專利名稱：用于分離核酸的可裂解固相的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于結合核酸的新型固相材料以及它們在分離和純化核酸的方法中的應用。
背景技術：
分子診斷學和分子生物學中的現代技術(包括反轉錄、克隆、限制性分析、擴增和序列分析)，要求在這些技術中使用的核酸基本上不含污染物和干擾物質。不期望的污染物包括大分子物質例如酶、其它類型的蛋白質、多糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、脂類、低分子量酶抑制劑、或非目標核酸、酶輔因子、鹽、離液劑、染料、金屬鹽、緩沖鹽和有機溶劑。
獲得用于分子生物學應用的基本上無污染物的目標核酸是困難的，原因在于目標核酸被發現于其中的復雜樣品基質。此類樣品包括例如來自組織的細胞、來自體液的細胞、血液、培養物中的細菌細胞、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠、或從目標核酸擴增得到的溶液。樣品基質經常含有顯著量的污染物，在感興趣的核酸被用于分子生物學或診斷技術之前所述污染物必須從所述核酸去除。
從上述細胞和組織產生的混合物中分離目標核酸的常規技術，需要使用有害化學品例如酚、氯仿以及溴化乙錠。酚/氯仿提取被用于此類步驟以從目標核酸和多種污染物的混合物中抽提掉污染物。可選地，根據本領域中熟知的方法，使用氯化銫-溴化乙錠梯度。參見例如Molecular Cloning，由Sambrook等編著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，在后面的方法之后，通過將乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸來沉淀保留在抽提的水相中的核酸物質。通常，通過離心從溶液中移出沉淀物，并且在水或緩沖溶液中重懸以作進一步使用之前，允許干燥所得到的沉淀物小球。
已經開發出更簡單和更快的方法，其采用各種類型的固相，以從細胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分離核酸。此類固相包括層析樹脂、聚合物和各種形狀和形式例如纖維的二氧化硅或玻璃基物質、過濾器以及包被的容器。當為小顆粒的形式時，有時提供磁芯，以幫助實現分離。
在分離核酸中使用的一種類型的固相包括設計用于高效液相色譜(HPLC)的多孔硅膠顆粒。用陰離子交換劑對多孔硅膠顆粒的表面進行官能化，以在某一鹽和pH條件下與質粒DNA交換。參見，例如美國專利4,699,717和5,057,426。在含有高濃度鹽的水溶液中洗脫結合到這些固相材料的質粒DNA。從那里洗脫的核酸溶液在其被用于下游過程之前必須被進一步處理，以除去鹽。
其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(CPG)、包埋有二氧化硅顆粒的濾器、硅膠顆粒、硅藻土、玻璃纖維或上述的混合物。在存在離液劑例如碘化鈉(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情況下，在含有核酸的樣品中，每一硅基固相材料可逆地結合核酸。此類固相結合并保持核酸物質，同時該固相經受離心或真空過濾以從殘余樣品成分中分離出基質和結合于其上的核酸物質。然后，通過用水或低鹽洗脫緩沖液洗脫，從固相釋放出該核酸物質。商業上可得的用于核酸分離的硅基固相材料包括例如WizardTMDNA純化系統產品(Promega，Madison，WI)、QiaPrepTMDNA分離系統(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFXMicro Plasmid Kit(Amersham)。
顆粒形式的聚合樹脂也被廣泛用于核酸的分離和純化。在歐洲專利申請公開第EP 1243694A1中公開了含有季銨首基(head group)的羧酸鹽改性的聚合顆粒(Bangs，Agencourt)聚合物。該聚合物是具有共價連接的線型非交聯聚合物的惰性載體顆粒。該類型的聚合固相一般是指觸角樹脂(tentacle resin)。線型聚合物摻入四烷基季銨基團。該烷基集團被指定為甲基或乙基基團(第4欄，第52-55行)。較長的烷基被認為是不期望的。
基于陰離子交換原理的其它用于結合核酸的固相材料目前正在使用中。這些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(BD，Roche-Genopure)的硅基材料，這基于在EP0496822B1 中描述的層析載體。具有聚合的三烷基銨基團的聚合物樹脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分離的羧基改性聚合物可以從眾多的供應商獲得。在高鹽條件下核酸被吸引，而在低離子強度條件下核酸被釋放。
磁響應性顆粒也已經被開發用作核酸分離中的固相。設計用于核酸分離的若干種不同類型的磁響應性顆粒在本領域中是已知的，并且可以從若干來源商業獲得。可逆地直接結合核酸材料的磁性顆粒包括MagneSilTM顆粒(Promega)。也已知，磁性顆粒通過共價連接的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白可逆地結合mRNA，其中抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白具有用于與mRNA的聚腺苷酸尾雜交的連接的寡dT尾。
已知多種類型的磁響應性硅基顆粒被用作核酸結合分離法中的固相。一個這樣的顆粒類型是磁響應性玻璃珠，優選具有受控孔尺寸的磁響應性玻璃珠，其作為Magnetic Porous Glass(MPG)顆粒可以從CPG，Inc.(Lincon Park，NJ)獲得；或者在美國專利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337號中描述的多孔磁玻璃顆粒。在核酸的結合和分離中有用的磁性顆粒的另一類型是通過將磁性材料摻入聚合的二氧化硅化合物基質中而產生的。(德國專利DE4307262A1) 具有可誘導磁性性質的顆粒或珠包括小顆粒的過渡金屬，例如鐵、鎳、銅、鈷和錳，以形成金屬氧化物，在磁體存在下可以使該金屬氧化物具有暫時的磁性。這些顆粒被稱為順磁性的或超順磁性的。為形成順磁或超順磁珠，已用在水中相對穩定的聚合物包被金屬氧化物。美國專利4,554,088公開了順磁顆粒，其包括被高分子硅烷包被包圍的金屬氧化物芯。美國專利5,356,713公開了可磁化的微球體，其包括被疏水乙烯基芳族單體外殼包圍的可磁化顆粒芯。美國專利5,395,688公開了已經用混合的順磁金屬氧化物-聚合物層包被的聚合物芯。另一種方法采用聚合物芯以吸收金屬氧化物，例如諸如在美國專利第4,774,265號中。包含用順磁金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒的磁性顆粒被公開于美國專利5,091,206中。然后，用另外的聚合層進一步包被該顆粒，以保護金屬氧化物層并提供反應性包被。美國專利5,866,099公開了在用于配位金屬鹽并俘獲混合的金屬氧化物顆粒的蛋白存在的情況下，通過兩種金屬鹽的混合物共沉淀制備磁性顆粒。許多示例性金屬鹽對被描述。美國專利5,411,730描述了相似的方法，其中沉淀的混合的金屬氧化物顆粒被俘獲在葡聚糖——一種寡糖中。
用于不可逆地捕獲DNA和RNA的氧化鋁(氧化鋁(alumina oxide))顆粒被公開于美國專利6,291,166中。用于固相擴增法例如PCR的結合的核酸是可得的。
發明概述 本發明的另一個目標是提供固相材料，其包括用于結合核酸的可裂解連接體(cleavable linker)。進一步的目標是提供包含共價連接的核酸結合基團的此類可裂解固相材料。本發明的另一個目標是提供從固相材料結合和釋放核酸的方法。本發明的另一個目標是提供使用本發明的固相材料分離和純化核酸的方法。本發明的進一步的目標是提供結合核酸并在最常使用的洗脫條件下抵抗核酸釋放的固相材料。提供含有共價連接的三元或四元基(ternary or quaternary oniumgroups)的此類固相材料是進一步的目標。本發明的另一個目標是提供使用本發明的組合物結合核酸并釋放該核酸的固相材料。本發明的另一個目標是提供用于從固相材料釋放結合的核酸的此類試劑組合物。
附圖簡述

圖1A描繪了可裂解核酸結合顆粒的示意圖。圖1B描繪了結合核酸分子的可裂解固體支持物。
圖2顯示了使用可裂解核酸結合顆粒結合和釋放核酸。
圖3是PCR擴增的pUC18質粒DNA樣品的凝膠圖，其已被吸收在10mg可裂解的聚合物珠上，并在擴增前從洗滌過的珠洗脫。
圖4是通過使用實施例13和19的可裂解的珠從細胞裂解液分離而獲得的pUC18 DNA的凝膠圖。
圖5是使用本發明的可裂解固體支持物從人血樣中分離的DNA的凝膠圖。
圖6是結合至本發明的具有三丁基-磷(，phosphonium)基團的可裂解固體支持物并通過Wittig反應釋放的DNA的斑點印跡圖。
發明詳述 申請人:已開發出用于從含有核酸的溶液和樣品中捕捉和結合核酸的新型固相材料。該固相材料可以是顆粒、微粒、纖維、珠、膜和其它支持物的形式，例如試管和微孔。新型材料的一個限定性特征是存在可裂解的連接體部分。該材料進一步包括允許捕捉和緊密結合不同長度的核酸分子的核酸結合基團。固相材料與切斷可裂解連接體的試劑的反應使得結合的核酸從固相釋放。可控地釋放結合的核酸分子的新方法形成本發明的又一部份，如同用于從該固相材料釋放或洗脫結合的核酸分子的試劑組合物構成本發明的一部分一樣。
定義 烷基——含有1-20個碳原子的支鏈、直鏈或環狀烴基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。本文中所使用的低級烷基是指那些含有高達8個碳的烷基基團。
芳烷基——用芳基取代的烷基基團。
芳基——含有1至5個碳環芳香環的含芳香環的基團，其可以用除了H以外的1個或多個取代基取代。
磁性顆粒——顆粒、微粒或珠，其對外部的磁場有響應。該顆粒本身可以是磁性的、順磁性的或超順磁性的。如當使用鐵磁材料時，其可以被吸引到外部磁體或施用的磁場。顆粒可以具有固體芯部分，該固體芯部分是磁響應性的，并且被一層或多層非磁響應性層包圍。可選地，磁響應性部分可以是周圍的層或者可以是分散在非磁響應性核芯內的顆粒。
寡聚物、寡核苷酸——如本文所使用的，將是指含有磷酸二酯核苷酸間鍵和5′-端單磷酸酯基團的化合物。核苷酸可以是正常發生的核糖核苷酸A、C、G和U或脫氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。
多核苷酸——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA類似物例如PNA。任何這三種類型的鏈組成的雙鏈雜合子也可以在本術語的范圍內。
引物——指用于定向連接位位點并且為起始連接過程所必需的寡核苷酸。引物的長度足以穩定地與模板雜交，并且代表模板中的獨特序列。引物的長度通常為約15-30個堿基。含有可檢測標記或允許固相捕獲的標記的標記的引物在如本文中所使用的術語的范圍內。
模板、試驗多核苷酸以及靶被互換使用并且是指其長度將被復制的核酸。
樣品——含有或疑似含有核酸的流體。可以用在本發明的方法中的典型的樣品包括體液，例如血液、血漿、血清、尿、精液、唾液、細胞裂解液、組織提取液和類似物。其它類型的樣品包括溶劑、海水、工業水樣、食物樣品和環境樣品例如土壤或水、植物材料、原核生物、真核生物來源的細胞、細菌、質粒和病毒。
固相材料——具有可以將核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式。
取代的——是指用非氫基團置換基團上的至少一個氫原子。應該注意到的是，關于取代的基團，其意圖是可以存在多點取代，除非明確另外指出。
申請人:已經開發出固相材料，其結合核酸并具有可以被裂解以釋放結合的核酸的可裂解連接體部分。該材料可以是微粒、纖維、珠、膜以及其它支持物例如試管和微孔的形式，它們具有足夠的表面積以允許進行有效結合。微粒形式的本發明的固相材料可以進一步包括磁芯部分。通常，顆粒以及磁響應性微粒在本發明中是優選的。
本發明的固相核酸結合材料包括限定其大小、形狀、孔隙率和機械性能的基質，和共價連接的核酸結合基團。三種最常用類型的基質是二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。固相可以進一步包括磁響應性部分。
聚合物是一種或多種烯鍵式不飽和單體單元的均聚物或共聚物，并且可以是交聯的或非交聯的。優選的聚合物是聚烯烴包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多種取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸單體在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
包含在本發明的固相結合材料中的核酸結合基團吸引并結合具有各種長度和堿基組成或堿基順序的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。核酸結合基團包括羧基、胺和三元或四元基。胺基團可以是NH2、烷基胺以及二烷基胺基團。三元或四元基包括三烷基季銨基團(-QR3+)，磷基(-QR3+)包括三烷基磷或三芳基磷或混合的烷基芳基磷基、以及三元锍基(ternary sulfonium)(-QR2+)。固相可以含有一種以上類型的核酸結合基團，如本文中所述。含有其中R基團是具有至少4個碳的烷基的三元或四元基-QR2+或-QR3+的固相材料在結合核酸中特別有效，但少如1個碳的烷基基團也如芳基那樣有用。此類固相材料以高的韌度保持結合的核酸，并在現有技術中已知用于洗脫的大多數條件下抵抗核酸的除去和洗脫。已知的高和低離子強度的洗脫條件對于除去結合的核酸是無效的。不同于含有DEAE和PEI基團的傳統陰離子交換樹脂，三元或四元固相材料保持正電荷，無論反應介質的pH如何。
在本發明的一方面，提供了包括固體支持部分(solid support portion)的固相，所述固體支持部分包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶性多糖的基質，在其表面上連接有核酸結合部分，用于吸引和結合核酸，所述核酸結合部分(nucleic acid binding portion，NAB)由可裂解的連接體部分連接到固體支持部分。
或 在一個實施方式中，NAB是其中Q為S原子的式QR2+X-的三元基或其中Q為N或P原子的式QR3+X-的四元基，R選自烷基、芳烷基和芳基而X為陰離子。當Q是氮原子時，R基團可以每一個都含有4-20個碳原子。當Q是硫或磷原子時，R基團可以具有1-20個碳原子。
或 根據本發明，優選的固相來源于商業可得的聚苯乙烯型聚合物例如被稱為Merrifield樹脂(交聯的)的那些類型。在這些聚合物中，一定百分比的苯乙烯單元含有反應性基團，通常為氯甲基或羥甲基，作為共價連接的工具。通過與硫化物(R2S)或三元胺或膦反應，置換一些氯，產生本發明的固相材料。當所有的反應性氯甲基基團已經被轉化成三元或四元基時，根據本定義制備的聚合物可以用下面的式(1)描繪。對于所有此類基團，不必須都被轉化，使得本發明的聚合固相將經常含有基和氯甲基基團的混合物。
在上式中，m、n和o表示聚合物中每一單體單元的摩爾百分比，并可以取值為m從0.1％至100％、n從0至99％、以及o從0至10％。更優選地，m從1％至20％、n從80至99％、以及o從0至10％。
在另一個實施方式中，根據本發明的固相來源于商業可得的交聯的Merrifield樹脂，其一定百分比的苯乙烯單元含有反應性氯乙酰基或氯丙酰基，用于共價連接。從這些起始聚合物制備的本發明的三元或四元聚合物具有下式 其中Q、R、X、m、n和o如上定義。
許多其它本領域已知的聚合樹脂可以被用作制備本發明的固相材料中的固體基質。聚合樹脂可以從商業供應商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)和NovaBiochem獲得。該樹脂通常基于具有反應性官能團的交聯的聚合顆粒。用在如Advanced ChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固體支持的肽合成中的許多合適的聚合樹脂是合適的原材料。具有反應性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亞胺酯基團的聚合物每一個都是商業可得的，用于制備本發明的聚合固相。如在下面的多個例子所示，提供將前體聚合樹脂共價接合到三元或四元基的方法有時是必需或期望的。這將通常包括選自亞烷基、亞芳基或亞芳烷基(aralkylene)基團的1-20個原子的鏈或環基團。該鏈或環還可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黃原酸酯、脲、亞胺、肟、亞砜和硫酮形式的羰基基團。
具有二氧化硅、玻璃或多糖支持物作為固體基質的本發明的固相材料將通過二價基團的共價連接來官能化，所述二價基團將核酸結合基團和可裂解連接體部分連接到固相基質。該二價基團通常為有機基團，或者為低分子量基團或者為聚合基團。該二價基團也可以是有機硅烷。對包被微粒表面有用的合適的硅烷包括對-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-2-氨基-乙基-3-氨丙基甲氧基-硅烷、(H2NCH2NHCH2CH2NHCH2Si(OCH3)3、三乙氧基硅烷和三甲氧基硅烷。制備這些微粒的方法公開在美國專利第4,628,037、4,554,088、4,672,040、4,695,393和4,698,302號中，其教導被引入于此作為參考。具有共價結合的有機連接體基團的二氧化硅顆粒材料是已知并商業可得的。描述了許多此類材料的一個來源是Silicycle(Quebec City，Canada)。通過亞烷基或其它連接體結合于多種反應性官能團的二氧化硅顆粒被描述于產品目錄中，該目錄致力于用于固相合成的硅基材料。所描述的代表性官能團包括胺、碳二亞胺、碳酸酯、二氯三嗪、異氰酸酯、馬來酰亞胺、酐、羧酸、羧酸酯、硫醇、硫脲、硫氰酸酯、磺酰氯、磺酸以及磺酰肼基團。這些物質的任何一種可以用來提供用于三元或四元基的連接的固體基質，如上所述。
如本文所使用，磁性微粒是可以被磁場吸引和操作的顆粒。用在本發明的方法中的磁性顆粒包括磁性金屬氧化物芯，其通常被吸附性結合或共價結合的層包圍，核酸結合層通過選擇的偶聯化學術被共價結合到所述層，從而用三元锍、季銨或四元磷官能團包被微粒的表面。磁性金屬氧化物芯優選是氧化鐵，其中鐵是Fe2+和Fe3+的混合物。無硅烷包被的上述含有氧化鐵芯的磁性微粒也可以被用于本發明的方法中。如美國4,654,267所述，磁性顆粒也可以通過在多孔聚合物存在下沉淀金屬顆粒以捕獲磁響應性金屬顆粒而形成。可制備的磁性金屬氧化物從而包括Fe3O4、MnFe2O4、NiFe2O4和CoFe2O4。其它磁性顆粒也可以如美國5,411,730所述通過在寡糖葡聚糖存在下沉淀金屬氧化物顆粒以捕獲磁響應性金屬顆粒而形成。前述的美國專利5,091,206公開了另一種磁性顆粒。該顆粒包括用順磁性金屬氧化物顆粒層包被的聚合芯顆粒，以及另外的聚合層以保護金屬氧化物層并提供反應性包被層。含有氯甲基化的Merrifield樹脂的磁鐵礦(四氧化三鐵銹層，magnetite)的制備被描述于出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。
商業可得的磁性二氧化硅或磁性聚合顆粒可以被用作制備根據本發明的可裂解磁性顆粒中的原材料。具有表面羧基基團的聚合顆粒的合適類型已知為商品名SeraMagTM(Seradyn)和BioMagTM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性顆粒的合適類型已知為商品名MagneSilTM(Promega)。二氧化硅磁性顆粒也可以從Chemicell GmbH(Berlin)獲得。
其它可裂解固體支持物 在另一個實施方式中，提供了固相材料，所述固相材料包含選自二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖的固相基質，并具有用于將基連接到固相的可裂解連接體基團。基具有其中Q為S原子的式QR2+X-，或者其中Q為N或P原子的式QR3+X-，R選自具有1-20個碳原子的烷基、芳烷基和芳基，X為陰離子。可裂解連接體起著兩個功能，1)物理連接基質和三元或四元基，和2)提供斷裂固體支持基質和吸引核酸的四元基之間的連接的方式，從而從該固相基質釋放結合的核酸。該連接體可以是形成二價、三價或多價基團的任何原子集合(grouping)，假如其包含可以被特定化學試劑、酶試劑或光化學反應裂解的可裂解部分。該裂解劑或反應必須在斷裂可裂解連接的過程期間足以保護核酸，以便核酸對于下游過程是有用的。
聚合物是一種或多種烯鍵式不飽和單體單元的均聚物或共聚物，并且可以是交聯的或非交聯的。優選的聚合物是聚烯烴包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多種取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸單體在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。
許多其它本領域已知的聚合樹脂可以被用作制備本發明的固相材料中的固體基質。聚合樹脂可以從商業供應商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)獲得。該樹脂通常基于具有反應性官能團的交聯的聚合顆粒。用在如AdvancedChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固體支持的肽合成中的許多合適的聚合樹脂是合適的原材料。具有反應性NH2、NH-NH2、OH、SH、CHO、COOH、CO2CH＝CH2、NCO、Cl、Br、SO2CH＝CH2、SO2Cl、SO2NH2、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亞胺酯基團的聚合物每一個都是商業可得的，用于制備本發明的聚合固相。
如在下面的多個例子中所示，提供將前體聚合樹脂共價結合到可裂解連接體部分或將該可裂解連接部分結合到四元基的工具有時是必需或期望的。在這些情況下，連接體基團也可以包括一個或多個連接部分。后者將通常包括選自亞烷基、亞芳基或亞芳烷基(aralkylene)基團的、1-20個原子的鏈或環基團。該鏈或環還可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黃原酸酯、脲、亞胺、肟、亞砜和硫酮形式的羰基基團。
可裂解連接體部分優選選自直鏈、支鏈和環的有機基團，并包括1至100個原子并更優選1至約50個原子。該原子優選選自C、H、B、N、O、S、Si、P、鹵素和堿金屬。示例性的連接體基團是通過水解裂解的水解可裂解基團。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亞胺、磺酰胺和磺酰亞胺是代表性的，磺酸酯也是代表性。連接體基團的另一個示例性類別是經受還原性裂解的那些基團。一個代表性基團是含有二硫(S-S)鍵的有機基團，所述二硫鍵通過硫醇例如乙硫醇、巰基乙醇和DTT被裂解。另一個代表性基團是含有過氧化物(O-O)鍵的有機基團。過氧化物鍵可以通過硫醇、胺和膦裂解。
盡管許多特定結構圖為方便起見僅表示四元基，但應當理解，類似的四元锍基也同樣欲被表示。
示例性的光化學可裂解連接體基團包括下式 的硝基取代的芳族醚和酯，其中Rd為H、烷基或苯基，并且更具體地 鄰硝基芐基酯根據熟知的反應
通過紫外光被裂解。
示例性的可酶切連接體基團包括通過酯酶和水解酶裂解的酯、通過蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通過糖苷酶裂解的糖苷基。
具有包含可裂解的1，2-二氧雜環丁烷(dioxetane)部分的連接體基團的固相材料也在發明的核酸結合材料的范圍之內。此類材料包含可以由化學劑或酶試劑引發成片段的二氧雜環丁烷部分。除去保護基以產生氧陰離子，促進二氧雜環丁烷環的分解。根據熟知的方法，通過裂解過氧化物的O-O鍵以及C-C鍵而發生斷裂。
可選地，連接的基可以被結合到芳基Ar，如在
或結合到可裂解的基團Y，如在 進一步可選地，與固相和三元或四元基的連接被顛倒。
在前述的從固相裂解三元或四元基的示例性反應中，基團A表示穩定取代基。合適的基團選自烷基、環烷基、聚環烷基、聚環烯基、芳基、芳氧基和烷氧基。Ar代表芳環基團。優選的芳環基團是苯基和萘基。芳環可以包含另外的取代基，具體而言，是鹵素、烷氧基和胺基。Y基團是通過化學劑或酶可去除的基團或原子。合適的OY基團包括OH、其中R3選自烷基和芳基基團的OSiR33、羧基、磷酸鹽、硫酸鹽以及糖苷基。許多可引發的二氧雜環丁烷結構在本領域中是熟知的并且已經是大量專利的主題。公開于美國5,707,559中的螺金剛烷基(spiroadamantyl)-穩定的二氧雜環丁烷是一個例子，如美國5,578,253中所公開的含有烷基或環烷基取代基的其它二氧雜環丁烷也是合適的。許多其它不同取代的二氧雜環丁烷被描述于專利文獻中；一旦被連接到固相以及核酸結合基團，這些中的任何一個也將是適合的。另外的示例性可裂解二氧雜環丁烷結構在美國專利6,036,892、66,218,135、6,228,653、5,603,868、6,107,036、4,952,707、6,140,495、6,355,441和6,461,876中找到。
要求來自前述的螺金剛烷基、烷基或環烷基的連接取代基將二氧雜環丁烷連接體連接到固相或三元或四元基。具有連接基團的二氧雜環丁烷被公開在美國5,770,743中，并作為用于將二氧雜環丁烷共價結合到固相和基的連接部分，舉例說明了可利用的鍵合化學類型。示例性的可裂解二氧雜環丁烷連接體和其裂解被如下描繪。
保護基Y的去除引發了二氧雜環丁烷環的斷裂，并從而分開固體基質和基。在堿性反應條件下，所得到的芳基酯經受進一步水解。
具有包含多電子的C-C雙鍵的連接體基團的固相材料也在發明的核酸結合材料的范圍內，所述多電子的C-C雙鍵可以轉化成不穩定的1，2-二氧雜環丁烷部分。在該雙鍵上的至少一個取代基(A′)通過O、S或N原子被連接到雙鍵上。多電子雙鍵與單態氧的反應產生不穩定的1，2-二氧雜環丁烷基團。該二氧雜環丁烷環在環境溫度下自發斷裂，如上所述，以產生兩個羰基片段。
具有可裂解連接體基團的另一組固相材料具有乙烯酮二硫縮醛(ketenedithioacetal)作為可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公開。乙烯酮二硫縮醛經受通過與過氧化物酶和過氧化氫的酶氧化導致的氧化性裂解。
可裂解部分具有所示的結構，包括在9，10-二氫化吖啶(acridan)環上具有取代基的類似物，其中Ra和Rb每一個都是有機基團，該有機基團除了滿足基團中原子的化合價所需的必要數目的H原子之外含有1至約50個非氫原子，并且其中Ra和Rb可以被接合在一起而形成環。基團Ra和Rb可以包含1至約50個選自C、N、O、S、P、Si和鹵素原子的非氫原子。Rc是有機基團，除了滿足基團中原子的化合價所需的必要數目的H原子之外，含有1至50個選自C、N、O、S、P、Si和鹵素原子的非氫原子。更優選地，Rc含有1至20個非氫原子。有機基團Rc優選選自烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基和取代的芳烷基。Rc更優選的基團包括取代的或未取代的C1-C4烷基基團、取代或未取代的苯基或萘基、以及取代或未取代的芐基基團。當被取代時，示例性的取代基包括而不限于烷氧基、芳氧基、羥基、鹵素、氨基、取代的氨基、羧基、烷氧羰基、羰酰胺(carboxamide)、氰基、磺酸酯和磷酸酯基團。一個優選的Rc基團為用至少一個賦予水溶性的基團取代的烷基或雜烷基基團。
具有乙烯酮二硫縮醛可裂解連接體基團的固相材料具有下式中的任何一個 或 以及類似的結構，其中固體基質和基結合到可裂解連接體部分的次序被從示出的次序顛倒過來。
具有可裂解連接體基團的另一組固相材料具有亞烷基作為可裂解部分，所述亞烷基具有至少一個結合到三烷基或三芳基磷基的碳原子。
這組的材料通過與酮或醛的Wittig反應是可裂解的。在有機溶劑中季磷化合物(季化合物)與強堿的反應使結合到磷的碳原子脫質子化，產生磷葉立德(phosphorus ylide)。該葉立德與含羰基化合物例如酮或醛的反應形成雙鍵和氧化膦。在該過程中磷基和固相之間的連接斷裂。優選地，將固相結合到磷原子的碳原子(α碳)以這樣的方式被取代任何結合的質子比磷原子上的R基團上的任何質子更具有酸性。然后，葉立德形成和鏈碎裂被指引至正確的部位。在優選的實施方式中，在經歷葉立德形成的碳原子上的其它取代基中的一個是苯基或取代的苯基。當季磷基為三芳基磷基例如三苯基磷基時，對α質子增強的酸度的要求不再重要(moot)。
本發明進一步的方面包括使用可裂解固相結合材料分離和純化核酸的方法。在一個實施方式中，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，所述固相包括包含基質的固體支持部分，所述基質選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結合核酸的核酸結合部分，和可裂解連接體部分；b)混合固相和含有核酸的樣品，以將核酸結合到固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)裂解所述可裂解連接體；和e)從固相釋放所述核酸。
在優選的實施方式中，核酸結合部分是連接于基質表面的式QR2+X-或QR3+X-的四元基，其中四元基選自三元锍基、季銨和磷基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，而X是陰離子。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成，例如過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、當例如使液體通過多孔膜或過濾氈片(hlter mat)時過壓空氣或其它氣體。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。就其它組分的除去不完全而言，可以進行另外的洗滌，以幫助它們完全被去除。
裂解可裂解連接體的步驟，包括用裂解劑處理在其上結合有核酸的固相一段時間，該時間足以斷裂可裂解連接體部分中的共價鍵但不破壞核酸。裂解劑的選擇由可裂解連接體的性質決定。當可裂解連接體是水解可裂解的基團時，裂解劑是水或低級醇或它們的混合物。裂解劑優選包含當加入到水中提高pH的堿。優選的堿選自氫氧化物鹽和醇鹽或者包含無機酸或過氧化氫。示例性的堿包括LiOH、NaOH、KOH、NH4OH、NaOCH3、KOCH3和KOt-Bu。當可裂解連接體是還原性可裂解基團例如二硫化物或過氧化物基團時，裂解劑是選自硫醇、胺和膦的還原劑。示例性的還原劑包括乙硫醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、三烷基胺和三苯基膦。光化學可裂解連接體基團要求使用光作為裂解劑，典型為紫外區或可見區的光。如上所述的酶促可裂解連接體基團通過選自酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、過氧化物酶和糖苷酶的酶裂解。
當可裂解連接體基團是可引發的二氧雜環丁烷時，裂解劑起作用，以裂解如上所解釋的引發OY基團中的O-Y鍵。裂解O-Y鍵使二氧雜環丁烷環基團不穩定，并通過C-C和O-O鍵的斷裂導致二氧雜環丁烷碎裂成兩部分。當OY基團是OH時，裂解劑是有機或無機堿。當OY基團是OSiR33時——其中R3選自烷基或芳基，裂解劑是氟化物離子。當OY基團被結合到羰基基團上時，如酯中的羰基，裂解劑是酯酶或者是水解該酯的化學水解劑。此類化學水解劑選自水或低級醇或它們的混合物。裂解劑優選包含選自氫氧化物鹽和醇鹽的堿，或者包含無機酸或過氧化氫。當OY基團是磷酸鹽時，裂解劑是磷酸酯酶。當OY基團是硫酸鹽時，裂解劑是硫酸酯酶。當OY基團是糖苷基例如糖苷或半乳糖苷的部分時，裂解劑是相應的糖苷酶。
當可裂解連接體是用至少一個O、S或N原子取代的多電子C-C雙鍵時，裂解劑是單態氧。該雙鍵基團與單態氧的反應產生不穩定的1，2-二氧雜環丁烷基團，其在環境溫度或以上溫度下自發碎裂。根據單態氧化領域中已知的方法，單態氧可以通過染料增感作用或通過熱分解亞磷酸三苯酯臭氧化物或蒽內過氧化物(anthracene endoperoxide)而產生。
當可裂解連接體是如上所述的乙烯酮二硫縮醛時，裂解劑是過氧化物酶和過氧化氫。
當可裂解連接體是至少一個碳原子結合到三烷基或三芳基磷基的亞烷基基團時，通過與酮或醛的Wittig反應進行裂解。Wittig反應是熟知的反應，通過該反應，在有機溶劑中用強堿對季化合物脫質子化而產生磷葉立德。該葉立德與羰基化合物例如酮或醛的反應形成雙鍵和氧化膦。在磷基和α碳之間的連接如下所示被斷裂。優選地，α碳用基團取代，該基團使得結合的質子比磷原子上的R基團上的任何質子都更具有酸性。然后，葉立德形成和C-P鍵碎裂被指引至正確的部位。α碳上優選的取代基是苯基或取代的苯基、亞烷基、炔基或羰基。當季磷基為三芳基磷基例如三苯基磷基時，對α質子增強的酸度的要求不再重要。
優選的形成葉立德的堿是醇鹽和氫化物鹽，尤其是堿金屬鹽。優選的用于與葉立德反應的羰基化合物是脂族和芳族醛和脂族和芳族酮。更優選地，羰基化合物不具有降低反應速率的大基團。丙酮是最優選的。優選的溶劑是非質子有機溶劑，其可以溶解反應物而不消耗堿，包括THF、二乙醚、對二烷、DMF和DMSO。
裂解后從固相釋放核酸的步驟包括，用溶解和充分保護釋放的核酸的溶液洗脫。該溶液可以是試劑組合物，其包括含水緩沖液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物或醋酸鹽以及1-50％的親水有機助溶劑。更優選地，該親水有機溶劑占約1-20％。金屬鹵化物鹽包括堿金屬鹽、堿土金屬鹽。優選的鹽是乙酸鈉、NaCl、KCl和MgCl2。親水有機助溶劑是水溶性有機溶劑，并包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對二烷。釋放捕獲的核酸的步驟可以是在裂解步驟之后或者與其同時發生。在后一種情況中，裂解劑也可以作為洗脫溶液起作用。
用于裂解后從固相釋放核酸的試劑可以可選地是強堿水溶液。濃度為至少10-4M的堿金屬氫氧化物或氫氧化鋁的溶液對于從裂解的固相洗脫核酸是有效的。
用于裂解后從固相釋放核酸的試劑可以可選地是純水或pH在約8至10之間的堿性緩沖液。此類堿性緩沖液的使用可以在可達100℃的溫度下進行，以提高裂解的速率。中度堿性pH的緩沖液是有用的，尤其是當核酸是RNA時。在非常高的pH，尤其在高溫下，RNA的延長的接觸導致其降解。
裂解反應和釋放(洗脫)步驟每一個都可以在室溫下進行，但水的凝固點以上和水的沸點以下的任何溫度都可以被使用。洗脫溫度對于本分離核酸的方法的成功似乎并不是關鍵的。優選環境溫度，但水的凝固點以上和水的沸點以下的任何溫度都可以被使用。在一些情況下，升高的溫度可以增加洗脫速率。釋放或洗脫步驟可以進行一次，或者如果必要的話可以被重復1次或多次，以提高所釋放核酸的量。
通過使用單獨且不同的溶液來完成每一步驟，裂解反應和洗脫步驟可以作為連續的步驟實施。可選地，裂解和洗脫步驟可以在同一步驟中一起進行。當裂解反應條件采用了與洗脫的核酸的下游用途相容的試劑時，后者——同時發生的方法是優選的。例子是使用中度堿性的反應緩沖液以及甚至更強的氫氧化鈉堿性溶液的裂解反應。前者——連續的方法在這樣的情況下可以是期望的其中裂解反應的試劑或溶劑的存在與核酸是不相容或是不期望的。該情況的例子是Wittig釋放化學術。當裂解反應條件基本上不釋放DNA到溶液中時，使用單獨的裂解和洗脫溶液是可能的。
該方法可以進一步包括這樣的步驟用洗滌液洗滌具有結合到其上的、捕獲的核酸的固相，以從固相中除去樣品的其它組分。這些不期望的物質包括酶、其它類型的蛋白質、多糖、較低分子量的物質例如脂和酶抑制劑。通過上述的方法捕獲在本發明的固相上的核酸，可以以捕獲的形式用在雜交反應中，以雜交到標記或未標記的互補核酸。雜交反應在診斷測試中是有用的，用于檢測捕獲的核酸的存在或數量。雜交反應在固相核酸擴增過程中也是有用的。
對于結合和儲存結合的核酸，固相核酸結合載體也是有用的。因此，提供了從樣品捕獲核酸的方法，包括從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，該固相包括包括基質的固體支持部分，所述基質選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖，用于吸引和結合核酸的核酸結合部分，和可裂解連接體部分；和b)混合所述固相和含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結合至固相上。
在優選的實施方式中，核酸結合部分或者是式QR2+X-的三元基——其中Q為S且R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，或者是連接于基質表面上的式QR3+X-的季基，其中所述季基選自其中R選自C4-C20烷基、芳烷基和芳基的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季磷基，并且其中X是陰離子。
無裂解釋放 已發現，結合至本發明的固體支持物上的核酸可以被制備，以通過與某些試劑組合物接觸而釋放所述核酸，其中，所述固體支持物具有作為可裂解連接體的亞烷基，所述亞烷基的至少一個碳原子或者結合到三烷基或三芳基磷基(即，借助這些固體支持物，通過與酮或醛的Wittig反應而實現裂解)，或者結合到三烷基銨基團。由于通過與現有技術中已知的、用于洗脫結合的核酸的許多其它試劑和組合物接觸，并未從這些固相結合材料除去結合的核酸，該結果是意料之外的。
在本發明的另一個方面中，然后，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，該固相包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基質，和結合至所述基質表面上的基，所述基選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C4-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季基PR3+X-，并且其中X是陰離子；b)混合所述固相和含有所述核酸的樣品，以將所述核酸結合到所述固相上；c)從所述固相分離所述樣品；和d)通過接觸所述固相和試劑組合物從所述固相釋放所述核酸，所述試劑組合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及1-50％的親水性有機助溶劑。
從固相分離樣品的步驟可以通過下列方法完成例如過濾、重力沉降、傾析、磁力分離、離心、真空吸氣、對空氣或其它氣體過壓處理以使液體通過多孔膜或過濾氈片。該樣品中除了核酸之外的組分在該步驟被除去。如果其它組分的除去是不完全的，可以進行另外的洗滌，以幫助它們的完全去除。
通過用試劑組合物洗脫，從固體支持物釋放出結合至固體支持物的、捕獲的核酸。該試劑組合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3 M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及1-50％的親水性有機助溶劑。更優選地，該親水性有機溶劑占約1-20％。金屬鹵化物鹽包括堿金屬鹽和堿土金屬鹽。優選的鹽是乙酸鈉、NaCl、KCl和MgCl2。親水性有機助溶劑包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對二烷。
洗脫組合物有利地允許在隨后的下游過程中直接使用洗脫的核酸，而不需要在使用前蒸發溶劑或沉淀核酸。
通過用現有技術中已知的許多試劑和組合物進行洗滌以洗脫結合的核酸，令人驚奇地，結合的核酸并未從上面本發明的固相結合材料除去。固相材料對其有抗性的洗脫液包括下面的列表。該列表包括高pH、高離子強度和低離子強度條件。
去離子水H2O1M磷酸鹽緩沖液，pH 6.70.1％十二烷基硫酸鈉0.1％十二烷基磷酸鈉3M乙酸鉀，pH 5.5TE(三羥甲基氨基甲烷(Tris)EDTA)緩沖液50mM Tris，pH 8.5+1.25M NaCl
0.3M NaOH+1M NaCl1M NaOH或1M NaOH+1M H2O2 當使用如上所述的試劑組合物洗脫核酸時，洗脫溫度對于本分離核酸的方法的成功似乎不是關鍵的。優選環境溫度，但水的凝固點以上和水的沸點以下的任何溫度都可以使用。在一些情況下，升高的溫度可以增加洗脫的速率。
在本發明的另一方面，提供了從固相材料釋放或洗脫結合的核酸分子的新的試劑組合物。本發明的組合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3 M金屬鹵化物鹽或醋酸鹽以及1-50％的親水性有機助溶劑。更優選地，有機溶劑占約1-20％。親水性有機助溶劑包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和對二烷。
這些試劑組合物的重要優勢是它們與許多下游的分子生物學過程相容。在很多情況下，洗脫入如上所述的試劑組合物的核酸可以在進一步的過程中被直接使用。擴增反應例如PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(Ligation ofMultiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以采用此類核酸洗脫液。通過常規技術、尤其是從細菌培養物或從血樣中分離的核酸，采用沉淀步驟。加入高體積百分比的低分子量醇，以從水溶液中沉淀核酸。然后，在使用前，沉淀的物質必須被分離、收集并重溶于合適的介質中。通過使用上述的試劑組合物，從本發明的固相結合材料洗脫核酸，這些步驟可以被免除。
樣品——通過本發明的方法可以從其中分離核酸——包括含有一種或更多的核酸以及任選地含有其它物質的水溶液。代表性的例子包括核酸、擴增反應產物以及測序反應產物的水溶液。從細菌培養物、體液、血液和血液組分、組織提取物、植物材料以及環境樣品得到的材料在使用前同樣地被置于含水的溶液——優選緩沖的溶液中。
固相核酸捕獲的方法可以被用于許多用途。如下面的具體例子所示，可以捕獲和釋放單鏈和雙鏈核酸。可以捕獲和釋放DNA、RNA和PNA。第一用途是從細菌培養物中純化質粒DNA。質粒DNA被用作克隆載體，以將含有具體基因或基因片段的重組DNA片段導入宿主，用于克隆。
第二用途是純化PCR或其它擴增反應的擴增產物。這些反應可以是在交替的高溫和低溫之間進行熱循環，例如LMO或PCR，或者它們可以在單一的溫度下進行，例如核酸序列基擴增法(nucleic acid sequence-based amplication，NASBA)。所述反應可以使用各種擴增試劑和酶，包括DNA連接酶、RNA聚合酶和/或逆轉錄酶。可以使用本發明的方法純化的多核苷酸擴增反應混合物包括多寡聚體連接(LMO)、自動維持序列擴增(3SR)、鏈置換擴增(SDA)、“支鏈”DNA擴增(“branched chain”DNA amplication)、連接酶鏈反應(LCR)、QB復制酶擴增(QBreplicase amplication，QBR)、連接激活轉錄(“gation activated transcription，LAT)、核酸序列基擴增(NASBA)、修復鏈反應(repair chain reaction，RCR)、循環探針反應(CRP)和滾環擴增(RCA)。
第三用途是測序反應凈化(sequencing reaction cleanup)。雙脫氧終止測序反應產生多核苷酸序列梯度，所述序列梯度由用dNTPs和四種反應混合物的每一種中的一種ddNTP的混合物延伸引物而產生。標記每一種中的ddNTP，通常用不同的熒光染料標記。反應混合物包含過量的dNTPs和標記的ddNTP、聚合酶和輔因子例如ATP。序列分析之前除去在后的物質是有利的。
第四用途是從全血中分離DNA。用通常使用的技術從白細胞提取DNA。通常，處理血液，以選擇性溶解紅細胞，并且在沉淀或離心步驟之后，單獨溶解完整的白細胞以暴露核酸內容物。消化蛋白質，并且得到的DNA用固相分離，隨后用于序列多態性的測定、序列分析、RFLP分析、突變檢測或其它類型的診斷試驗。
第五用途是從DNA和RNA的混合物中分離DNA。涉及強堿性洗脫條件的本發明的方法，尤其是使用高溫的那些方法，可以降解或破壞存在的RNA同時保持DNA的完整性。涉及強堿性裂解反應的方法將類似地起作用。
另外的用途包括從其它樣品——土壤、植物、細菌和廢水中提取核酸物質，以及為了存檔的目的對核酸材料進行長期保存。
本發明的可裂解固體支持物的另一個優勢是從支持物釋放的核酸被包含于溶液中，所述溶液與許多下游的分子生物學方法相容。在許多情況下，或者被洗脫到包含裂解劑的溶液——當固相包含可裂解連接體時——中，或者被洗脫到上述的試劑組合物中的核酸，可以被直接用于進一步的過程中。這些過程包括使用聚合酶和連接酶的核酸擴增反應。典型的擴增反應是PCR、美國專利5,998,175中描述的多寡聚體連接(LMO)、以及LCR。已經發現，使用含有釋放的核酸的溶液與酶促反應或其它反應相容，并基本上不干擾酶促反應和其它反應。其它的下游過程被如上描述，并包括核酸雜交試驗、突變檢測和序列分析。
因此，本發明的又一方面包括使用可裂解固相結合材料分離和純化核酸的方法。在一個實施方式中，提供了從樣品分離核酸的方法，包括a)提供固相，其包括包含基質的固體支持部分，所述基質選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，用于吸引和結合核酸的核酸結合部分，和可裂解連接體部分；b)混合所述固相和含有核酸的樣品，以將核酸結合到固相上；c)從所述固相分離所述樣品；d)裂解所述可裂解連接體；e)從所述固相釋放所述核酸，進入溶液；和
f)進一步包括在下游過程中直接使用含有所述釋放的核酸的溶液。在核酸擴增反應中直接使用含有所釋放的核酸的溶液是優選的實踐，由此，使用聚合酶或連接酶介導的反應，核酸或它們的片段的數量得以擴增。
下面的實施例被呈現，目的在于更充分地描述本發明的各個方面，這些實施例不以任何方式限制本發明的范圍。
實施例 當存在于下面的實施例中時，結構圖旨在僅僅說明固相材料的可裂解部分。所述圖不代表固相材料的完整定義。
實施例1.含三丁基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞(argon pad)下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其為交聯的氯甲基化聚苯乙烯。加入過量的三丁基膦(48.1g，10當量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(21.5g)。元素分析觀察到的(Found)P 2.52％，Cl3.08％；期望的(Expected)P2.79％，Cl 3.19％P/Cl比率為0.94。
實施例2.含三辛基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在200mL CH2Cl2/DMF(50/50)中，攪拌Merrifield肽樹脂(Sigma，1.1meq/g，20.0g)。加入過量的三辛基膦(92.4g，10當量)，并在室溫下攪拌漿液7天。過濾該漿液并用200mL CH2Cl2洗滌所得到的固體3次。在真空下干燥樹脂(21.3g)。元素分析觀察到的P 2.28％，Cl 2.77％；期望的P 2.77％，Cl 2.42％P/Cl比率為0.94。
實施例3.含三甲基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在50mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入1.0M在THF中的三甲基膦(Aldrich，12mL)溶液，并在室溫下攪拌漿液7天。加入另外的100mL CH2Cl2和1.2mL在THF中的1.0M三甲基膦溶液，并攪拌該漿液3天。過濾該漿液，并用125mL CH2Cl2洗滌所得到的固體，隨后用375mL甲醇洗滌。在真空下干燥樹脂(5g)。在使用前將該樹脂研磨成細粉。
實施例4.含三苯基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在40mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入三苯基膦(Aldrich，3.2g)，并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌所得到的固體。在真空下干燥樹脂(5.4g)。
實施例5.含三丁基銨基團的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，在150mL CH2Cl2中，攪拌Merrifield肽樹脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入過量的三丁基胺(25.6g，4當量)，并在室溫下攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用250mL CH2Cl2洗滌所得到的固體2次。在真空下干燥樹脂(28.9g)。元素分析觀察到的N 1.18％，Cl 3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％N/Cl比率為0.88。
實施例6.含2-(三丁基磷)乙酰基基團的聚苯乙烯聚合物的合成。
在氬填塞下，將氯乙酰基聚苯乙烯珠(Advanced Chemtech，3.0g，3.4meq/g)加入到50mL CH2Cl2中的三丁基膦(4.1g，2當量)的溶液中。攪拌漿液1周。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2(4×25mL)、MeOH(2×25mL)和丙酮(4×25mL)洗滌所得到的固體。然后，風干該樹脂。
實施例7.具有含聚乙烯基苯基三丁基磷基團的聚合物層的磁性顆粒的合成 在玻璃瓶中，將磁性Merrifield肽樹脂(Chemicell，SiMag Chloromethyl，100mg)加至2mL CH2Cl2中。加入三丁基膦(80μL)，并在室溫下搖動漿液3天。在該瓶下放置磁體，并用移液管除去上清液。用2mL CH2Cl2洗滌固體4次(洗滌液也通過磁體/移液管步驟除去)。風干該樹脂(93mg)。
實施例8-Br.含三丁基磷基團和溴化物陰離子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
用35mL SOCl2回流聚甲基丙烯酸樹脂4小時，以形成酰基氯。在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(4.8g)和三乙胺(11.1g)。加入3-溴丙醇(9.0g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用40mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(8.7g)。
在氬下，于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(8.5g)。加入三丁基膦(16.2g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。然后，風干該樹脂(5.0g)。
實施例 8-Cl.含三丁基磷基團和氯化物陰離子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(12.2g)和三乙胺(23.2g)。加入3-氯丙醇(12.8g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(12.8g)。
在氬下，于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(12.8g)。加入三丁基膦(27.8g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用2×100mL CH2Cl2和2×100mLMeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(9.8g)。
實施例8-S.含三丁基磷基團和烷基硫酯(alkylthioester)鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于20mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(3.6g)和三乙胺(8.9g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2的3-巰基-1-丙醇(5.8g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用CH2Cl2、水和甲醇洗滌該樹脂。風干該樹脂(3.5g)。
在氬下，于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.3g)。加入四溴化碳(14.9g)和三苯基膦(11.8g)。回流該混合物5小時。過濾該漿液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.2g)。
在氬下，于40mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(4.2g)。加入三丁基膦(6.7g)并攪拌該漿液8天。過濾該漿液，并用90mL CH2Cl2以及隨后用50mLMeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.0g)。
實施例9.含三丁基磷基團和酯鍵的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于50mL乙腈中，攪拌聚苯乙烯丙烯酸羥甲酯樹脂(polystyrene hydroxymethylacrylate resin)(5.0g)。在氬下攪拌三丁基膦(2.1g)和4.0M HCl(2.5mL)15分鐘。在1小時內，以4等份將此溶液加入到該樹脂漿液中。除去冰水浴并在室溫下攪拌漿液3小時。過濾漿液，并用50mL乙腈隨后用2個50mL份的CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(6.24g)。
實施例10.含三丁基磷基團和酯鍵的聚乙烯基苯基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于100mL CH2Cl2中攪拌羥甲基化聚苯乙烯(Aldrich，2.0meq/g，5.0g)和三乙胺(2.3g)。加入氯乙酰氯(1.9g)并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾漿液，并用40mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(5.8g)。加入三丁基膦(3.2g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。然后，風干該樹脂(5.9g)。
實施例11.含三丁基磷基團和2個酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成 在氬下，在冰水浴中，于50mLCH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂和吡啶。加入四氟氫醌(2.7g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液43小時。過濾漿液，并依次用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。風干該樹脂(1.3g)。
在氬下，在冰水浴中，于30mL CH2Cl2中攪拌該樹脂和三乙胺(662mg)。加入4-溴丁酰氯(1.12g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌該漿液2天。過濾該漿液，并依次用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。風干該樹脂(1.3g)。
在氬下于18mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂。加入三丁基膦(4.7g)并攪拌該漿液10天。過濾該漿液并依次用CH2Cl2、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(1.3g)。
實施例12.含三丁基磷基團和酯鍵的可光裂解的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于25mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.0g)和三乙胺(4.2g)。在100mL CH2Cl2中稀釋[4，5-雙(4-溴-1-丁氧基)-2-硝基苯基]-苯基甲醇(16.7g)并將其加入。除去冰水浴，并在室溫下過夜攪拌漿液。過濾漿液，并用100mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。風干該樹脂(2.5g)。
在氬下于50mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(2.5g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌該漿液7天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2洗滌該樹脂2次。然后，風干該樹脂(2.4g)。
實施例13.含三丁基磷基團和芳基硫酯(arylthioester)鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于25mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.7g)和三乙胺(8.6g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2中的2-巰基芐醇(5.0g)，并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。用50mL CH2Cl2稀釋漿液，并在6000rpm下離心10分鐘。丟棄上清。用100mL MeOH洗滌該樹脂3次(在6000rpm下離心每一洗滌液10分鐘)。在最后一次洗滌后，過濾該樹脂并風干(4.2g)。
在氬下于100mL干乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(3.4g)。加入四溴化碳(10.2g)和三苯基膦(8.0g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(2.8g)。
在氬下于40mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(2.8g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌漿液8天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2隨后用125mL MeOH洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(2.7g)。
實施例14.含三甲基磷基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巰基芐醇(9.3g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.8g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(1.04g)。加入于THF中的1.0M三甲基膦溶液(7.3mL)，并攪拌漿液10天。過濾該漿液，并用100mLCH2Cl2、100mL THF、50mL MeOH和100mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(1.10g)。
實施例15.含三辛基磷基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下于100mL CH2Cl2中，攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巰基芐醇(9.3g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(5.8g)。
在氬下于100mL干燥的乙腈中，重懸并攪拌該樹脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用100mL乙腈、200mL CH2Cl2、200mL MeOH和200mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(4.8g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中，重懸并攪拌該樹脂(1.68g)。加入三辛基膦(4.4g)并攪拌漿液10天。過濾該漿液，并用100mL CH2Cl2、100mL THF、50mLMeOH和100mL CH2Cl2洗滌該樹脂。然后風干該樹脂(1.67g)。
實施例16.用聚甲基丙烯酸酯連接體官能化的、并含有三丁基磷基團和芳基硫酯鍵的磁性二氧化硅顆粒的合成 將磁性的羧酸官能化的二氧化硅顆粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，0.6g)置于6mL亞硫酰氯中并回流3小時。減壓下除去過量的亞硫酰氯。在氬下，在冰水浴中，將樹脂重懸于40mL CH2Cl2中。加入三乙胺(1.2g)。加入2-巰基芐醇(0.7g)并除去冰水浴。在室溫下過夜搖動該漿液。過濾該漿液，并用35mL MeOH以5000rpm離心樹脂10分鐘。棄上清液。橙黃色的樹脂被風干(335mg)。
在氬下于45mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(335mg)。加入四溴化碳(2.0g)和三苯基膦(1.6g)。回流混合物3小時。以5000rpm離心該樹脂10分鐘，并丟棄上清。用50mL乙腈以5000rpm離心該樹脂10分鐘，2次，并丟棄上清。然后，風干該樹脂(328mg)。
在氬下于40mL CH2Cl2中重懸該樹脂(328mg)。加入三丁基膦(280mg)并搖動漿液10天。通過在瓶的外部放置磁體沉降磁性樹脂，并傾析上清。用30mLCH2Cl2洗滌該樹脂3次，隨后用25mL MeOH洗滌3次。然后，風干該樹脂(328mg)。
實施例17.含有三丁基磷基團和芳基硫酯鍵的磁性聚合甲基丙烯酸酯顆粒的合成。
Sera-MagTM磁性羧酸酯微粒(Seradyn)被用于形成可裂解磁性顆粒。Sera-Mag顆粒包括聚苯乙烯-丙烯酸聚合物芯，其被用專用聚合物包封的磁鐵礦包覆層包圍。羧酸酯基團在表面上是可及的。顆粒(0.52meq/g，0.50g)被懸浮于15mL水和25mL 0.1M MES緩沖液中(pH 4.0)。在加入126mg EDC(1-[3-二甲氨基]丙基)-3-乙基碳二亞胺氫氯化物)和110mg 2-巰基芐醇之前，對該反應混合物超聲處理5分鐘。搖動該反應混合物7天。過濾該反應混合物。
用50mL水和100mLMeOH洗滌該樹脂。風干該樹脂(0.53g)。
在氬下于20mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(0.53g)。加入四溴化碳(174mg)和三苯基膦(138mg)。在65℃下超聲處理該混合物5小時。將反應混合物置于大磁體上并傾析上清。用乙腈洗滌該樹脂4次，用磁體沉淀該樹脂，并丟棄洗滌液。將該樹脂重懸于MeOH中并搖動過夜。用MeOH洗滌該樹脂4次，用磁體沉淀該樹脂，并丟棄洗滌液。然后，風干該樹脂(0.52g)。
將該樹脂(0.52g)重懸于10mL乙腈中。加入三丁基膦(106mg)并搖動該反應7天。用磁體沉淀該磁性樹脂并傾析上清。用乙腈洗滌該樹脂4次并用MeOH洗滌4次。然后，風干該樹脂(0.51g)。
實施例18.含三丁基磷基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于30mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(0.6g)和三乙胺(1.5g)。加入稀釋于20mL CH2Cl2中的4-巰基芐醇(1.0g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。過濾該漿液，并用50mL CH2Cl2、100mL水、50mLMeOH和25mL CH2Cl2洗滌該樹脂。風干該樹脂(0.7g)。
在氬下于20mL干燥的乙腈中重懸該樹脂(0.6g)。加入四溴化碳(1.8g)和三苯基膦(1.4g)。回流該混合物3小時。過濾該漿液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(0.6g)。
在氬下于15mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(0.6g)。加入三丁基膦(0.85g)并攪拌漿液6天。過濾該漿液，并用75mL CH2Cl2隨后用150mL MeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(0.6g)。
實施例19.含三丁基磷基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，于100mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(0.71g)和三乙胺(2.2g)。加入4-羥基苯基4-溴硫代丁酸酯(2.55g)并在室溫下攪拌漿液5天。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌。風干該樹脂(0.85g)。
在氬下于20mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(0.85g)。加入三丁基膦(2.7g)并攪拌漿液3天。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂。
實施例20.含三丁基磷基團和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，于20mL CH2Cl2中攪拌聚甲基丙烯酰氯樹脂(1.0g)和吡啶(1.9mL)。加入1，4-苯二硫醇(1.85g)并在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用CH2Cl2和己烷洗滌。風干該樹脂(1.08g)。
在氬下于20mL CH2Cl2中攪拌該樹脂(1.08g)和三乙胺(3.0mL)。加入4-溴丁酰氯(1.8mL)并攪拌反應混合物2天。過濾該漿液并用CH2Cl2洗滌。風干該樹脂(1.10g)。
在氬下于30mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(1.10g)。加入三丁基膦(4.0g)并攪拌漿液5天。過濾該漿液并用CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(1.0g)。
實施例21.含三丁基磷基團的交聯的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物的合成。
在30mL亞硫酰氯中回流TentaGel S COOH珠(Advanced Chemtech，3.0g)——交聯的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物90分鐘。在減壓下除去殘余的亞硫酰氯。該樹脂重懸于30mL氯仿中并再濃縮。
在氬下，在冰水浴中，于60mL CH2Cl2中攪拌該樹脂和三乙胺(0.14g)。加入2-巰基芐醇(0.11g)并除去冰水浴。在室溫下攪拌漿液2天。過濾該漿液，并用CH2Cl2、水、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。過濾并風干該樹脂(2.9g)。
在氬下于60mL干燥的乙腈中重懸并攪拌該樹脂(2.8g)。加入四溴化碳(0.36g)和三苯基膦(0.29g)。回流該混合物4小時。過濾該漿液，并用乙腈、MeOH和CH2Cl2洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(2.8g)。
在氬下于50mL CH2Cl2中重懸并攪拌該樹脂(2.7g)。加入三丁基膦(0.21g)并攪拌漿液6天。過濾該漿液，并用50mLCH2Cl2隨后用175mL MeOH洗滌該樹脂。然后，風干該樹脂(2.8g)。
實施例22.含有琥珀酸酯連接的三丁基磷基團和硫酯鍵的可控多孔玻璃珠的合成。
將Millipore LCAA玻璃(1.0g，38.5微摩爾/克)懸浮于10mL干燥的吡啶中。加入琥珀酸酐(40mg)并在室溫下搖動反應混合物4天。用20mL MeOH稀釋該反應混合物，并過濾該混合物。用20mL MeOH洗滌固體5次，并用20mLCH2Cl2洗滌5次。風干該固體(1.0g)。
將該固體(0.50g)懸浮于10mL干燥的CH2Cl2中。加入二環己基碳二亞胺(10mg)和2-巰基芐醇，并在室溫下搖動反應混合物6天。用CH2Cl2稀釋該反應混合物并過濾該混合物。用MeOH洗滌固體3次并用CH2Cl2洗滌3次。風干該固體(0.50g)。
在氬下于10mL干燥的乙腈中重懸該固體(400mg)。加入4-溴化碳(14mg)和三苯基膦(11mg)。回流該混合物3小時。過濾該混合物，并用50mL MeOH洗滌固體5次，以及用50mL CH2Cl2洗滌5次。風干該固體(360mg)。
在氬下于10mL CH2Cl2中重懸該固體(300mg)。加入三丁基膦(5滴)并搖動反應混合物5天。用CH2Cl2稀釋該反應混合物并過濾。用50mL CH2Cl2洗滌該固體5次并風干(300mg)。
實施例23.含吖啶酯(acridinium ester)基團的聚乙烯基芐基聚合物的合成。
在氬下，在冰水浴中，于40mL CH2Cl2中攪拌吖啶9-羧酸氯化物(Acridine 9-carboxylic acid chloride)(1.25g)和三乙胺(1.3g)。加入羥基苯硫酚樹脂(Polymer Laboratories，1.67meq/g，3.0g)，并除去冰水浴。在室溫下過夜攪拌漿液。過濾該漿液，并用200mL CH2Cl2洗滌該樹脂3次。風干該樹脂(4.4g)。
在氬下于40mL CH2Cl2中攪拌該樹脂(4.3g)。加入三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)(6.1g)并攪拌反應混合物2天。過濾該漿液并用200mL CH2Cl2和1LMeOH洗滌該樹脂。真空干燥該樹脂(4.7g)。
實施例24.含910-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛(acridan ketene dithioacetal)基團的聚乙烯基芐基聚合物的合成。
在氬下，在-78℃下，于20mL無水THF中攪拌N-苯基9，10-二氫化吖啶(0.62g)。加入丁基鋰(2.5M，在己烷中，0.93mL)并于-78℃攪拌反應混合物2小時。加入二硫化碳(0.16mL)并于-78℃攪拌反應混合物1小時。將反應混合物溫熱至室溫。加入Merrifield’s肽樹脂(1.6meq/g，1.0g)并在室溫下過夜攪拌該混合物。過濾該混合物。用10mL丙酮洗滌樹脂5次，用10mL水洗滌3次以及用10mL丙酮洗滌2次。風干該樹脂(1.21g)。
在氬下于20mL無水DMF中攪拌該樹脂(1.21g)和NaH(60％，在油中，0.003g)4小時。加入1，3-二溴丙烷(0.07mL)并攪拌混合物3天。過濾該混合物。用10mL丙酮洗滌樹脂3次，用10mL水洗滌5次以及用10mL丙酮洗滌5次。風干該樹脂(1.22g)。
在氬下于20mL DMF中重懸并攪拌該樹脂(1.22g)。加入三丁基膦(1.18g)并攪拌漿液7天。過濾該漿液并用20mL CH2Cl2洗滌該樹脂4次以及用20mL丙酮洗滌4次。然后，風干該樹脂(1.07g)。
實施例25.從可水解裂解顆粒結合并洗脫DNA的一般步聚 在管中用500μLTHF漂洗10mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用200μL水重復漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL含水NaOH于37℃溫育5分鐘洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于分析。
實施例26.熒光測定步驟 通過熒光測定，使用PicoGreen對DNA進行染色而分析上清液和洗脫劑中DNA含量。簡要地，將10μL含有或疑似含有DNA的溶液等分試樣與190μL熒光DNA“染色”液溫育。熒光染色劑為在0.1M tris，pH 7.5，1mM EDTA中以1∶400稀釋的PicoGreen(Molecular Probes)。在溫育樣品至少15分鐘后，在微量板熒光分析儀(microplate fluorometer)(Fluoroskan，LabSystems)中測量熒光。濾片組為480nm和535nm。含有已知量的相同DNA的陽性對照以及陰性對照被同時進行。
實施例27.從可裂解珠結合和釋放DNA 通過熒光測定，便用PicoGreen(Molecular Probes)對DNA進行染色而分析上清液和洗脫劑中DNA含量。結果通過與用原始的2μg DNA溶液的等分試樣獲得的值相比較來表示。對結合步驟的洗滌液和上清液的分析確定了被珠捕獲的DNA的百分比。
實施例#的珠[NaOH](M)結合％釋放％11 0.005 363313 1 100 10014 1 3610015 1 100 10018 1 100 7819 0.1 100 10020 0.05100 7921 1 100 7722 1 100 72實施例28.洗脫時間和溫度對于從可裂解顆粒洗脫DNA的效應 根據實施例25的方案處理實施例13的珠。在室溫下或者37℃，將DNA結合珠與1M NaOH溫育1、5或10分鐘的時間期間，并通過熒光測定釋放的DNA分數。
洗脫時間室溫37℃1分鐘 80％100％5 90 9010 90 120實施例29.使用離心柱從可裂解珠結合和釋放DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的20mg珠。在溫育2分鐘后，離心該柱30秒并收集上清。用2×200μL水洗滌珠并丟棄洗滌液。通過下述步驟洗脫DNA用200μL0.5M NaOH于37℃洗滌珠1分鐘、離心30秒并收集洗脫液，用于熒光和凝膠電泳分析。直接使用洗脫液而不需要沉淀DNA，通過PCR擴增洗脫的DNA。
實施例30.從實施例13的可裂解珠結合并釋放的質粒DNA的PCR擴增 在0.5M NaOH中的前一實施例的洗脫的DNA(1μL)經受用1對引物進行的PCR擴增，其產生285bp的擴增子。PCR反應混合物含有下表中所列出的組分。
組分體積(μL)10×PCR緩沖液 10引物1 8引物2 82.5mM dNTPs 850mM MgCl25Taq DNA聚合酶 0.5模板1或2去離子水59.5或58.5 陰性對照用1或2μL 0.5M NaOH或1μL水替換反應混合物中的模板。進一步的反應使用1μL以1∶10稀釋于水中的模板。反應混合物經受22個循環94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1分鐘。反應產物在1％瓊脂糖凝膠上跑膠。
圖3說明了從珠洗脫的DNA是完整的。
實施例31.用實施例13的三丁基磷珠結合不同長度的寡核苷酸并用1M NaOH釋放。
對從20個堿基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸進行實施例25的結合和釋放方案。用200μL 1M NaOH于37℃裂解該珠5分鐘。使用ssDNA的熒光染色劑——OliGreen熒光測定DNA的量。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％20648181 47424 52753 702.7kb 51 在室溫下，使用30分鐘的珠反應，重復進行試驗以裂解聚合物，產生了如下結果。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％2073309實施例32.從實施例16的磁性可裂解珠結合和釋放DNA 將2μL線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg可裂解磁珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。磁分離該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠與2×200μL 0.5M NaOH于37℃溫育5分鐘來洗脫DNA。離心該混合物并移出洗滌液，用于熒光分析。所有的DNA都結合于該珠。第一洗脫液含有92％的結合DNA；第二洗脫液含有13％。
實施例33.從實施例17的磁性可裂解珠結合和釋放DNA 按照相同的步驟，實施例17的可裂解磁珠被用于結合和釋放2μg的線性化pUC18 DNA。對結合步驟中的上清液的分析揭示了DNA被完全結合。在從珠釋放后對洗脫液的分析表明完整的DNA被洗脫。
實施例34.實施例16的磁珠的結合容量 下表中列出的各種量的DNA被結合于實施例16的可裂解磁珠，并如上所述用0.5M NaOH洗脫。熒光測定上清液和洗脫液，以評價結合容量和釋放不同量的DNA的能力。
輸入DNA的量結合％洗脫％2 100 834 100 836 100 8410 100 9014 100 100實施例35.用較小的洗脫體積釋放結合于實施例13的可裂解珠上的DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的10mg珠。在溫育5分鐘后，離心該柱1分鐘并收集上清。用2×200μL水洗滌珠并丟棄洗滌液。如下洗脫DNA 3次通過每次用40μL 0.5M NaOH于37℃洗滌珠5分鐘、離心30秒、并在每一次洗脫后收集洗脫液用于熒光和凝膠電泳分析。所有起始DNA都被結合。發現洗脫液分別含有65％、22％和9％。
實施例36.將大體積中的DNA結合至實施例16的可裂解磁珠上并用小洗脫體積釋放。
將2μg線性化pUC18 DNA在1mL、2mL或10mL水中的溶液加至10mg實施例16的可裂解磁珠，并如上所述用200μL 0.5M NaOH于37℃洗脫5分鐘。將來自1mL和2mL結合反應的上清液濃縮至大約(ca.)100μL，用于分析。所有三個操作的洗脫液同樣被熒光測定。上清液不含DNA。所有洗脫液含有＞80％的起始DNA。
實施例37.用實施例13的聚合物珠分離細菌培養物的DNA。
使大腸桿菌(E.coli)培養物過夜生長。在4℃下以6000×g離心50mL的部分15分鐘，以沉淀細胞。該沉淀被重懸于4mL 50mM tris，pH 8.0，10mMEDTA中，其含有100μg/mL RNase A。然后，將4mL含有1％SDS的0.2M NaOH溶液加至該混合物，其被輕輕混合并在室溫下保持4分鐘。接下來，加入4mL冷卻至4℃、pH 5.5的3M KOAc，混合該溶液并使其保持10分鐘，以沉淀SDS。過濾出沉淀物并收集濾液。
混合以1∶10稀釋于水(200μL)中的裂解物和10mg實施例13的珠，并溫育20分鐘。純化的pUC18溶液——在細胞裂解液中為0.33μg/μL——也被制備，并結合于10mg相同的珠上。結合后，離心該珠并除去上清。用2×200μL水洗滌珠樣品，然后用200μL 5mM NaOH于37℃洗脫5分鐘。凝膠電泳顯示出質粒DNA從裂解物回收，其與結合于磁珠并釋放的質粒對照或在游離的溶液中的質粒對照匹配。結果示于圖4中。
實施例38.用實施例19的聚合物珠分離細菌培養物的DNA 根據上述的相同方案，使用實施例19的珠，分離前一實施例的細胞裂解物中的DNA。結果在實施例37中。結果示于圖4中。
實施例39.從不同的pH 溶液將DNA結合至實施例13的珠上，顯示出在寬范圍的pH內的有效捕獲。
制備pH跨度為4.5至9.0的緩沖液。具有pH 4.5至6.5的緩沖液為10mM乙酸鹽緩沖液。具有pH 7.0至9.0的緩沖液為10mM tris乙酸鹽緩沖液。在室溫下，將2μg線性化pUC18 DNA在200μL每一緩沖液中的溶液加至10mg實施例13的可裂解珠30-45秒。在每一緩沖液中，平行運行陰性對照溶液，其不含DNA。在將珠樣品離心后除去上清，并用UV和熒光分析。
緩沖液pH結合％(通過UV)結合％(通過熒光)4.5 56 735.0 64 685.5 58 646.0 61 716.5 57 74
7.0 49 617.5 44 608.0 45 558.5 37 399.0 31 33單獨地，發現在pH 8.0下使用20mg珠結合5分鐘導致100％的DNA捕獲。
實施例40.通過使用不同堿性溶液進行水解，從可裂解珠釋放DNA 將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg實施例13、18、19和20的可裂解珠，并用200μL下面列出的不同濃度的NaOH溶液于37℃洗脫5分鐘。實施例13的珠也被用KOH和NH4OH溶液裂解。通過凝膠測定所有試驗的洗脫液。所測試的所有水解條件都導致裂解和DNA的釋放。
堿 濃度(M)NaOH0.005`` 0.01`` 0.05`` 0.1`` 0.5`` 1.0KOH 0.5NH4OH 0.5`` 1.0實施例41.從實施例8-Br和8-S的可裂解珠結合和釋放DNA 在管中用500μL THF漂洗兩種中珠中的每一種的25mg樣品。離心內容物并除去液體。用500μL水重復該漂洗過程。將16μg線性化pUC18 DNA在500μL水中的溶液加至所述珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×500μL水漂洗所述珠并丟棄水。通過將所述珠與500μL 1M NaOH于37℃溫育16小時而洗脫DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于進行熒光分析。上清不含有DNA，所有DNA都被結合。發現洗脫液含有18％(8-Br)和12％(8-S)。
實施例42.從實施例13的可裂解珠洗脫的DNA在LMO擴增中的使用 將在200μL水中的、含有0.1或1μg pUC18 DNA的溶液加至先前用400μLTHF洗滌、然后用水洗滌2次的10mg珠。在溫育30分鐘之后，離心樣品管30秒并收集上清。用2×400μL水洗滌所述珠并丟棄洗滌液。通過在室溫下用100μL 1M NaOH洗滌所述珠15分鐘、離心30秒并收集洗脫液而洗脫DNA。用40μL 1M乙酸中和每一洗脫液的80μL的部分。
如美國專利5,998,175所述，使用本發明的聚合珠分離的質粒DNA通過LMO進行擴增，其直接使用洗脫液而未沉淀DNA。簡要地，通過熱循環方案，使用一對引物和一組跨越68個堿基區域的八聚體，擴增68 bp的區域。將一組12個八聚體-5′-磷酸鹽(每條鏈6個)、引物和模板(1μL)溶解在Ampligase緩沖液中。用50μL礦物油覆蓋反應管并加熱至94℃5分鐘。在約2分鐘之后，將100UAmpligase加入每一管中。樣品被循環35次94℃，30秒； 55℃，30秒；35℃，30秒。擴增反應物的凝膠電泳揭示了具有期望分子量的條帶。
實施例43.使用實施例13的可裂解珠從全血分離人基因組DNA 通過標準方案制備的來自16個人血樣(1-3mL)的沉淀的白細胞被懸浮于100μL的裂解緩沖液中，該裂解緩沖液含有pH 8.0的0.2M tris、0.1M EDTA、1％SDS。將蛋白酶K(10μg)加入每一管并將管于55℃溫育4小時。將3M KOAc(100μL)加至每一管中并通過輕輕翻轉混合管。在13,000rpm下離心所述管。除去上清并用水以1∶2稀釋。在室溫下使溶液中的DNA結合至10mg珠20分鐘。在結合后，離心所述珠并除去上清。用2×200μL水洗滌所述珠樣品，然后用200μL5mM NaOH于37℃洗脫5分鐘。通過瓊脂糖凝膠電泳分析每一洗脫液樣品。圖5顯示了高分子量DNA從所有樣品的回收。
實施例44.通過酶促反應在實施例24的9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛聚合物上結合和釋放DNA。
在管中用500μLTHF漂洗60mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用400μL水重復漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在250μL水中的溶液加至珠并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。
通過用HRP和過氧化物酶促氧化9，10-二氫化吖啶連接體部分來洗脫DNA。組合物含有14飛摩爾(fmol)的HRP，在pH 8.0的0.025M tris、4mM對羥基肉桂酸、2.5mM過氧化脲、0.1％Tween-20、0.5mM EDTA中。平行運行缺乏HRP的對照組合物。所述珠與組合物的反應在室溫下進行1小時。通過熒光測定和通過凝膠電泳分析溶液的DNA含量。對上清液的分析顯示了DNA的100％結合。對洗脫液的分析顯示了在酶促反應中結合的DNA的52％被洗脫；在對照中無DNA被洗脫。
實施例45.實施例23的吖啶酯聚合物上的DNA的結合和釋放。
在管中用1mLTHF漂洗100mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用2×1mL水重復漂洗過程。將75μgpUC18 DNA在586μL水中的溶液加至珠，并在室溫下輕輕搖動該混合物2小時。平行進行不含DNA的陰性對照珠樣品。離心該混合物并收集上清。用2×1mL水漂洗該珠并丟棄水。對上清液的紫外分析顯示了所述珠已結合了10％的DNA。通過與200μL含有1M過氧化脲的1M NaOH在室溫下反應30分鐘而洗脫DNA。從洗脫液分離珠并用1M乙酸中和洗脫液。通過斑點印跡對中和的洗脫液的分析，顯示了小量的DNA被釋放。陰性對照顯示無信號。
實施例46.DNA結合至實施例9的聚合物珠 在管中用1mL THF漂洗100mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用1mL水重復漂洗過程兩次。將80μg pUC18 DNA在1 mL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清，用于UV分析。該上清液含有66μgDNA。因此結合容量被測定為0.14μg/mg。
實施例47.從實施例13的可裂解珠結合和釋放RNA 在2個管中，使2μg熒光素酶(Luciferase)RNA結合至10mg珠。1×反轉錄酶緩沖液(50mM tris-HCl，pH 8.5，8mM MgCl2，30mM KCl，1mM DTT)被用于洗脫。將一個管在94℃下加熱5分鐘，而另一個管在94℃下加熱30分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上對洗脫液和對照跑膠，并用SYBR GreenTM染色。5分鐘的加熱顯示了～50％的RNA從所述珠洗脫，但30分鐘的加熱似乎使RNA變性。
實施例48.用不同的裂解/洗脫緩沖液從實施例13的可裂解珠結合和釋放RNA。
在3個管中，使1μgLuciferase RNA結合至10mg珠。任一個管中，3M乙酸鉀被用于在室溫下洗脫RNA 30分鐘。在另一個管中，1×反轉錄酶緩沖液(RT)被用于在94℃下洗脫1分鐘。第三管具有RNA提取緩沖液并被加熱至94℃1分鐘。RNA提取緩沖液由pH 8.8的10mM tris-HCl、0.14M NaCl、1.5M MgCl2、0.5％NP-40、1mM DTT組成。在1％瓊脂糖凝膠上對所有洗脫液和對照跑膠，并用SYBR GreenTM染色。3M乙酸鉀未產生可識別的RNA。1×反轉錄酶緩沖液和RNA提取緩沖液都顯示出條帶，該條帶被估計包含相應于大約50％洗脫的RNA。
實施例49.從實施例13的可裂解珠結合和釋放RNA，并通過化學發光印跡試驗檢測。
在4個管中，使1μg Luciferase RNA結合至10mg珠。2個管使用1×反轉錄酶緩沖液進行洗脫，而另2個管使用RNA提取緩沖液。將每一種類的緩沖液的一個管加熱至94℃ 1分鐘。其它兩個管被加熱至94℃5分鐘。在1％瓊脂糖凝膠上對所有洗脫液和對照跑膠，并用SYBR Green染色。使用任一種緩沖液，加熱1分鐘的洗脫液比加熱5分鐘的洗脫液都含有更多的RNA。RNA提取緩沖液比1×RT緩沖液洗脫出更多的RNA。采用過夜的毛細轉移，將RNA轉移至尼龍膜。然后，用HF-1生物素標記的引物過夜雜交RNA。用抗生物素HRP以及作為化學發光底物的Lumigen PS-3進行檢測。5分鐘的暴露驗證了凝膠結果。
實施例50.在不同混度下從實施例13的可裂解珠結合和釋放RNA。
在6個管中，使1μg Luciferase RNA結合至10mg珠。RNA提取緩沖液被用于在若干個不同的溫度下洗脫RNA 5分鐘40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。在1％瓊脂糖凝膠上對所有洗脫液和對照進行跑膠，并用SYBR Green染色。所有的溫度似乎都100％洗脫。
實施例51.用實施例1的三丁基磷珠結合線性化的pU C18DNA，并用不同的洗脫組合物釋放。
在管中用500μLTHF漂洗10mg珠樣品。離心內容物并除去液體。用200μL水重復漂洗過程。將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL下表所述的各種試劑組合物在室溫下溫育20分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于如實施例26所述的熒光分析。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％糠醇 5850mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％聚蔗糖 1950mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％HOCH2CH2SH 5250mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％DTT5250mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％丙三醇 1550mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％2-丙醇 5050mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％乙醇 3750mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％CF3CH2OH 3850mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％丙酮 4250mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％THF4150mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl15％對二烷 33實施例52. 用下表描述的試劑組合物重復實施例51的結合和釋放方案。檢測改變DTT或2-巰基乙醇的濃度的效應。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.51.25M NaCl0.1％DTT050mM tris，pH 8.51.25M NaCl1％DTT 050mM tris，pH 8.51.25M NaCl3％DTT 3650mM tris，pH 8.51.25M NaCl4％DTT 4150mM tris，pH 8.51.25M NaCl0.1％HOCH2CH2SH 050mM tris，pH 8.51.25M NaCl1％HOCH2CH2SH 050mM tris，pH 8.51.25M NaCl3％HOCH2CH2SH 3950mM tris，pH 8.51.25M NaCl4％HOCH2CH2SH 38實施例53. 用下表描述的試劑組合物重復實施例51的結合和釋放方案。檢測改變鹽NaCl和KCl的濃度的效應。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.50.1M NaCl5％DTT 150mM tris，pH 8.50.25M NaCl 5％DTT 050mM tris，pH 8.50.5M NaCl5％DTT 2750mM tris，pH 8.50.75M NaCl 5％DTT 2950mM tris，pH 8.51.0M NaCl5％DTT 2950mM tris，pH 8.51.25M NaCl 5％DTT 2650mM tris，pH 8.50.75M KCl5％DTT 6450mM tris，pH 8.51.25M KCl5％DTT 60實施例54. 用下表描述的試劑組合物重復實施例51的結合和釋放方案。洗脫珠60分鐘。
緩沖液鹽有機溶劑洗脫％50mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl0％2-丙醇 350mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl15％2-丙醇6850mM tris，pH 8.5 0.25M NaCl 30％2-丙醇6450mM tris，pH 8.5 0.5M NaCl50％2-丙醇4實施例55. 用下表描述的試劑組合物重復實施例51的結合和釋放方案。評價相對效應。
緩沖液鹽有機溶劑50mM tris，pH 8.5 1.0M乙酸鈉15％2-丙醇 ++50mM tris，pH 8.5 1.5M乙酸鈉15％2-丙醇 ++50mM tris，pH 8.5 1.25M乙酸鈉 15％2-丙醇 ++50mM tris，pH 8.5 0.75M乙酸鈉 15％2-丙醇 +50mM tris，pH 8.5 0.5M乙酸鈉15％2-丙醇 +50mM tris，pH 8.5 0.1M乙酸鈉15％2-丙醇 +實施例56. 用實施例1的三丁基磷珠結合不同長度的寡核苷酸并用試劑組合物釋放。
對范圍為20堿基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸進行實施例51的結合和釋放方案。洗脫組合物是pH 8.5的50mM tris、0.75M NaCl、5％DTT。使用ssDNA的熒光染色劑——OliGreen，熒光測定DNA的量。
寡核苷酸大小(nt)洗脫％20 39
30 4350 3668 34181 33424 33753 322.7kb20實施例57.用實施例1的三丁基磷珠結合線性化pUC18 DNA并用不同洗脫體積釋放。
將2μg線性化的pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL離心柱(Costar)中的10mg珠。在溫育20分鐘后，離心該柱并收集上清。用2×200μL水洗滌所述珠并丟棄洗液。如下洗脫DNA通過用5×200μL的50mM tris，pH 8.5、0.75M NaCl、5％DTT在室溫下洗滌所述珠5分鐘，離心并收集洗脫液，用于在每次洗脫后進行熒光和凝膠電泳分析。
以類似的方式，用5×40μL相同的緩沖液洗脫含有結合DNA的珠。
洗脫百分比200μL洗脫液 40μL洗脫液洗脫163 47洗脫210 11洗脫35.5 10洗脫43.5 5洗脫52.1 4總量 84 77實施例58.用實施例5的三丁基銨珠結合和釋放核酸。
將2μg線性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg的珠中，并輕輕搖動該混合物30分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、0.75M NaCl、5％DTT于室溫下溫育30分鐘洗脫DNA。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實施例26中所述。DNA結合為50％，洗脫為結合部分的69％。
實施例59.用實施例7的磁性三丁基磷珠結合和釋放核酸。
在管中用500μLTHF漂洗10mg珠樣品。磁法分離內容物并除去液體。用200μL水重復漂洗過程。將在200μL水中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至所述珠中，并輕輕搖動該混合物20分鐘。磁分離該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇于室溫下溫育30分鐘而洗脫DNA。磁分離該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實施例26中所述。DNA結合為100％，洗脫為18％。
實施例60.實施例1的三丁基磷珠結合線性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脫溫度釋放。
將在200μL水中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至10mg的珠中，并輕輕搖動該混合物30分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。通過將該珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇在不同溫度下溫育5分鐘而洗脫DNA37℃、46℃、65℃和94℃。離心該混合物并移出洗脫液，用于熒光分析，如實施例26中所述。在所有溫度下，DNA結合為100％，洗脫為結合部分的約65-70％。
實施例61.對從實施例1的珠結合并釋放的質粒DNA的PCR擴增。
在實施例51的步驟之后，在0.5M NaOH中1μL洗脫的質粒DNA，用跨度為285堿基區的一對引物進行PCR擴增。PCR反應混合物含有下表所列的組分。
組分體積(μL)10×PCR緩沖液 10引物1(1.5 pmol/μL)8引物2(1.5 pmol/μL)82.5mM dNTPs850mM MgCl25Taq DNA聚合酶 0.5模板 1或2去離子水 59.5或58.5陰性對照用1或2μL 0.5M NaOH或1μL水替換反應混合物中的模板。進一步的反應使用1μL以1∶10稀釋于水中的模板。反應混合物經受22個循環94℃，1分鐘；60℃，1分鐘；72℃，1分鐘。反應產物在1％瓊脂糖凝膠上跑膠，其證明了從所述珠洗脫的DNA是完整的。
實旆例62.用實施例1的三丁基磷珠結合核酸并用Wittig反應釋放。
將在200μL水中的2μg pUC18 DNA的溶液加至10mg實施例1的珠中，并輕輕搖動該混合物20分鐘。離心該混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄水。將珠用5×400μl DMF洗滌。將DMF(300μL)中的NaOt-Bu飽和溶液和20μL丙酮與所述珠一起搖動20分鐘。離心該混合物并除去液體。用3×400μL DMF洗滌所述珠，在最后一次洗滌后除去液體。通過將該珠和200μL 10mMtris，pH 8.5一起搖動5分鐘并收集溶液而洗脫DNA。用新鮮的幾份緩沖液重復該過程2次。
實施例63.對Wittig釋放的DNA的斑點印跡分析。
在Wittig反應后，在尼龍膜上通過斑點印跡分析實施例62的三種洗脫液的部分(1μL)。UV交聯施用于膜上的DNA，并用2×SSC緩沖液漂洗。用5mL DigEasy HybTM緩沖液(Roche)于37℃預雜交該膜1.5小時。在Dig Easy Hyb緩沖液中，于37℃下，過夜雜交地高辛標記的30mer探針。在2％BM封閉液(Boehringer-Mannheim)中，用地高辛HRP偶聯物(1∶1 0,000稀釋)捕獲雜交的探針1小時。通過用Lumigen PS-3潤濕該膜并暴露于X線膠片，來檢測HRP標記。用從結合步驟獲得的洗脫的樣品和上清液平行分析含有10、5和2.5ng DNA的標準物。圖6證明，在第一次洗脫中大部分結合的DNA被除去，在第二次和第三次洗脫中越來越少的量被除去。對上清液的分析(未示出)證明了，所有的DNA都被結合到所述珠上。其中釋放的DNA在100℃被洗脫的類似實驗得到類似的結果。
實施例64.反應時間對實施例62的方案中釋放的DNA的除去的影響。
通過改變與丙酮的Wittig反應中的反應時間，進行實施例62的方案。在單獨的試驗中，使用10分鐘、20分鐘、30分鐘和60分鐘的反應時間。如實施例W2所描述的斑點印跡分析證明了，不論反應時間如何，都得到相同的結果。
實施例65.用實施例3的三苯基磷珠結合核酸并通過Wittig反應釋放。
根據實施例62所描述的一般性方法，實施例3的珠被用于結合DNA并通過Wittig釋放。通過UV對結合步驟的上清進行的分析顯示，78％的DNA被捕獲。相比于三丁基磷珠的＞0.2μg/mg，結合容量為0.156μg/mg。類似于三丁基磷珠，大部分DNA在第一次洗脫中被從珠除去。
實施例66.用實施例4的三苯基磷珠結合核酸并通過Wittig反應釋放。
根據實施例62所描述的一般性方法，實施例4的珠被用于結合25mg珠上的17μgDNA并通過Wittig反應釋放。通過UV對結合步驟的上清進行的分析顯示，14％的DNA被捕獲。結合容量為0.095μg/mg。類似于三丁基磷珠，大部分DNA在第一次洗脫中被從珠除去。
實施例67.用實施例7的磁性三丁基磷珠結合核酸并通過Wittig反應釋放。
按照實施例62的方案，其具有下面的改變。所有的分離步驟被磁性進行。有機溶劑和洗滌液用THF代替DMF。THF/NaOt-Bu溶液的體積為250μL。在tris緩沖液中，用3個15分鐘洗滌來洗脫釋放的DNA。用PicoGreen通過熒光試驗來分析洗脫液和上清液。對上清液的分析顯示100％結合到顆粒。熒光分析發現，在第一次洗脫中32％被洗脫。隨后的洗脫液包含太少的DNA，以至于用該方法無法檢測。為了比較，實施例1的非磁性珠顯示在第一次洗脫中的31％DNA，并且在隨后的洗脫中DNA太少而無法檢測。
實施例68.從實施例16的可裂解珠洗脫的DNA直接用于LMO擴增。
將在200μL 10mM pH 8.5的tris中的、包含分離自人全血的4μg基因組DNA的溶液加到20mg珠中。在溫育5分鐘后，離心該樣品管30秒并收集上清。用2×200μL水漂洗該珠并丟棄洗液。通過如下洗脫DNA用100μL的0.5MNH4OH在37℃下洗滌所述珠5分鐘，離心30秒并收集洗脫液。
如美國專利5,998,175中所述，使用本發明的聚合物珠分離的DNA通過LMO進行擴增，而無需中和或進一步的樣品預處理。簡而言之，使用一對引物以及一組2種八聚體和2種十聚體，通過熱循環步驟，制備對應于Factor V基因的片段的擴增子，其具有51個堿基的鏈和48個堿基互補，所述引物之一用6-FAM進行5′-標記。在Taq連接酶緩沖液中溶解引物和模板(1μL)。用40μL礦物油覆蓋反應管，并加熱至94℃5分鐘。然后，將20U Taq DNA連接酶加至每一管。對樣品循環40次94℃30秒；55℃30秒；38℃30秒。
對擴增反應物進行化學發光雜交測定。野生型擴增子的捕獲探針被固定于微量培養板孔中，并被用于雜交含有FAM標記的擴增產物。抗FITC-堿性磷酸酶偶聯物被結合，并用Lumi-Phos Plus檢測。通過LMO、雜交和檢測步驟，對每一基因型的血樣DNA以及水空白進行平行運行。選擇已知對照中DNA的量，以與50％回收的珠處理樣品中的量相等。該樣品以前被分型為純合子野生型。
樣本信號(RLU)樣品 24.7純合子野生型 87.3雜合子47.1純合子突變體 0.20空白 0.30實施例69.含有二甲基锍基和芳基硫酯鍵的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。
在氬下，在室溫下，于100mL CH2Cl2中，攪拌如上所述制備的聚甲基丙烯酰氯樹脂(2.96g)、5.07g 4-(甲硫基)苯硫酚和三乙胺(8.8mL)5天。過濾出該固體，并用100mL CH2Cl2和100mL水洗滌，然后在125mL甲醇中攪拌若干天。過濾并干燥所產生的3.76g硫酯產物。
將100mL CH2Cl2中的2.89g部分的固體與4.1mL三氟甲基磺酸甲酯一起攪拌7天。過濾該固體，并依次用200mL CH2Cl2、300mL甲醇和300mLCH2Cl2洗滌，然后風干。
實施例70.使用具有二甲基锍基的可裂解珠結合和釋放DNA。
將在200μL 10mM pH為8的tris中的2μg線性化pUC18 DNA的溶液加至實施例69的10mg珠樣品中，并輕輕搖動該混合物5分鐘。離心該混合物并收集上清液。用2×200μL水漂洗所述珠并丟棄水。通過與200μL 0.5M NaOH于37℃溫育所述珠5分鐘而洗脫DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于熒光分析。該上清液不含有DNA。洗脫液含有100％初始結合的DNA。
實施例71.使用具有二甲基锍基的可裂解珠結合和釋放DNA。
通過與200μL 50mM pH 8.5的tris、0.75 NaCl、5％DTT于37℃溫育5分鐘，洗脫如實施例70所述的結合至珠的DNA。離心該混合物并除去洗脫液，用于熒光分析。該上清液不含有DNA。洗脫液含有初始結合的DNA的37％。
前述的說明書和實施例僅僅是說明性的并且不被理解為限制性的。應該認識到，可以對未具體公開的具體化合物和方法作出改變，而不背離本發明的精神和范圍。本發明的范圍僅受所附權利要求的限定。
權利要求
1.用于結合核酸的固相，包括固體支持部分，包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶性多糖的基質，其表面上連接；可裂解連接體部分，其連接至所述固體支持部分，和用于吸引和結合核酸的核酸結合部分，其連接至所述可裂解連接體部分。
2.權利要求1所述的固相，其中所述核酸結合部分選自其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的式QR2+X-的三元锍基，其中R選自C4-C20烷基、芳烷基和芳基的式NR3+X-的季銨基，以及其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基的季磷基PR3+X-，并且其中X是陰離子。
3.權利要求2所述的固相，其中所述核酸結合部分是季銨基并且所述每一個R基團都包含4-20個碳原子。
4.權利要求2所述的固相，其中所述核酸結合部分是季磷基并且所述每一個R基團都包含1-20個碳原子。
5.權利要求4所述的固相，其中所述每一個R基團為丁基。
6.權利要求1所述的固相，其中所述固體支持部分包括不溶的合成聚合物。
7.權利要求1所述的固相，其中所述固體支持部分包括玻璃基質。
8.權利要求1所述的固相，其中所述固體支持部分包括二氧化硅基質。
9.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分進一步包括一個或更多個連接部分。
10.權利要求1所述的固相，進一步包括磁響應性部分。
11.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分被水解性裂解。
12.權利要求11所述的固相，其中所述可水解性裂解的連接體部分是酯或硫酯基團。
13.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分被還原性裂解。
14.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括可引發的二氧雜環丁烷環。
15.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括多電子烯烴，所述多電子烯烴通過轉化成熱不穩定性二氧雜環丁烷而被裂解。
16.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分被酶促裂解。
17.權利要求16所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛，所述9，10-二氫化吖啶乙烯酮二硫縮醛通過與過氧化物酶和過氧化物反應而被裂解。
18.權利要求16所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括酯，所述酯通過水解酶或酯酶被裂解。
19.權利要求16所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括酰胺，所述酰胺通過蛋白酶被裂解。
20.權利要求16所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括肽，所述肽通過肽酶被裂解。
21.權利要求16所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括糖苷，所述糖苷通過糖苷酶被裂解。
22.權利要求12所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括具有式 的硫酯，其中Q為P或N，而R為1-20個碳的烷基。
23.權利要求22所述的固相，其中所述可裂解連接體部分包括具有式 的硫酯。
24.權利要求1所述的固相，其中所述可裂解連接體部分是至少一個碳原子結合至三烷基磷或三芳基磷核酸結合部分的亞烷基，并且利用與酮或醛的Wittig反應可被裂解。
25.權利要求24所述固相，其中所述可裂解連接體部分具有式
26.權利要求2所述的固相，其中所述固相的核酸結合部分是式SR2+X-的三元锍基，其中R選自C1-C20烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是陰離子。
全文摘要
公開了結合核酸的固相材料和它們的使用方法。所述材料特征在于可裂解連接體部分，其可以被裂解以釋放結合的核酸。該固相材料包括固體支持部分，所述固體支持部分包括選自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶性多糖的基質，用于吸引和結合核酸的核酸結合部分連接至所述固體支持部分，所述核酸結合部分(NAB)通過可裂解連接體部分被連接至固體支持部分。優選的核酸結合部分包括三元或四元基。所述材料可以是微粒、纖維、珠、膜、試管或微孔的形式，并可以進一步包括磁芯部分。使用該可裂解固體支持物結合核酸的方法以及它們在分離或純化核酸的方法中的用途被公開。
文檔編號C07H21/02GK101018871SQ200480043907
公開日2007年8月15日 申請日期2004年12月13日 優先權日2004年7月15日
發明者H·阿哈萬－塔夫帝, R·德西瓦, R·A·埃克霍爾特, W·C·岡拉克, R·S·漢德利, K·S·勞韋斯, M·D·桑迪森, W·謝 申請人:魯米根公司