專利名稱：分離核酸的方法，該核酸在提高的溫度下固定于基質上的制作方法
分離核酸的方法，該核酸在提高的溫度下固定于基質上 本發明涉及一種改進的分離核酸的方法。
通常根據如下統一的基本模式從植物細胞、動物細胞或人類細胞以及細胞培養
物或病毒培養物中分離核酸(如DNA和RNA):首先部分地采用蛋白降解酶類消化 含有核酸的原材料。各個組分即可以在隨后步驟中通過多種不同方法進行分離。
不可避免地存在于每種細胞裂解液中的蛋白質片段的分離是一個尤其重要的 步驟。該分離可以通過，例如，使蛋白質/核酸混合物接觸苯酚和/或氯仿/異戊醇來 進行。還可以通過添加諸如鹽酸胍或異硫氰酸胍的變性鹽類將蛋白質片段從水相中 沉淀出來。還可以通過添加蛋白酶并隨后除去以降解該蛋白質。最終通過選擇性添 加DNA酶或RNA酶來除去不想要的核酸，并得到各自所需的核酸。然而，為了 防止核酸在分離過程中遭受不必要的酶性降解，必須在無菌和無核酸酶的條件下進 行操作。核酸的分離也可以通過超速離心來實現。
大部分現有技術的方法均基于以下兩種分離原理之一
"傳統方法"是基于一種單階段過程，其中，在添加緩沖液(其在大多情況下包 含胍鹽)和有機提取劑(大多為氯仿或苯酚)之后進行提取。不需要的附帶材料然后與 有機相一起被除去。留在水相中的核酸然后可通過相分離分開并分離。
該方法的主要缺點是，除了使用有毒和有害健康的物質(如異硫氰酸胍、苯酚或 氯仿)之外，作為雜質留在核酸水溶液中的水溶性材料必須在額外的、非常耗時的 純化步驟中分離。該問題讓使用此方法從植物中分離核酸變得復雜，例如，這是因 為這些植物中大多含有相當量的多糖和此類水溶性物質。
考慮到這些缺點，現有技術中還有一種可選的方法，該方法基于將核酸選擇性 吸附到固態(通常為礦物質)載體上(如二氧化硅)。在這種多階段過程中，不同的緩 沖液(裂解、結合、洗滌和洗脫緩沖液)被依次加入細胞或病毒裂解液；最后步驟中， 從載體上將純化的核酸洗脫下。
同時，專家圈已經研究過在存在離液鹽時核酸結合到礦物質載體的物理化學原 理。他們認為核酸結合到礦物質載體表面是基于水環境高度有序的結構的破壞，核 酸因此才吸附到礦物質材料(尤其是玻璃顆粒和二氧化硅顆粒)表面。
上述方法的一個特別不利之處在于，當使用由特別高比例的偽二級原料
(spurious secondary material)增強的樣品時，為了得到期望的高純度，必須考慮合理 的得率損失。
因此，本發明的目的是提供一種不存在上述從現有技術中得知的缺點的分離 RNA或DNA的方法，并提供高得率和高純度的核酸。
我們激動地發現，如果含有核酸的溶液在結合之前或結合時被加熱，那么在存 在離液劑和/或醇時，尤其當存在離液劑和醇時，核酸與二氧化硅顆粒(優選磁性二 氧化硅顆粒)的結合便能得到改進。所述改進對病毒RNA、 DNA和人工合成的 RNA，以及其它核酸種類均特別有效。
本發明的生物材料應該理解為粒子或分子基原料。尤其包括病毒、噬菌體和細 胞(例如，細菌細胞、以及人類細胞、動物細胞(如白細胞)或植物細胞)。尤其地， 本發明的方法優選地適合于從人或動物來源(例如，臨床樣品如血液、血漿、血清、 漱口水、尿液、腦脊髓液、痰、糞便、穿刺(punctates)上皮、涂片、活檢和其它組 織或骨髓樣品)的樣品原料中分離核酸(如DNA或RNA)。
樣品還可以來源于環境分析、食品分析或分子生物學研究中，例如，來自細菌 培養物、病毒培養物、噬菌體裂解液、氣體或水過濾物和擴增產物(如PCR)。
天然或修飾的生物材料可以用本發明的方法進行分離。天然生物材料應該理解 為與自然發生的生物材料相比，其結構未經不可逆地修飾的材料。然而，并不排除 樣品的其它組分的修飾。例如，當需要分離細胞時，需要真正改變細胞周圍的介質， 而非細胞本身。當需要分離核酸時，其也應該是以天然形式，即未經切割或通過在 其上偶聯反應性基團而修飾。因此，定義的天然生物材料尤其不含生物素化的核酸。 其中，病毒DNA、病毒RNA或來自人或動物樣品材料的細胞核酸是天然生物材料 的具體例子。
修飾的生物材料包括不天然發生的材料，例如通過附加反應性、可檢測的或穩 定化基團或固定基團進行修飾的核酸，例如生物素化的核酸；此外還有合成的DNA 和RNA，例如'武裝(armored)RNA，。
某些情況下，樣品可未經預處理便用于本發明的方法。然而多數情況下，樣品 需要通過適當手段進行消化以釋放樣品中所含的生物材料。消化樣品的方法被本領 域技術人員所熟知，本質上其可以是化學的、酶的或物理的方法。還可能是這些方 法的組合。
本文中，對不同生物材料采用不同方法似乎更加有利，然而在另一方面，下述
任何一種方法在原理上都是適當的裂解，在離子和非離子表面活性劑(例如，溶
于適當緩沖液的SDS、 LiDS或Sarcosyl)的幫助下采用離液鹽(例如鹽酸胍(GHCl)、 硫氰酸胍(GTC)、碘化鈉、高氯酸鈉等)進行；機械崩解，通過例如弗氏壓碎器、超 聲、用玻璃球研磨、用鋁研磨、或在液氮中研磨進行；酶促裂解，例如采用溶菌酶、 蛋白酶、鏈霉蛋白酶或纖維素酶，或其它能通過商業渠道購買到的裂解酶；通過噬 菌體或病毒感染裂解細胞；冷凍干燥；滲透壓休克；微波處理；溫度處理，如加溫、 加熱、或冷凍(如在干冰或液氮)和解凍；堿裂解。
如上所述，所有上述方法代表了本領域熟知的標準裂解方法，可以使用任何一 種方法或其組合。
因此，離液劑和表面活性劑的組合對裂解細菌細胞特別有效。用于裂解的示例 用的適當的試劑因此包括離液劑(例如，GTC或GHC1)和去污劑(例如SDS或 Sarcosyl)。這些裂解劑可以存在于水溶液或緩沖液溶液(即所謂的裂解緩沖液)。任 何適當的緩沖液均可用作緩沖液，例如，Tris、 Bicin、 Tricin或磷酸鹽緩沖液。可 選地，裂解劑還可以分別添加。裂解劑的合適濃度和含量隨各系統、細胞類型等變 化，并且可以由本領域技術人員決定，其中，例如，可以采用濃度范圍在2M到 7M的離液劑(例如，GTC、 GHC1或碘化鈉或高氯酸鈉)，O.IM到1M的堿試劑(如， NaOH)，和0.1到50 wt^(重量/體積)的去污劑。此類裂解緩沖液的例子有4M GTC 和1%(重量/體積)Sarcosyl的水溶液。
不同培養條件可能適合于不同的裂解系統并且可從現有技術中得知。對含有去 污劑和/或離液劑的裂解緩沖液而言，可在例如室溫或升高的溫度(例如在37到65 'C的范圍內)下進行培育。
同樣地，培養時間也可在幾分鐘到最多達24小時之間變化，例如，從5分鐘 到2小時。對GTC/Sarcosyl裂解緩沖液和細菌細胞而言，在例如65'C培育10到 20分鐘被證明是最有利的，但也可根據需要而改變。對用例如蛋白酶K等進行的 酶裂解而言，需要更長的處理時間，例如，超過12小時。
裂解優選在存在離液鹽時進行，其中這類鹽的濃度在2和8mol/l之間，優選地 為4到6mo1/1。離液鹽為，例如，碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽 酸胍。然而結合不限于此類化合物。優選地，結合發生于醇環境下。優選具有1 到5個碳原子的短鏈、支鏈或直鏈垸醇，如，甲醇、乙醇、丙醇、異丙醇、丁醇或 戊醇。烷醇的濃度范圍從1至1」100%(體積/體積)，優選從2到80%，更優選從5到 70%，還更優選從10到60%，最優選從15到50%變化。激動人心的是，試驗顯示
尤其在離液劑和醇條件下加熱含有核酸的溶液對病毒RNA和DNA以及對合成的 RNA和其它核酸種類的結合均有類似的影響。
為了分離核酸，使樣品與支持材料接觸，優選的支持材料為上述顆粒，并培養 一段時間，使樣品足以結合到支持材料上。對核酸而言，適當的培養時間為10秒 和30分鐘之間。實際上被證明最有利的培養時間的范圍在11+/-10分鐘。
優選采用粒度在5到25(im，優選地從6至U 15jim，尤其優選地從6到10|im和 非常現在的粒度分布的珠形或球形硅垸化磁性顆粒來分離核酸。能在本發明的方法 中有利地使用的磁性二氧化硅顆粒描述于國際專利申請WO 01/71732第6頁第29 行到第8頁第22行，且對其所有方面進行參考。本發明中的結合發生于36到75 "C的溫度范圍內，優選地46到7(TC,尤其優選地50到65。C和最優選地在56'C。 ..變性劑(如二甲基亞砜)對核酸的結合顯示出類似的效果。
繼培養之后，要從樣品液中分離生物材料(優選地為核酸)。在本發明中，這通 常需要在磁場幫助下，使用磁性二氧化硅顆粒，通過分離結合到顆粒的核酸而實現。 例如，所述磁性顆粒可以被吸附到發生培養的容器的壁上。接下來除去含有未與磁 性顆粒結合的樣品內容物的液體。
所述去除根據發生培養的容器的類型而定。適當的除去液體的方法步驟為，例 如，用移液管移除或用吸管吸除液體。
如果需要，負載的磁性顆粒可以用洗滌液純化一次或多次。選擇適當的洗滌液 以使生物材料(如核酸)優選地不會從顆粒表面釋放，或者至少不以任何顯著量釋 放，但盡可能洗去任何雜質。所述洗滌步驟優選地通過將洗滌溶液與負載的顆粒進 行培養而實現，其中，優選地，例如通過搖晃或施加不同于第一磁場的磁場來重懸 顆粒。被污染的洗滌溶液優選地以與核酸結合結束時除去裂解液同樣的方式除去。
可以采用任何常規的洗滌緩沖液或任何其它適當的介質作為洗滌溶液。通常優 選具有低或中等離子強度的緩沖液，例如，pH為8的lOmM Tris-HCl、 0-10mM NaCl。然而，還可以采用具有較高鹽濃度的洗滌緩沖液，例如，3M鹽酸胍。同樣 地，可以采用其它用于進行洗滌步驟的標準介質，如含醇介質，例如具有1至lj 5 個碳原子的低級垸醇的溶液，優選乙醇水溶液，特別優選70%的乙醇水溶液。
采用磁性顆粒能簡化洗滌步驟的操作，其利用了顆粒的磁性聚集作用，分離核 酸結合介質，除去洗滌介質并在每當本領域技術人員認為必要時加入新鮮洗滌介 質。
核酸分離步驟以及任何任選的洗滌步驟之后，載有核酸的載體被轉移(如重懸或
浸沒)到任何適當的介質內(如水或低離子強度緩沖液)。
在最后一次洗滌步驟之后可在真空下或通過分離(stripping)液體對磁性顆粒進 行短時干燥。
當然顯然的是，上述洗滌和干燥步驟不僅適用于純化和/或分離核酸，也適用于 純化和/或分離其它上述生物材料。
根據載體和后續工作的性質來選擇是否要將核酸從載體上洗脫下來。對特定的 固態載體如上述磁性顆粒而言，在多數情況下它們可以直接使用，例如用于PCR 或其它擴增方法，此時就不需要將核酸從載體上洗脫下來。而且，對許多DNA檢 測方法或DNA鑒定方法而言，盡管DNA偶爾會與球形的表面接觸并可能通過氫 鍵、離子鍵或其它作用力結合到許多位置上，仍然有足夠長的DNA可用于與寡核 苷酸雜交和擴增，因此洗脫同樣是不必要的。
當所述生物材料為天然核酸時，根據本發明，需要用低鹽含量的洗脫緩沖液將 核酸從磁性顆粒上除去。此類緩沖液從現有技術中獲知[Analytical Biochemistry 175,196-201(1988)]。鹽濃度低于0.1mol/l的緩沖液特別適合作為低鹽含量的洗脫緩 沖液。尤其優選的洗脫緩沖液含有Tris-HCl。
去離子水也特別適用于洗脫。
如果需要，還可以將RNA與DNA分離并除去，這可以通過在DNA分離步驟 之前破壞RNA來實現，例如，通過添加RNA酶或堿，如NaOH。
通過將本發明上文所述的細胞分離與本發明其它地方所述的核酸分離相結合， 優選在本發明所述的升高的結合溫度下以它們的天然形式結合到優選為顆粒形式 的磁性載體材料上，提供一種尤其有利的從細胞樣品中分離核酸的方法。該實施方 案的優勢不僅在于它的簡單與高靈敏度，還在于它通過在升高的溫度下根據本發明 將核酸結合到二氧化硅表面以易于自動化地卻特別地獲得高得率。
作為本發明的方法的結果，分離的生物材料可以任何所需方式進一步使用。例
如，它可用來作為各種酶反應的底物。就以實施例的方式提到的核酸而言，可用于 測序、放射性或非放射性標記、含有所述核酸的單或多序列的擴增、轉錄、與標記 有探針的核酸雜交、翻譯或結合。本發明方法的一中優勢在于，從液體中分離生物 材料，特別是核酸，不僅僅簡單，而且具有高得率和高通過率。


圖1顯示了實時(RT)-PCR之后HCV-RNA的Ct值的平均數與結合溫度的關系。 該圖進一步的描述在實施例1中。
圖2顯示了實時(RT)-PCR之后HCV-RNA(圖2a))、 HBV-DNA(圖2b))和'武裝
HIV'(圖2c))的Ct值的平均數與結合溫度的關系。該圖進一步的描述在實施例2中。
實施例1
提取病毒RNA和病毒DNA(采用MagAttract Virus Mini M48 Kit (QIAGEN， Hilden，德國))。
400|il血漿、血清或CSF(液態)用市售裂解緩沖液如含有3嗎載體RNA的435pJ QIAGEN裂解緩沖液AL和蛋白酶如80^1重懸于QIAGEN蛋白酶重懸緩沖液的凍 干的QIAGEN蛋白酶處理，并混勻。混合物在56'C下培養15分鐘。
然后加入磁性二氧化硅顆粒如30|il MagAttract Suspension B (QIAGEN， Hilden， 德國)和525|il異丙醇。然后在8°C、 18°C、 26°C、 36°C、 46°C、 56°C、 65。C或75 'C培養5分鐘(見下文)，其間核酸結合到磁性二氧化硅顆粒上。分離顆粒之后丟棄 液相，顆粒用洗滌緩沖液如500|il用乙醇重建的QIAGEN洗滌緩沖液AW2洗滌。 重復后面的洗滌步驟。顆粒然后用500pl乙醇洗滌。分離顆粒之后丟棄乙醇相，并 在室溫下千燥顆粒。接下來用市售的洗脫緩沖液如100pl QIAGEN AVE洗脫緩沖液 洗脫核酸，丟棄磁性二氧化硅顆粒，所述洗出液在75。C加熱超過5分鐘。
按照上述方法處理HCV(RNA病毒)陰性的人血漿。樣品分成同樣的12份，先 回火，然后每份分別在8'C、 18°C、 26°C、 36°C、 46。C、 56°C、 65。C和75。C進行結 合。每份獲得的洗出液進行HCV-特異性實時(RT)-PCR。從對應于結合溫度的Ct 值的平均數來看(圖1)，清楚地知道采用本發明的方法，溫度范圍從36"C到75i:時 進行的結合，令人印象深刻地解決了作為本發明的基礎的目標。
實施例2
在另一個試驗中，HCV(單鏈RNA病毒)、HBV(雙鏈RNA病毒)和'武裝HIV' (包裝入蛋白鎧甲內的合成的RNA)陰性的人血漿根據上述實施例中描述的方法進 行處理。
每種條件下對6份同樣的樣品分別進行6輪試驗， 一方面用標準QIAGEN MagAttract Virus Mini M48試驗方法(實施例1中的試驗方法，但在8匸時結合核酸)， 另外采用修改的MagAttract Virus Mini M48試驗方法，即裂解產物在結合前先于 56'C回火。每種條件下獲得的洗出液進行針對HCV、HBV和HIV的實時(RT)-PCR。 從對應于結合溫度的Ct值的平均數(如圖2a到圖2c所示)可以很明顯看出，采用本 發明的方法，在升高的溫度下結合核酸顯著增加了得率。
權利要求
1.一種分離和/或純化核酸的方法，所述方法包括以下步驟a)裂解生物樣品，b)在離液序列高的化合物和/或支鏈或直鏈烷醇存在的情況下，將釋放出的核酸固定在基于一種或多種硅-氧化合物的基質上，并任選洗滌固定在所述基質上的核酸，c)用已知方式分離結合的核酸，其特征在于，所述核酸的固定是在36℃到75℃的溫度范圍內進行的。
2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述固定是在46'C到7(TC的溫度范 圍內進行的。
3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，所述固定是在50'C到65'C的溫度范 圍內進行的。
4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述固定是在56'C的溫度下進行的。
5. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述硅-氧化合物為二氧化硅。
6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述基質為具有二氧化硅表面的磁 性顆粒。
7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述離液序列高的化合物為離液序 列高的鈉鹽或胍鹽。
8. 如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述離液序列高的鈉鹽或胍鹽為碘 化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍或兩種或多種所述鹽的混合物。
9. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述支鏈或直鏈烷醇為具有1到5 個碳原子的醇。
10. 如權利要求9所述的方法，其特征在于，所述醇為甲醇、乙醇、異丙醇、支 鏈或直鏈丁醇、戊醇、或所述醇的混合物。
11.如權利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述醇以水溶液形式存在， 其濃度從1到100%(體積/體積)，優選地從2到80%，更優選地從5到70%,還更 優選地從10到60%,最優選地從15到50%。
12. 用權利要求1到11中任一項所述方法分離的核酸。
13. —種在存在離液劑和/或支鏈或直鏈烷醇的情況下將核酸固定在基于硅-氧化 合物的基質上的方法，其特征在于，所述核酸的固定是在36。C到75X:的溫度范圍內進行的。
14. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述固定在具有二氧化硅表面的 基質上是在存在具有1到5個碳原子的支鏈或直鏈垸醇或其水溶液時，在46'C到 7(TC的溫度范圍內進行的。
15. 如權利要求14所述的方法，其特征在于，所述固定是在存在甲醇、乙醇、 丙醇、異丙醇、和/或支鏈或直鏈丁醇、或戊醇時，或是在存在所述醇或其混合物 的水溶液時，在5(TC到65'C的溫度范圍內進行的。
16. 如權利要求15所述的方法，其特征在于，所述固定是在存在濃度范圍從1 到100%(體積/體積)，優選地從2到80%，更優選地從5到70%,還更優選地從10 到60%，最優選地從15到50%的甲醇、乙醇、丙醇和/或異丙醇的水溶液時，在溫 度為56'C時進行的。
17. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述離液序列高的化合物為離液 序列高的鈉鹽或胍鹽。
18. 如權利要求17所述的方法，其特征在于，所述離液序列高的鈉鹽或胍鹽為 碘化鈉、高氯酸鈉、硫氰酸胍、異硫氰酸胍或鹽酸胍或兩種或多種所述鹽的混合物。
19. 如權利要求13、 17或18中任一項所述的方法，其特征在于，所述固定在具 有二氧化硅表面的基質上是在46X:到7(TC的溫度范圍內進行的。
20. 如權利要求19所述的方法，其特征在于，所述固定是在5(TC到65'C的溫度 范圍內進行的。
21. 如權利要求20所述的方法，其特征在于，所述固定是在溫度為65X:時進行的。
22. 如權利要求13所述的方法，其特征在于，所述基質為具有二氧化硅表面的 磁性顆粒。
全文摘要
本發明涉及一種改進的從細菌、植物、動物或人類細胞以及細胞培養物和病毒培養物中分離核酸(如DNA和RNA)的方法。
文檔編號C12N15/10GK101115833SQ200680004094
公開日2008年1月30日 申請日期2006年2月13日 優先權日2005年2月11日
發明者G·舒爾特, M·斯普倫加-豪斯塞爾, S·費勒克, T·多伊奇曼 申請人:恰根有限公司