純化的上述產物溶解于相同的溶液，計算出200摩爾過量的21-磷酸皮質醇衍生物。計算出所使用產物的量，假設所有的甾類以活性的取代的疊氮形式存在
(考慮這樣的事實在起始的反應混合物中有1份疊氮化物和3份21-磷酸皮質醇，4/3用來校正質量。
該溶液用未掩蔽的200W-汞蒸汽燈，用冷光，在攪拌條件下照射20分鐘。
將產物通過用相同的反應緩沖液平衡的Sephadex G 50 Zim Δ 2厘米×5厘米。
通過測量體積收集(A280)峰值的餾份。為了預測每體積單位的磷酸酯的含量，假設獲得了最大摩爾取代比(200∶1)，并且借助于Ames測試以合適的體積和稀釋度估測磷酸酯的量。將Ames測試用于10微升的反應KLH并且獲得A280＝0.981的值。
由于該測試的消光系數是A280＝0.240/0.01微摩爾的磷酸酯，所以結果為
其中取代摩爾比為[P][KLH]=3.28×10-3M5.55×10-6M=591]]>c)以綴合物免疫接種小鼠并控制抗體活性根據不同的治療方案，通過皮下注射途徑(與完全和不完全弗氏佐劑)和通過腹膜內途徑，將半抗原-蛋白質載體綴合物用于免疫接種8-10周齡的βalb/c小鼠。
在治療期結束時，抽取動物的血清以驗證產生了針對抗原的免疫應答，然后產生需要的催化活性。
為了進行這種控制，按照順序進行特定的放射性測定從37Mbq的[1，2，6，7-3H]皮質醇(Amersham)開始合成了用氚(3H-C21-H)標記的[1，2，6，7-3H]-11β，17α-二羥基-4-孕烯-3，20-二酮-21半琥珀酸酯。
為了獲得具有ba60％的計數效率的50.000cpm的分析信號，體積為100微升的工作濃度如下
從理論上說可能標記的質量允許制備等同于
的工作溶液的體積。
由于以等同于10微摩爾濃度(從文獻獲得)的底物的真正濃度的工作是合適的，所以制備下列總量的底物是必要的2.664×10-6摩爾/升＝2.664×10-5摩爾由于標記物的量等同于37×106bq/2.11×1015bq/摩爾＝1.7×10-8摩爾，其對總質量的貢獻是可忽略的。
從2.664×10-5摩爾×362克/摩爾＝9.6×10-3克可獲得皮質醇的分子量＝62.5克/摩爾的冷載體的量。
將此質量的皮質醇分配于反應管瓶(React.Vial Pierce)中，其中標記的溶劑已經在T0(最大)30℃的氮氣流下蒸發。
將皮質醇溶解于200微升的無水吡啶，以便與具有三摩爾倍過量的琥珀酸酐的堿性催化劑反應2.664×10-5摩爾×3×100.1克/摩爾＝8.0×10-3克將反應混合物在恒定攪拌的條件下在室溫下放置15小時。
在保溫結束時，將該混合物轉移到分液漏斗中，再用200微升吡啶洗滌反應管瓶。
用400微升的鹽酸37％使吡啶固化。在用水稀釋之后，用乙酸乙酯提取(3次)。
以這種方式，可以獲得標記的皮質醇，蒸發獲得需要的產物的結晶。
在制備標記的反應底物之后，建立了放射性酶促測定。
該方法基于冷的琥珀酸組分從氚化皮質醇的核上除去之后溶解度的變化。在將底物與反應基質(緩沖液，克隆的上清液或整個人血清)接觸保溫之后，水相用乙醚提取，隨后進行溶劑的蒸發和在3H皮質醇發出的放射性信號的提取物中的測量。通過在其熔點用蒸餾水跳躍稀釋(16×)在需要的時刻終止保溫。如果催化速度依賴于催化劑濃度和溫度，并且考慮保溫在38.5℃(相應于人體內部溫度)下進行，該程序允許反應速度降低16×24倍(記住T每降低10℃，AE＝20hJ/摩爾，速度)，因此可被認為是令人滿意的。
通過渦旋10秒進行用乙醚的提取。在提取期間，在如此有限的時間內允許反應在水相中仍處于失去平衡的狀態。
通過利用五個在不同的時間在人血清中保溫的底物的不同的摩爾濃度對該程序進行限定。
與對照樣品相比，僅僅在底物濃度＞100mM和在高于1小時的保溫時間時檢測到人血清中的皮質醇-21-半琥珀酸酯的自發的酯酶活性。
因此已經將該方法用于鑒定免疫接種的動物，所述的動物產生了陽性免疫應答，這是由于具有抗皮質醇-21-半琥珀酸酯的酯酶活性的抗體的產生。在等同于10mM的底物濃度下和在保溫1小時之后進行的該測定的結果給出了下列跡象在用半抗原-載體綴合物免疫接種的小鼠的血清中發現了高于未治療的動物和空白對照的血清中存在的活性的酯酶活性。
權利要求
1.抗皮質甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶或其片段或其工程化的片段。
2.抗皮質甾類激素的水溶性前體藥物的抗體酶，其可由包括下列步驟的方法獲得a)所述的前體藥物的過渡態的半抗原類似物與免疫原大分子綴合以產生綴合物，所述的半抗原具有通式(I)的結構R-[A]-OR-PO3X2(I)其中A是皮質甾類激素的甾類核；R是連接到孕烷環A的C-3位上并且適合于與免疫原大分子綴合的化學基團；PO3X2是連接到21-或17-位置的羥基上的磷酸基團(其在相應的皮質甾類激素上攜帶親水分子)；X是氫或藥物上可接受的陽離子；b)獲得抗所述綴合物的催化性單克隆抗體。
3.根據權利要求1或2所述的抗體酶，其中所述的前體藥物是皮質醇，氟代可的松，氟羥脫氫皮質醇，地塞米松，強的松，可的松，倍他米松的水溶性衍生物。
4.根據權利要求3所述的抗體酶，其中所述的前體藥物是皮質醇的水溶性衍生物。
5.根據權利要求4所述的抗體酶，其中所述的前體藥物選自于下列組21-半琥珀酸皮質醇，21-乙酸皮質醇，21-磷酸皮質醇。
6.根據權利要求4所述的抗體酶，其中所述的前體藥物選自于下列組17-半琥珀酸皮質醇，17-乙酸皮質醇，17-磷酸皮質醇。
7.根據權利要求1或2-6任一項所述的抗體酶，其中所述的半抗原是化合物21β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-二酮-3-亞肼基-3’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯。
8.根據權利要求2-7任一項所述的抗體酶，其中所述的大分子是蛋白質。
9.根據權利要求8所述的抗體酶，其中所述的蛋白質是KLH。
10.根據權利要求2-8任一項所述的的抗體酶，其中所述的單克隆抗體是通過以在步驟a)中獲得的所述的綴合物免疫接種動物獲得的。
11.根據權利要求2-8任一項所述的的抗體酶，其中所述的單克隆抗體是通過體外免疫接種獲得的。
12.權利要求1或2-10的抗體酶作為藥物的應用。
13.權利要求1或2-10的抗體酶對于制備可用于以皮質醇藥物可治愈的治療方法的藥物的應用。
14.權利要求1或2-10的抗體酶對于制備治療急性腎上腺皮質功能不全的藥物的應用。
15.含有有效量的權利要求1或2-10的抗體酶與藥物上可接受載體和賦形劑混合的藥物組合物。
16.根據權利要求15所述的藥物組合物，該組合物是可注射形式。
17.包括至少一種含有有效量的權利要求1或2-10的抗體酶與藥物上可接受載體和賦形劑混合的藥物組合物和另一種藥物組合物的試劑盒，后一組合物含有對抗體酶的量而言有效量的皮質甾類激素的水溶性前體藥物。
18.通式(I)的化合物R-[A]-O-PO3X2(I)其中A是皮質甾類激素的甾類核；R是連接到孕烷環A的C-3位上并且適合于與免疫原大分子綴合的化學基團；PO3X2是連接到21-或17-位置的羥基上的磷酸基團(其在相應的皮質甾類激素上攜帶親水分子)；X是氫或藥物上可接受的陽離子。
19.根據權利要求18所述的化合物，該化合物是11β，17α-21-三羥基-4-孕烯-20-二酮-3-亞肼基-3’-疊氮苯甲酰胺-21-磷酸酯。
20.權利要求18或19的化合物在制備權利要求1或2-10的抗體酶中作為半抗原的應用。
全文摘要
本發明公開了用于體內轉化皮質甾類前體藥物的催化性單克隆抗體(抗體酶)。這些抗體酶有利地用于急性腎上腺皮質功能不全的應急治療,以便促進皮質甾類的藥理學作用。還公開了產生抗體酶的半抗原。
文檔編號C07J51/00GK1268174SQ98808387
公開日2000年9月27日 申請日期1998年7月27日 優先權日1997年7月30日
發明者A·潑德斯塔, S·特拉斯西亞蒂, S·羅斯尼 申請人:埃比奧吉恩藥物股份公司