高速逆流色譜從藜蘆屬植物中分離環巴胺類似物的方法
【專利摘要】本發明涉及天然藥物的分離方法，公開了一種高速逆流色譜從藜蘆屬植物中分離環巴胺類似物的方法。其特征是：將藜蘆總生物堿粉末通過二次高速逆流色譜進行分離純化，其中第一次高速逆流色譜的溶劑體系是由二氯甲烷、甲醇和水組成的混合溶劑；第二次高速逆流色譜中將第一次高速逆流色譜得到的介芬胺流份作為逆流樣品進行分離純化，其溶劑體系是由正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水組成的混合溶劑。本發明制備方法簡單、快速、回收率高、所得目標化合物純度高。
【專利說明】高速逆流色譜從藜蘆屬植物中分離環巴胺類似物的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及天然藥物的分離方法，公開了一種利用二次高速逆流色譜法(HSCCC)分離藜蘆屬植物中四種環巴胺類似物的方法。
【背景技術】
[0002]環巴胺(Cyclopamine)是一種異留體類生物堿，主要存在百合科植物加州藜蘆(Veratrum californicum)、毛葉藜蘆(Veratrum grandif1rum)、印第安鹿食草(Cornlily)及伊犁貝母(Fritillaria pallidif1ra Schrenk)中。二十世紀中期研究發現環巴胺具有致畸作用，但九十年代以后的研究表明，環巴胺是一種hedgehog信號通路抑制劑，由于hedgehog信號通路的突變與多種腫瘤的發病有關聯，因此環巴胺作為一種潛在的抗腫瘤新藥在世界范圍內掀起了研究熱潮。近幾年研究人員對環巴胺進行了更深入的研究，認為它對髓質母細胞瘤、基底細胞癌、小細胞肺癌有較好抑制作用，并且美國Infinity公司將環巴胺衍生物IP1-926作為抗腫瘤藥物已在2012年完成II期臨床研究。
[0003]由于環巴胺、介芬胺等異甾體生物堿結構復雜，其全合成長達20步但總反應得率不到 1% (Giannis, A., Heretsch, P., Sarli, V., Stii β el, A., Angew.Chem.1nt.Ed.2009, 48, 7911 - 7914.)，所以目前主要是用苯等有機溶劑通過多種柱層析法從加州藜蘆中提取環巴胺，或者先從植物中提取環巴胺類似物再半合成得到環巴胺，然后對得到的環巴胺進行結構修飾以期得到抗腫瘤活性較好的環巴胺衍生物。然而環巴胺在植物中含量低微，不到萬分之一，且常規提取分離操作繁瑣，得率較低，大量使用苯這種有毒試劑對環境、對研究人員也都有一定傷害，這在很大程度上限制了這一極具發展前景的抗腫瘤藥物的繼續深入研究。
[0004]藜蘆屬(Veratrun)為百合科植物，藜蘆屬中多種藜蘆的根和根莖均可入藥，用于中風痰壅、癲癇、喉痹不通、疥蘚。目前從藜蘆屬分離到的多種藜蘆共有的環巴胺類似物主要有:介芬胺(jervine,簡寫為JV)、偽介芬胺(pseudojervine,簡寫為PJV)、藜蘆胺(veratramine,簡寫為VM)及藜蘆托素(veratrosine,簡寫為VS)等等,這些類似物可以通過氧化還原反應或者去糖基化等反應半合成環巴胺。而且近幾年對于從藜蘆中分離新的環巴胺類似物的報道也逐年遞增，說明藜蘆屬植物作為環巴胺類似物的重要來源具有進行深入研究的潛力和廣泛開展應用的前景。
[0005]高速逆流色譜(High-speedcounter-current chromatography,HSCCC)是以流體動力學為基礎、無需固體支撐體的液液分配色譜，兩相溶劑在高速旋轉的螺旋管中建立了特殊的流體動力學平衡。與傳統液-固色譜相比，該方法不需要固體做固定相，可避免由不可逆吸附導致的樣品損失、失活和變性等，且回收率高，重復性好，尤其適用于復雜結構天然產物的分離，但是能否高效分離取決于是否選擇正確的溶劑體系。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是克服柱色譜法和重結晶等傳統方法分離純化藜蘆中介芬胺類異甾體生物堿的缺點，提供一種制備工藝簡單快速、純度高的從藜蘆中分離純化環巴胺類似物的方法。
[0007]藜蘆中環巴胺類似物為母核類似但由于取代基的不同，使得這些生物堿極性相近或者差異較大，傳統的制備液相色譜技術無法在短時間內將其分離出來。本發明利用高速逆流色譜技術，尋找最適合分離環巴胺類似物的溶劑系統來分離藜蘆中介芬胺、藜蘆胺、偽介芬胺和藜蘆托素等四個單體化合物，結果發現，無法一次獲得這四個單體化合物純品，即使采用二氯甲烷-甲醇-水的溶劑系統作為高速逆流色譜的固定相和流動相，也只能的得到藜蘆胺、偽介芬胺和藜蘆托素三個單體化合物的純品，進一步的實驗發現，將第一次高速逆流色譜分離得到的介芬胺流份采用不同的溶劑系統再次經高速逆流色譜分離，將目標化合物介芬胺與藜蘆胺及一些小極性干擾雜質分離從而獲得高純度的介芬胺。本發明制備方法簡單、快速。
[0008]本發明的分離純化方法包括:
[0009]將藜蘆總生物堿粉末通過二次高速逆流色譜進行分離純化，其中第一次高速逆流色譜的溶劑體系是由二氯甲烷、甲醇和水組成的混合溶劑；第二次高速逆流色譜中將第一次高速逆流色譜得到的介芬胺流份作為逆流樣品進行分離純化，其溶劑體系是由正己烷、 乙酸乙酯、甲醇和水組成的混合溶劑。
[0010]溶劑體系既是固定相又是流動相。
[0011]其中溶劑體系中二氯甲烷、甲醇、水的體積比優選:4:3~4:2。
[0012]溶劑體系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比優選:3~4:5:3~4:5。
[0013]更優選的方法包括:
[0014]第一次高速逆流色譜分離純化:構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為二氯甲烷一甲醇一水，在分液漏斗中充分震搖后靜置分層，上相為固定相、下相為流動相:先使高速逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機轉動，再泵入流動相，取藜蘆總生物堿粉末溶于等量上相和下相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收流分介芬胺流份 (JV-fraction)、藜蘆胺(VM)、偽介芬胺(PJV)和藜蘆托素(VS)，揮干這四個流份的有機試劑，得藜蘆胺、偽介芬胺和藜蘆托素，而介芬胺流份再進行二次高速逆流；
[0015]第二次高速逆流色`譜分離純化:構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為正己燒一乙酸乙酯一甲醇一/K，以第一次高速逆流色譜得到的介芬胺流份作為二次逆流的樣品，方法同第一次高速逆流色譜分離，即得介芬胺(JV)。
[0016]其中溶劑體系中二氯甲烷、甲醇、水的體積比優選:4:3~4:2。
[0017]溶劑體系中正己烷、乙酸乙酯、甲醇、水的體積比優選:3~4:5:3~4:5。
[0018]流動相的流速優選控制在1.5mL/min ;主機轉速一般控制在800~850rpm/min范圍內，第一次高速逆流優選800rpm/min,第二次優選850rpm/min ;恒溫循環器的溫度設置為第一次高速逆流優選32°C，第二次優選35°C。
[0019]在進樣量為200mg的藜蘆總生物堿的高速逆流的色譜圖中，進樣后40~45分鐘出峰。JV-fraction的保留時間范圍為52~59分鐘，VM的保留時間范圍為62~70分鐘， PJV保留時間范圍為142~152分鐘，VS保留時間范圍為187~207分鐘。在進行第二次高速逆流色譜分離純化時，JV保留時間范圍為104~193分鐘。
[0020]其中藜蘆總生物堿優選用以下方法制得:將藜蘆粗粉以70%~95%乙醇水溶液超聲提取或加熱回流，過濾，將濾液減壓濃縮、干燥即得。
[0021]藜蘆總生物堿更優選的制備方法如下:將尖被藜蘆藥材置于60°C烘箱中4h后，切斷細段，再用植物粉碎機粉碎成粗粉(過20目篩)，放置備用。取粉碎好的藥材100g，加氨水(25%)適量(以剛沒過藥材為宜)，堿化I小時，用95%こ醇1000mL加熱回流提取3次(每次
1.5小吋)，過濾并合并濾液后用旋轉蒸發儀蒸干成浸膏，再用100mL(0.1M)HC1溶解過濾，濾液用一倍量石油醚脫脂兩次，然后用氫氧化鈉(10%)堿化至pH為9~10，再用氯仿反復萃取四次(lOOmL，IOOmL, 80mL, 50mL)，合并氯仿層，蒸干供HSCCC上樣用。
[0022]高速逆流色譜條件研究:
[0023]⑴溶劑體系的選擇，以經典體系為基礎，用分層時間及分配系數K確定溶劑體系，K值最好在0.5~2之間(或者0.2~5之間)；分層時間最好小于20s。
[0024]分層時間測定:配制各種比例的溶劑體系，記錄測定兩相溶劑系統的平衡時間，即:上相與下相混合后劇烈振搖，充分混合，測振搖后到兩相完全分層的時間。 [0025]分配系數K值測定:稱取尖被藜蘆總生物提取物約2mg置于5mL EP管中，分別取上相、下相溶液各2mL溶解樣品，充分振蕩溶解，待兩相平衡后，分別精確取上相、下相溶液各lmL，揮干，再用ImL色譜甲醇溶解，進行HPLC分析。用目標化合物在上下相中的峰面積之比計算出分配系數K值。
[0026]從表1中，根據分層 時間和K值可以看出溶劑體系為二氯甲燒一甲醇一水(4:3~4:2,v/v/v)吋，VM、PJV及VS分離效果較好；當在體系中加酸后，四種成分的K值均增大數倍，所以利用此體系分離這四種環巴胺類似物的第一次高速逆流最優體系為二氯甲燒一甲醇一/JC(4:3 ~4:2,v/v/v)。
[0027]從表2看出二次高速逆流溶劑體系為正己烷ーこ酸こ酯一甲醇一水(3~4:5:3~4:5，v/v/v/v)時，JV和VM的K值及分離度(a )均符合要求，其中且正己燒ーこ酸こ酯一甲醇ー7jC(4:5:4:5，v/v/v/v)能在最短時間內得到純度高的JV，為優選比例。
[0028]表1目標成分在不同溶劑體系中的分配系數(K)及體系分層時間
[0029]
【權利要求】
1.一種從藜蘆中分離純化介芬胺、藜蘆胺、偽介芬胺和藜蘆托素的方法，包括:將藜蘆總生物堿粉末通過二次高速逆流色譜進行分離純化，其中第一次高速逆流色譜的溶劑體系是由二氯甲烷、甲醇和水組成的混合溶劑；第二次高速逆流色譜中將第一次高速逆流色譜得到的介芬胺部分作為逆流樣品進行分離純化，其溶劑體系是由正己烷、こ酸乙酯、甲醇和水組成的混合溶剤。
2.權利要求1的方法，其中溶劑體系中二氯甲烷、甲醇、水的體積比為4:3~4:2。
3.權利要求1的方法，其中溶劑體系中正己烷、こ酸こ酯、甲醇、水的體積比為3~4:5:3 ~4:5。
4.權利要求1的方法，依次包括下列步驟: 第一次高速逆流色譜分離純化:構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為二氯甲烷一甲醇一水，在分液漏斗中充分震搖后靜置分層，上相為固定相、下相為流動相:先使高速逆流色譜儀柱子中充滿固定相，然后使主機轉動，再泵入流動相，取藜蘆總生物堿粉末溶于等量上相和下相，由進樣閥進樣，根據檢測器譜圖接收流分介芬胺部分、藜蘆胺、偽介芬胺和藜蘆托素，揮干這四個流分的有機試劑，得藜蘆胺、偽介芬胺和藜蘆托素，而介芬胺部分再進行二次高速逆流； 第二次高速逆流色譜分離純化:構成高速逆流色譜固定相、流動相的溶劑體系為正己烷ーこ酸こ酯一甲醇一水，以第一次高速逆流色譜得到的介芬胺部分作為二次逆流的樣品，方法同第一次高速逆流色譜分離，即得介芬胺。
5.權利要求4的方法，其中二氯甲烷、甲醇、水的體積比為4:3~4:2。
6.權利要求4的方法，其中溶劑體系中正己烷、こ酸乙酯、甲醇、水的體積比為3~4:5:3 ~4:5。
7.權利要求1的方法,其中藜蘆總生物堿用以下方法制得:將藜蘆粗粉以70%~95%こ醇水溶液超聲提取或加熱回流，過濾，將濾液減壓濃縮、干燥即得。
8.權利要求4的方法，其中進行第一次高速逆流色譜時，主機轉速為800~850rpm/min，流動相流速為1.5mL/min，檢測波長為254nm，水浴溫度為32°C。
9.權利要求4的方法，其中進行第二次高速逆流色譜時，主機轉速為800~850rpm/min，流動相流速為1.5mL/min，檢測波長為254nm，水浴溫度為35°C。
【文檔編號】C07J69/00GK103524594SQ201310483302
【公開日】2014年1月22日 申請日期:2013年10月16日 優先權日:2013年10月16日
【發明者】李會軍, 姜艷, 喻悅 申請人:中國藥科大學