分離的編碼popdc1突變體的核酸及其應用
【專利摘要】本發明公開了POPDC1基因突變體及其應用，具體涉及分離的編碼POPDC1突變體的核酸，分離的多肽，篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的系統，用于篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的試劑盒，以及構建藥物篩選模型的方法。其中，該分離的編碼POPDC1突變體的核酸，與SEQ ID NO：1相比，具有c.602C>T突變、c.515G>A突變、c.385C>T突變和c.427A>G突變的至少之一。通過檢測該新突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患肢帶型肌營養不良癥。
【專利說明】
分離的編碼P0PDC1突變體的核酸及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物技術領域，具體地，涉及分離的編碼P0PDC1突變體的核酸及其應 用，更具體地，涉及分離的編碼P0PDC1突變體的核酸、分離的多肽、篩選易患肢帶型肌營養 不良癥的生物樣品的系統、用于篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的試劑盒、構建 體、重組細胞以及構建藥物篩選模型的方法。
【背景技術】
[0002] 肢帶型肌營養不良癥（imb-girdle muscular dystrophy，LGMD)，是臨床上以肩胛 帶和骨盆帶肌不同程度無力或萎縮為主要特點的一組疾病，是進行性肌營養不良癥中除杜 氏和貝克型營養不良癥（DMD/BMD)外最常見的類型。
[0003] LGMD的發病年齡可以差別很大，從幼兒到50歲均有發病，男女均可患病。首發癥 狀常為骨盆帶及肩胛帶肌肉萎縮，腰椎前凸，運動困難；膝腱反射比踝反射早消失；抬臂困 難，出現翼狀肩胛：頭面頸部肌肉一般不受累，有時可伴腓腸肌假性肥大；病情進展緩慢， 平均于發病后20年左右喪失行動能力；肌電圖和肌肉活檢均顯示肌原性損害，肌酸激酶 CK、乳酸脫氫酶LDH等血清肌酶常顯著增高，但通常低于DMD型的水平，心電圖正常。正是 由于LGMD的表征十分多變，且有的表征與其他肌肉疾病類似，LGMD的發病率很難統計。普 遍認為，LGMD的發病率大致在1/14500和1/123000之間。
[0004] 在1995年由歐洲神經肌肉病中心工作組根據遺傳方式將LGMD分為1型（常染 色體顯性遺傳）和2型（常染色體隱性遺傳），之后由根據不同的基因缺陷分出許多亞型。 截止至2012年，已知的共有25個亞型，其中1型有8個亞型（1A-1H)，2型有17個亞型 (2A-2Q)。LGMD是一組遺傳模式和臨床癥狀具高度異質性的常染色體連鎖遺傳性肌營養不 良，已知涉及到的基因至少有50個。這些位點有些也與心臟有關，包括肌聚糖蛋白、小窩蛋 白3、核纖層蛋白A/C和幾種肌節蛋白。
[0005] 由此，肢帶型肌營養不良癥的早期診斷有待于進一步研究。

【發明內容】

[0006] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發明的一個目的 在于提出一種有效篩選肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的方法。
[0007] 需要說明的是，本發明是基于發明人的下列工作而完成的：
[0008] P0PDC1蛋白功能復雜多樣，能與許多其他蛋白相互作用，如雙孔鉀離子通道蛋白 TREK-1、小窩蛋白3等。P0PDC1在骨骼肌、平滑肌和心肌中皆為高表達；在心臟傳導系統的 心肌細胞中，其表達量尤為突出。發明人認為從蛋白功能角度考慮，基因P0PDC1很可能與 肢帶型肌營養不良癥有關
[0009] 發明人利用特制的DNA序列探針將全基因組中的外顯子區域捕獲下來，然后針 對每個外顯子進行深度測序。并在目標區域測序找到了 P0PDC1基因c. 602C>T突變和 c. 515G>A突變，這兩個突變位點分別引起相應多肽的p. S201F突變和p. R172H突變，上述突 變均與肢帶型肌營養不良癥有關。
[0010] 因而，根據本發明的第一方面，本發明提供了一種分離的編碼P0PDC1突變體的核 酸。根據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0:1相比，具有c. 602C>T突變、c. 515G>A 突變、c. 385C>T突變和c. 427A>G突變的至少之一。在本發明中，采用本領域通用表示法表 示突變。c. 602C>T表示cDNA第602位核苷酸由C變成T ;c. 515G>A表示cDNA第515位核 苷酸由G變成A ;c. 385C>T表示cDNA第385位核苷酸由C變成T ;c. 427A>G表示cDNA第 427位核苷酸由A變成G。發明人驚奇的發現，該突變體與肢帶型肌營養不良癥的發病密切 相關，從而通過檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患 肢帶型肌營養不良癥，根據本發明的實施例，該突變體的核酸進一步豐富了 P0PDC1基因的 致病突變圖譜，更深入闡明了肢帶型肌營養不良癥的分子發病機制，為肢帶型肌營養不良 癥的早期致病基因篩查和干預治療提供科學依據。
[0011] 根據本發明的第二方面，本發明還提供了一種分離的多肽。根據本發明的實施例， 與SEQ ID N0:4相比，所述分離的多肽具有p. S201F突變、p. R172H突變、p. R129W突變和 P.R143G突變的至少之一。在本發明中，采用本領域通用表示法表示突變。p. S201F表示 蛋白質水平第201位密碼子由絲氨酸變成苯丙氨酸；P.R172H表示蛋白質水平第154位密 碼子由精氨酸變成組氨酸；P. R129W表示蛋白質水平第129位密碼子由精氨酸變成色氨酸； р. R143G表示蛋白質水平第143位密碼子由精氨酸變成甘氨酸。具體地，致病基因P0PDC1 上c. 602C>T突變，引起多肽p. S201F突變；c. 515G>A突變，導致p. R172H突變；c. 385C>T突 變，引起p. R129W突變；以及c. 427A>G突變，導致p. R143G突變。通過檢測生物樣品中是否 表達該多肽，可以有效地檢測生物樣品是否易患肢帶型肌營養不良癥。
[0012] 根據本發明的第三方面，本發明還提供了一種篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生 物樣品的系統。該系統包括：核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品中的 核酸樣本；核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所 述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；以及判斷裝置，所述判斷裝置與 所述核酸序列確定裝置相連，以便基于將所述核酸的序列與SEQ ID N0 :1相比，是否具有 с. 602C>T突變和c. 515G>A突變之一，判斷所述生物樣品是否易患肢帶型肌營養不良癥。發 明人驚奇地發現，利用該系統可以對肢帶型肌營養不良癥進行基因層面的檢測，有助于更 準確的篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品。
[0013] 根據本發明的第四方面，本發明還提供了一種用于篩選易患肢帶型肌營養不良癥 的生物樣品的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒含有：適于檢測P0PDC1基因突變體 的試劑，其中與SEQ ID N0 :1相比，所述P0PDC1基因突變體具有c. 602C>T突變和c. 515G>A 突變的至少之一。由此，利用該試劑盒，可以對P0PDC1基因突變體進行高精度的檢測，從而 對肢帶型肌營養不良癥進行基因層面的檢測，有助于更準確的篩選易患肢帶型肌營養不良 癥的生物樣品。
[0014] 根據本發明的第五方面，本發明還提供了一種構建體。根據本發明的實施例，該構 建體包含前述的分離的編碼P0PDC1突變體的核酸。由此，利用本發明的構建體轉化受體細 胞獲得的重組細胞，能夠有效地用于篩選治療肢帶型肌營養不良癥的藥物。
[0015] 根據本發明的第六方面，本發明還提供了一種重組細胞。根據本發明的實施例，該 重組細胞是通過表達前述的構建體轉化受體細胞而獲得的。根據本發明的一些實施例，利 用本發明的重組細胞，能夠有效地篩選治療肢帶型肌營養不良癥的藥物。
[0016] 根據本發明的第七方面，本發明還提供了一種構建藥物篩選模型的方法。根據本 發明的實施例，該方法包括：使動物的至少一部分細胞表達前述的多肽。根據本發明的一些 實施例，利用本發明的動物模型，能夠有效地篩選治療肢帶型肌營養不良癥的藥物。
[0017] 本發明的附加方面和優點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發明的實踐了解到。
【附圖說明】
[0018] 本發明的上述和/或附加的方面和優點從結合下面附圖對實施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中：
[0019] 圖1顯示了根據本發明實施例的篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的系 統及其組成部分的示意圖，其中，
[0020] 圖1A為根據本發明實施例的篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的系統的 示意圖，
[0021] 圖1B為根據本發明實施例的核酸提取裝置的示意圖，
[0022] 圖1C為根據本發明實施例的核酸序列確定裝置的示意圖；
[0023] 圖2顯示了根據本發明實施例的4個家系的家系圖；
[0024] 圖3顯示了根據本發明實施例的P0PDC1的突變體與心肌蛋白功能的關系，其中
[0025] 圖3A為根據本發明實施例的利用蛋白印跡法定量檢測cAMP結合親和力的結果示 意圖；
[0026] 圖3B為根據本發明實施例的293A細胞轉染YFP-TREK-1與Popdcl-CFP(WT)或 S201F-CFP(201F)，采用異丙腎上腺素治療后FRET信號的相對變化示意圖；
[0027] 圖3C為根據本發明實施例的TREK-1單獨或共表達P0PDC1-WT的后，TREK-1/ Popdcl比分別為5 :1和1 :5的比例時，相對電流振幅示意圖；
[0028] 圖3D為根據本發明實施例的爪蟾卵母細胞中單獨注射TREK-lcRNA，以及 TREK-lcRNA 分別與 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W 和 R143G cRNA 的混合物 48h 后的電壓 關系不意圖；
[0029] 圖3E為根據本發明實施例的爪蟾卵母細胞中單獨注射TREK-lcRNA，以及 TREK-lcRNA 分別與 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W 和 R143G cRNA 的混合物 48h 后的相對 電流示意圖；
[0030] 圖3F為根據本發明實施例的卵母細胞在磷酸二酯酶抑制劑茶堿 (phosphodiesterase inhibitor theophylline)中培養 48h，TREK-1 電流振幅分析在 OmV 的條件下，在與P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143G的共表達條件下，各卵母細胞的 相對電流示意圖；
[0031] 圖3G為根據本發明實施例的轉染到Cos-7細胞后的突變及P0PDC1-WT正常蛋白 分布的焚光顯微圖片，
[0032] 圖4顯示了根據本發明實施例的P0PDC1基因的結構圖及預測的二級結構和三級 結構的示意圖，
[0033] 其中，
[0034] 圖4A為根據本發明實施例的Popeye結構域蛋白的基本結構示意圖；
[0035] 圖4B為根據本發明實施例的預測的P0PDC1蛋白的Popeye結構域二級結構示意 圖；
[0036] 圖4C為根據本發明實施例的Popeye結構域的多序列比對的結構示意圖；
[0037] 圖4D為根據本發明實施例的Popeye結構域接線圖；
[0038] 圖4E為根據本發明實施例的Popeye結構域結構模型示意圖。
【具體實施方式】
[0039] 下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實施例是示例性的，僅用于解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
[0040] P0PDC1 突變體
[0041] 根據本發明的第一方面，本發明提供了一種分離的編碼P0PDC1突變體的核酸。根 據本發明的實施例，所述核酸與SEQ ID N0 :1相比，具有c. 602C>T突變、c. 515G>A突變、 c. 385C>T突變和c. 427A>G突變的至少之一。
[0042] 在本文中所使用的表達方式"編碼P0PDC1突變體的核酸"，是指與編碼P0PDC1突 變體的基因相對應的核酸物質，即核酸的類型不受特別限制，可以是任何包含與P0PDC1突 變體的編碼基因相對應的脫氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、 RNA或cDNA。根據本發明的一些具體示例，所述核酸為DNA。
[0043] 對于本發明說明書和權利要求書中所提及的核酸，本領域技術人員應當理解，實 際包括互補雙鏈的任意一條，或者兩條。為了方便，在本說明書和權利要求書中，雖然多數 情況下只給出了一條鏈，但實際上也公開了與之互補的另一條鏈。例如，提及SEQ ID N0: 1，實際包括其互補序列。本領域技術人員還可以理解，利用一條鏈可以檢測另一條鏈，反之 亦然。
[0044] 本申請中的基因序列包括DNA形式或RNA形式，公開其中一種，意味著另一種也被 公開。例如提及P0PDC1基因的cDNA序列，實際也包括相應的RNA序列。
[0045] 該編碼P0PDC1突變體的核酸，是本申請的發明人通過目標區域捕獲測序聯合候 選基因突變驗證的方法確定的肢帶型肌營養不良癥的致病基因P0PDC1的新的致病突變。 該致病突變位點在現有技術中并未被提到。需要說明的是，在本文中所使用的表達方式"目 標區域捕獲測序"是指利用特制的探針對客戶感興趣的某段特定序列進行捕獲富集后，再 利用第二代測序技術進行高通量測序及基因組分析的方法。利用該方法能夠獲得指定目標 區域的遺傳信息，極大的提高了基因組中目標區域的研究效率，顯著降低了研究成本。在本 發明中，將該方法用于識別和研究與疾病相關的編碼區域內的結構變異，進而，結合大量的 公共數據庫提供的數據，有利于更好地解釋所得變異結構之間的關聯和致病機理。
[0046] 其中，野生型的P0PDC1的cDNA的序列如下所示：

[0048] 本發明的發生c. 602C>T突變的P0PDC1突變體的cDNA序列如下所示，突變位點加 框示出：
[0050] 發生c. 515G>A變異的P0PDC1的cDNA序列如下，其中突變堿基加框示出：

TCAGCTGCCTTGA(SEQ ID N0:5,1083nt)
[0057] 發明人驚奇的發現，該突變體與肢帶型肌營養不良癥的發病密切相關，從而通過 檢測該突變體在生物樣品中是否存在，可以有效地檢測生物樣品是否易患肢帶型肌營養不 良癥，根據本發明的實施例，該突變體的核酸進一步豐富了 P0PDC1基因的致病突變圖譜， 并且更深入地闡明了肢帶型肌營養不良癥的分子發病機制，為肢帶型肌營養不良癥的早期 致病基因篩查和干預治療提供科學依據。
[0058] 根據本發明的第二方面，本發明還提供了一種分離的多肽。根據本發明的實施例， 與SEQ ID N0:4相比，所述分離的多肽具有p. S201F突變、p. R172H突變、p. R129W突變和 p. R143G突變的至少之一。具體地，致病基因P0PDC1上c. 602C>T三堿基缺失，引起多肽 р. S201F突變，而c. 515G>A突變，導致p. R172H突變，c. 385C>T突變，導致p. R129W突變， с. 427A>G突變，導致p. R143G突變。通過檢測生物樣品中是否表達該多肽，可以有效地檢測 生物樣品是否易患肢帶型肌營養不良癥。
[0059] 根據本發明的一些具體示例，所述多肽由權利要求1所述的核酸編碼。其中，野生 型的P0PDC1的cDNA編碼的多肽的氨基酸序列如下：
個氨基酸）[0061] 發生c. 602C>T突變的P0PDC1突變體的氨基酸序列如下： r ) )
個氨基酸）
[0063] 發生c. 515G>A突變的P0PDC1突變體的氨基酸序列如下，其中突變氨基酸加框示 出：
N0:16, 360個氨基酸）
[0065] 發生c. 385C>T突變的P0PDC1突變體的氨基酸序列如下，其中突變氨基酸加框示 出：

360個氨基酸）
[0067] 發生c. 427A>G突變的P0PDC1突變體的氨基酸序列如下，其中突變氨基酸加框示
[0068] 通過比對發現，與SEQ ID N0:1相比，發生c. 602C>T突變的P0PDC1突變體的cDNA 具有c. 602C>T突變，進而，其編碼產物與野生型的P0PDC1多肽的氨基酸序列相比，具有 p. S201F突變，即Ser突變為Phe;與SEQ ID N0:1相比，發生c. 515G>A突變的P0PDC1突 變體的cDNA具有c. 515G>A突變，進而，其編碼產物與野生型的P0PDC1多肽的氨基酸序列 相比，具有p. R172H突變，即Arg突變為His;與SEQ ID N0:1相比，發生c. 385C>T突變的 P0PDC1突變體的cDNA具有c. 385C>T突變，進而，其編碼產物與野生型的P0PDC1多肽的氨 基酸序列相比，具有P. R129W突變，即Arg突變為Trp;與SEQ ID N0:1相比，發生c. 427A>G 突變的P0PDC1突變體的cDNA具有c. 427A>G突變，進而，其編碼產物與野生型的P0PDC1多 肽的氨基酸序列相比，具有P. R143G突變，即Arg突變為Gly。綜上，上述兩種突變均可引起 肢帶型肌營養不良癥。
[0069] 此外，需要說明的是，本發明的檢測突變P0PDC1基因或蛋白的方法也可以用于非 診斷疾病的目的。所述的非檢測疾病的目的包括但不限于研究SNP分布和多態性，用于家 族演化研究。本發明可以對肢帶型肌營養不良癥的發病機理提供重要線索，對肢帶型肌營 養不良癥的診斷治療具有十分重要的意義。這樣的應用也是本領域技術人員可以理解的。
[0070] 需要指出的是，有些個體攜帶本發明所述的P0PDC1基因突變體中p. S201F突變， 但不患肢帶型肌營養不良癥，例如僅一條染色體攜帶突變的雜合基因型。對這部分人群的 檢測可以任何不涉及診斷疾病的目的，因為這些個體并不患病。但對于他們進行檢測的結 果可以作為例如有用信息使用，例如作為育前檢查的重要指標，指導生育，或者用于突變攜 帶者篩查，或者作為SNP分布和多態性研究的工具或者追蹤基因突變或家族演化。
[0071] 篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的系統和試劑盒
[0072] 根據本發明的第三方面，本發明提供了一種篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物 樣品的系統。參照圖1A，該系統包括：
[0073] 核酸提取裝置100,所述核酸提取裝置100用于提取所述生物樣品中的核酸樣本。 根據本發明的一些具體示例，所述核酸提取裝置1〇〇進一步包括：RNA提取單元101，所述 RNA提取單元101用于從生物樣品中提取RNA樣本；以及逆轉錄單元102,所述逆轉錄單元 102與所述RNA提取單元101相連，用于對所述RNA樣本進行逆轉錄反應，以便獲得cDNA樣 本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。
[0074] 核酸序列確定裝置200,所述核酸序列確定裝置200與所述核酸提取裝置100相 連，用于對所述核酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列。根據發明的具體示 例，所述核酸序列確定裝置進一步包括：文庫構建單元201，所述文庫構建單元201用于針 對所述核酸樣本，構建所述核酸的文庫；以及測序單元202,所述測序單元202與所述文庫 構建單元201相連，通過對所述文庫進行測序，以便確定所述核酸的序列。其中，所述文庫 構建單元201進一步包括：PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有P0PDC1基因外顯子 特異性引物，以便利用所述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增。根據本發明的實施 例，所述特異性引物至少包括以下引物對之一：第一引物對，具有SEQ ID N0 :7和8所示的 核苷酸序列，用于擴增c. 602C>T突變位點；第二引物對，具有SEQ ID N0 :9和10所示的核 苷酸序列，用于擴增c. 515G>A突變位點，第三引物對，具有SEQ ID N0 :11和12所示的核苷 酸序列，用于擴增c. 385C>T突變位點，第四引物對，具有SEQ ID N0 :13和14所示的核苷酸 序列，用于擴增c. 427A>G突變位點。根據本發明的一些具體示例，所述測序單元包括選自 HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一種。
[0075] 判斷裝置300,所述判斷裝置300與所述核酸序列確定裝置200相連，以便基于將 所述核酸的序列與SEQ ID N0:1相比，是否具有C.602OT突變和c. 515G>A突變之一，判斷 所述生物樣品是否易患肢帶型肌營養不良癥。
[0076] 其中，需要說明的是，本發明中所使用的表達方式"易患肢帶型肌營養不良癥的生 物樣品"，即包含患有肢帶型肌營養不良癥的生物樣品，也包括肢帶型肌營養不良癥突變基 因攜帶者的生物樣品。
[0077] 發明人驚奇地發現，利用該系統可以對肢帶型肌營養不良癥進行基因層面的檢 測，有助于更準確的篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品。
[0078] 根據本發明的第四方面，本發明提供了一種用于篩選易患肢帶型肌營養不良癥 的生物樣品的試劑盒。根據本發明的實施例，該試劑盒含有：適于檢測P0PDC1基因突變 體的試劑，其中與SEQ ID N0:1相比，所述P0PDC1基因突變體具有具有C.602OT突變和 c. 515G>A突變的至少之一。
[0079] 在發明中，所使用的術語"適于檢測P0PDC1基因突變體的試劑"應做廣義理解，即 可以是檢測P0PDC1編碼基因的試劑，也可以是檢測P0PDC1突變體多肽的試劑，例如可以采 用識別特異性位點的抗體。根據本發明的一些具體示例，所述試劑為核酸探針或引物。由 此，能夠特異性的檢測P0PDC1基因。優選地，所述核酸探針或者引物包括以下至少之一：第 一核酸探針或者引物對，具有SEQ ID N0 :7和8所示的核苷酸序列，用于擴增c. 602C>T突 變位點；第二核酸探針或者引物對，具有SEQ ID N0 :9和10所示的核苷酸序列，用于擴增 c. 515G>A突變位點，第三核酸探針或者引物對，具有SEQ ID N0 :11和12所示的核苷酸序 列，用于擴增c. 385C>T突變位點，第四核酸探針或者引物對，具有SEQ ID N0 :13和14所示 的核苷酸序列，用于擴增c. 427A>G突變位點。由此，對P0PDC1基因檢測的特異性好，準確 性尚。
[0080] 由此，利用該試劑盒，可以對P0PDC1基因突變體進行高精度的檢測，從而對肢帶 型肌營養不良癥進行基因層面的檢測，有助于更準確的篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生 物樣品。
[0081] 構建體和重組細胞
[0082] 根據本發明的第五方面，本發明提供了一種構建體。根據本發明的實施例，該構建 體包含前述的分離的編碼P0PDC1突變體的核酸。由此，利用本發明的構建體轉化受體細胞 獲得的重組細胞，能夠有效地用于篩選治療肢帶型肌營養不良癥的藥物。
[0083] 在本發明中所使用的術語"構建體"是指這樣的一種遺傳載體，其包含特定核酸序 列，并且能夠將目的核酸序列轉入宿主細胞中，以獲得重組細胞。根據本發明的實施例，構 建體的形式不受特別限制。根據本發明的實施例，其可以為質粒、噬菌體、人工染色體、粘粒 (Cosmid)、病毒的至少一種，優選質粒。質粒作為遺傳載體，具有操作簡單，可以攜帶較大片 段的性質，便于操作和處理。質粒的形式也不受特別限制，既可以是環形質粒，也可以是線 性質粒，即可以是單鏈的，也可以是雙鏈的。本領域技術人員可以根據需要進行選擇。在本 發明中所使用的術語"核酸"可以是任何包含脫氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包 括但不限于經過修飾的或者未經修飾的DNA、RNA，其長度不受任何特別限制。對于用于構 建重組細胞的構建體，優選所述核酸為DNA，因為DNA相對于RNA而言，其更穩定，并且易于 操作。
[0084] 根據本發明的第六方面，本發明還提供了一種重組細胞，根據本發明的實施例，所 述重組細胞是通過表達前述的構建體轉化受體細胞而獲得的。根據本發明的一些實施例， 利用本發明的重組細胞，能夠有效地篩選治療肢帶型肌營養不良癥的藥物。
[0085] 構建藥物篩選模型的方法
[0086] 根據本發明的第七方面，本發明還提供了一種構建藥物篩選模型的方法。根據本 發明的實施例，該方法包括：使動物的至少一部分細胞表達前述的多肽。根據本發明的實施 例，所述動物為小鼠、豬、狗、靈長類動物。根據本發明的一些實施例，利用本發明的動物模 型，能夠有效地篩選治療肢帶型肌營養不良癥的藥物。
[0087] 其中，需要說明的是，本發明構建藥物篩選模型的方法不受特別的限制，只要使動 物的至少一部分細胞表達前述的多肽即可。例如，采用分子生物學技術，對受體細胞產生 精確的目標基因定點突變，獲得患有肢帶型肌營養不良癥的動物，該動物可以作為模型用 于篩選治療該疾病的藥物。例如，可以通過無標記轉基因技術，定點整合技術，基因組編輯 技術等方法實現目標基因的定點突變，獲得本發明的編碼P0PDC1突變體的基因，進而構建 P0PDC1突變體基因的重組載體，將該重組載體通過一定的方式（常用電穿孔法）導入同源 的胚胎干細胞中，使突變的外源DNA與胚胎干細胞基因組中相應部分發生同源重組，將重 組載體中的DNA序列整合到內源基因組中，從而P0PDC1突變體基因在細胞中得以表達。再 將重組細胞植入假孕母體，使其發育成嵌合體動物。利用嵌合體之間的交配，產生純合體動 物，嵌合體動物和純化體動物均可用于藥物篩選模型，從而有效地篩選治療肢帶型肌營養 不良癥的藥物。
[0088] 本發明至少具有以下有益效果：
[0089] (1)本發明發現了 LGMD相關基因的4個新的突變位點，對該基因位點的檢測可以 用于LGMD患者的輔助診斷，并且可進一步應用于LGMD患者的分子診斷。因此，本發明的檢 測突變P0PDC1基因或蛋白的方法可以可用于早期篩查肢帶型肌營養不良癥致病突變攜帶 者，進而在攜帶者發病之前進行早期干預治療。該技術具有快速、準確、高效、簡便、早期診 斷率高等優點。
[0090] (2)本發明可以對LGMD的發病機理提供重要線索，對LGMD的診斷治療具有十分重 要的意義。
[0091] (3)本發明發現的P0PDC1基因可以作為SNP分布和多態性研究的工具或者追蹤基 因突變或家族演化。
[0092] 下面參考具體實施例，對本發明進行說明，需要說明的是，這些實施例僅僅是說明 性的，而不能理解為對本發明的限制。
[0093] 下面將結合實施例對本發明的方案進行解釋。本領域技術人員將會理解，下面的 實施例僅用于說明本發明，而不應視為限定本發明的范圍。實施例中未注明具體技術或條 件的，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件（例如參考J.薩姆布魯克等著，黃培堂等 譯的《分子克隆實驗指南》，第三版，科學出版社）或者按照產品說明書進行。所用試劑或 儀器未注明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品，例如可以采購自Illumina公 司。
[0094] 實施例1
[0095] 確定肢帶型肌營養不良癥突變基因的方法，具體如下：
[0096] 1、樣本采集
[0097] 本實施例收集了不同地區的4個家系的樣本，每個家系中均有肢帶型肌營養不良 癥患者。其中，家系中的患者信息如下：
[0098] -號家系，家系圖如圖2A所示，該家系是意大利南部卡拉布里亞地區的一個家 系，該家系表現為偽顯性遺傳，該家庭源于一個有大概3000人口的阿爾巴尼亞飛地的小鎮 上。祖父為患者，他有2個表型正常的兄弟和7姐妹；其中一個的姐妹的兩個外孫有類似的 癥狀，其父母雙方均認定并非近親結婚。其中，患者的具體情況如下
[0099] I 1患者，祖父患有類似Emery-Dreifuss肌營養不良癥的肢帶型肌營養不良癥， 同時伴有房室傳導阻滯，現年80歲。他40歲時，開始出現一些下肢帶虛弱；60歲時，喪失 獨立行走的能力，檢測發現血液肌酸激酶（CK)濃度升高（750-1300IU/L)，左三角肌活檢發 現有肌肉萎縮癥病變，如直徑變化、中央核增加，纖維極少壞死更新；用免疫組化法檢測肌 營養不良蛋白、肌糖、伊默菌素、分區蛋白、小窩蛋白3,結果顯示為正常；69歲時，開始出現 經常性昏厥，并發現有第二度房室傳導阻滯；70歲時，檢測發現CK濃度在600U/L，安裝了 心臟起搏器，超聲心動圖結果排除了患有心肌癥的可能；72歲時，肌力測試顯示：頸部屈肌 MRC評分為5,腰大肌MRC評分右側為3. 5、左側為4,四頭肌MRC評分為2,臀肌MRC評分為 1，腓腸肌MRC評分為5,足背屈肌MRC評分為5。
[0100] III 2患者，患有輕度心肌癥，并伴有嚴重房室傳導阻滯，12歲時安裝了心臟起搏 器，無肌肉病變征兆，但CK濃度在3000UI/L。在12歲時出現昏厥以及頌面創傷，當時經過 長時間運動后CK濃度達7643IU/L，休息時為3183IU/L ;住院治療期間，心電圖記錄到了二 度房室傳導阻滯（Mobitz 1)的初次發作和經常性發作。平視式傾斜測試顯示竇性心動過 緩和交界性逸搏性心律，無昏厥或昏厥發生前癥狀。超聲波心動圖結果正常，排除了心肌病 的可能。心內心電圖記錄到了正常的HV間期（30s)，在心房起搏周小于600ms時，結下AV 傳導阻滯提前。從那以后，Pt2植入了 VVI心內膜起搏器。肌肉活檢結果正常，最近一次肌 力測試是在19歲的時候，排除骨骼肌的參與。目前，這名患者正在接受定期檢查，沒有再發 生昏厥或其他癥狀了。
[0101] III 1患者，患有輕度心肌癥，并伴有嚴重房室傳導阻滯，17歲時安裝了心臟起搏 器，無肌肉病變征兆，但CK濃度在3000UI/L。在17歲時出現昏厥，CK濃度上升到1216IU/ L。當時的心電圖顯示在希式束下部有二度房室傳導阻滯，心室內傳導無異常；超聲心動圖 結果正常。肌力測試正常，最近一次肌力測試是在25歲，結果正常。
[0102] 二號家系，家系圖如圖2B所示，起源于德國，患者II 2參與該研究時有80歲，二戰 后期作為難民進入德國魯爾區，未表現出明顯的肌肉或神經系統疾病的跡象。
[0103] 三號家系，家系圖如圖2C所示，來自中國，患者II 1父母表型正常，妊娠及分娩過 程均正常。在約1歲時該患者表現出進食及呼吸困難，幾天后患者出現長期暈厥，心電圖和 超聲心動圖顯示心房撲動伴有完全的房室傳導阻滯及嚴重的左心室擴張，隨后展開抗充血 性藥物治療及植入心外膜雙腔起搏器。進一步檢查排除代謝性疾病。一個月后患者出院， 隨訪期間，左心功能不全得到改善，心臟節律由起搏器及藥物控制。患者現在5歲，為表現 出肌肉疾病癥狀。
[0104] 四號家系，家系圖如圖2D所述，來自意大利，患者II 2,68歲，30歲時表現出步態困 難及小腿肥大，57歲時患者表現出不行及上樓梯困難。住院后診斷顯示雙上肢及下肢腰帶 的近端肌肉無力，肌肉活檢顯示核集中及典型的營養不良現象。患者血清肌酸激酶正常，肌 電圖呈彌漫性疾病模式，感覺誘發電位正常。問及家族史時，患者提到其母親（70歲時由于 心臟節律紊亂死亡）曾有心臟病發生史。
[0105] 樣本來源如下：
[0107] 上述患者均具有LGMD特征。由于目前LGMD的發病機理和遺傳方式尚不清楚，發 明人利用 NimbleGen 序列捕獲技術（SeqCap EZ library)結合 HiSeq2000(Illumina, San Diego, CA)高通量測序技術，以一號家庭為例，對一號家系中的患者III 1和III 2及其父母 II 5、II 6 (兩個患病的兄弟和他們的表型正常的父母）進行了全外顯子測序。
[0108] 2、樣品制備
[0109] 采集的上述家系患者及正常人的樣本（2個患者樣本，即III 1和III 2,以及2個正常 樣本，即II 5和II 6)的外周血，根據世界醫學會《赫爾辛基宣言》的要求，研究中所有患者 及正常人均與BGI合作機構意大利分子神經遺傳學研究所倫理委員會簽署了知情同意書。 利用常規酚-氯仿法抽提外周血白細胞中的基因組DNA，利用分光光度計測量DNA的濃度及 純度，所得的每個樣本基因組DNA的0D260/0D280均位于1. 7-2. 0之間，濃度不少于200ng/ y 1，總量不少于30 y g。所有血樣均簽屬知情同意書，并獲得倫理委員會批準。
[0110] 3、芯片設計、文庫構建和高通量測序
[0111] 用 NimbleGen 44M kit (SeqCap EZ Human Exome Library v2. 0)結合 IIlumina HiSeq 2000高通量測序技術對上述5個患者及兩個正常人的外顯子組序列進行了測序，具 體如下：
[0112] 1)利用捕獲芯片NimbleGen 44M kit (SeqCap EZ Human Exome Library v2. 0)對 基因組的外顯子、剪接位點和鄰近的內含子序列進行捕獲。
[0113] 2)將基因組DNA隨機打斷成100-200bp左右的片段，隨后在片段兩端分別連接上 接頭，制備測序文庫（參見//www. illumina. com/提供的Illumina/Solexa標準建庫 說明書）。
[0114] 3)文庫經純化后經過ligation-mediated PCR(LM-PCR)的線性擴增與custom capture array進行雜交富集，再經過LM-PCR的線性擴增后進行上機測序測序平臺為 IlluminaHiseq 2000,讀取長度為90bp，雙端測序。
[0115] 3、變異檢測、注釋及與數據庫比較
[0116] 1)測序后獲得的原始數據由Illumina base calling Software 1. 7進行處 理。然后過濾低質量讀段和包含接頭污染讀段。使用S0APaligner/S0AP2(可參見： Li R，Li Y，Kristiansen K，et al，SOAP:short oligonucleotide alignment program. Bioinformatics 2008, 24(5):713-714 ；Li R, Yu C, Li Y, et al.,S0AP2:an improved ultrafast tool for short read alignment. Bioinformatics 2009,25(15):1966-1967.， 通過參照將其全文并入本文）比對到參考基因組Hgl9(snpl32)，以便獲得比對到基 因組上的唯一比對序列。然后利用SOAPsnp(可參見：Li R，Li Y，Fang X，Yang H，et al，SNP detection for massively parallel whole-genome resequencing. Genome Res 2009, 19(6) :1124-1132.，通過參照將其全文并入本文）確定靶區域的基因型D
[0117] 2)對于檢出的SNP和indel變異，本實施例中采用BWA(version 0? 7. 5)(可參 見 Li H，Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-ffhee1er transform. Bioinformatics2010;26 (5): 589-595)和 GATK(version2.8_l)(可參見 DePristo MA，Banks E，Poplin R，et al. A framework for variation discovery and genotyping using next-generation DNA sequencing data. Nat Genet 2011 ;43:491_8.， 通過參照將其全文并入本文）確定indel的類型。
[0118] 同時，關注非同義突變，剪接受體/供體位點突變和編碼區插入和缺失突變這三 類最有可能與疾病相關的突變。將檢出的變異和dbSNP135數據庫、千人基因組數據庫和 HapMap數據庫，YH數據庫等公共數據庫）等公共數據庫和CAG數據庫進行了比較，保留了 低頻的變異（MAF < 0. 005)。
[0119] 3)在一號家系中，該疾病為隱性遺傳模式，且雙親來自同一個非常小的城鎮，可能 存在類似近親結婚的情況，故優先考慮純和突變位點。去掉同義突變，將剩下的非同義/剪 接位點突變和微小插入缺失進行優先選擇：最后剩下4個SNPs和1個Indel位點為可能 的致病突變。然而，經過 SIFT (//sift.bii. a-star. edu. sg)、Pmut (//mmb. pcb. ub. es/PMut)和 Polyphen2 (//genetics, bwh. harvard. edu/pph2)軟件進行突變位點 危害性預測后發現，僅一個純和錯義突變P0PDC1基因c. 602C>T，p. S201F被預測為有害突 變。
[0120] 在二、三、四號家系中，發明人利用上述方法，又分別在三個家系的三個患者中 發現了該基因上的另外三個雜合突變位點（c. 515G>A，p. R172H ;c. 385C>T，p. R129W ; c. 427A>G，p. R143G)。
[0121] 綜上所述，發明人認為本實施例中的P0PDC1基因的突變位點，極可能是LGMD (肢 帶型肌營養不良癥）的致病變異位點。
[0122] 實施例2
[0123] 由于外顯子組測序存在一定程度的假陽性，本實施例利用Sanger測序方法，對實 施例1中的4個家系中發現的P0PDC1基因的突變位點進行驗證，具體方法如下：
[0124] 利用實施例1中4個家系，采用Sanger法對肢帶型肌營養不良癥致病突變位點進 行驗證，包括針對P0PDC1基因3號和4號外顯子及其周圍的序列設計引物，通過PCR擴增、 產物純化、測序的方法獲得P0PDC1基因有關序列，并根據序列測定結果屬于突變型還是野 生型，驗證P0PDC1與患者臨床表型之間的相關性。具體步驟如下：
[0125] 1、DNA 提取
[0126] 采集的一號家系兩個患者兄弟及其父母和祖父、二號家庭的患者II 2、三號家庭的 患者II 1以及四號家庭的患者II 2的外周靜脈血，另采集無親緣關系的107個患有肌營養 不良癥和/或心臟疾病患者的外周靜脈血，根據世界醫學會《赫爾辛基宣言》的要求，參與 本研究的患者均與BGI合作機構意大利分子神經遺傳學研究所倫理委員會簽署了知情同 意書。利用常規酚-氯仿法抽提外周血白細胞中的基因組DNA，利用分光光度計測量DNA的 濃度及純度，所得的每個樣本基因組DNA的0D260/0D280均位于1. 7-2. 0之間，濃度不少于 200ng/ y 1，總量不少于6 y g。
[0127] 2、引物設計及PCR反應
[0128] 參考人類基因組序列數據庫GRCh37/hgl9設計P0PDC1基因外顯子特異性引物，具 體見下。
[0129] a)引物序列：
[0130]
[0131] b)反應體系：25yL
[0132] 模板 DNA lOOng Tris-HCl (pH8.4,20mM) lj.il 1<(：丨溶液（5〇1池1) 0.5 ul MgCh溶液（l.5mM) 1.25ul dNTP (0.2mM) 0.5 pi Taq fe (invhrogc'rt) ：5U 上游引物（100 ng/pL ) 0.4pL K游'j|物（lOOng/jiL) 0.4uL
[0133] dH20 加至 25 u L
[0134] c)反應條件：
[0135] 94°C，5 分鐘，一個循環；94°C，45 秒；60°C，45 秒；72°C，45 秒，35 個循環；72°C，5 分鐘，一個循環。
[0136] 由此，獲得患者和家系內正常人的PCR擴增產物。
[0137] 3)將步驟2中獲得PCR擴增產物純化后用ABI Prism 3130XL進行DNA測序。
[0138] Sanger測序的結果驗證了 S201F的SNP突變位點確定了其以雜合的形式存在于1 號家系的兩個表型正常的父母中，且以純和的形式存在于1號家系的兩個患者兄弟和其祖 父體內。二、三、四號三個家系的三個患者中三個突變位點（c. 515G>A，p.R172H;c. 385C>T， р. R129W ;c. 427A>G，p. R143G)均為雜合突變，并且突變所在的區域為保守區域。
[0139] 發明人認為P0PDC1蛋白與心臟病變相關，并進行以下實驗進行驗證，對實驗結果 進行P檢驗，其ns表示無顯著差異，*代表p〈0. 05, **代表p〈0. 01，#*代表p〈0. 001。利用 蛋白印跡法定量檢測cAMP結合親和力，結果如圖3A所示，變異S201F表現出cAMP結合親和 力顯著降低；采用293A細胞轉染YFP-TREK-1與Popdcl-CFP(WT)或S201F-CFP(201F)，并檢 測采用異丙腎上腺素治療后FRET信號的相對變化，結果如圖3B所示，同樣觀察到了 S201F 突變體cAMP敏感性的降低。利用TREK-1單獨或共表達的P0PDC1-WT，以TREK-1/Popdcl 比分別為5 :1和1 :5的檢測相對電流振幅，結果如圖3C所示，結果顯示TREK-1外向電流 升高:僅相對于TREK-lp〈0. 001);在爪蟾卵母細胞中被單獨注射TREK-lcRNA，以及 TREK-lcRNA 分別與 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W 和 R143G cRNA 的混合物后，48h 的電壓 關系如圖3D所示，由圖中可看出突變S201F以及R127H引起的TREK-1外向電流升高比野生 型與R143G、R129W突變一起的TREK-1外向電流升高要顯著，相對的電流振幅如圖3E所示 (*:p〈0. 05, ***:p〈0. 001);當爪蟾卵母細胞在磷酸二酯酶抑制劑茶堿（phosphodiesterase inhibitor theophylline)中培養48h后，在TREK-1電流振幅在OmV的條件下，分別在與 P0PDC1-WT、S201F、R172H、R129W和R143G的共表達后，檢測共表達細胞的相對電位，結果如 圖3F所示，電位出現顯著降低；轉染到Cos-7細胞后的突變及P0PDC1-WT正常蛋白的分布 情況如圖3G所示，結果顯示突變蛋白與野生型無明顯差別。上述結果表明，P0PDC1基因與 心臟病變相關，進而可能導致肢帶型肌營養不良癥，由此，P0PDC1基因可能是LGMD的致病 基因。P0PDC1蛋白的Popeye結構域蛋白的基本結構如圖4A所示，發明人對突變蛋白的結 構進行預測，P0PDC1蛋白的Popeye結構域二級結構如圖4B所示，圖4(：所示為Popeye結構 域的多序列比對，顯示R172和S201位點的高保守性；圖4D所示為Popeye結構域接線圖， 顯示R172和S201位點所在位置；圖4E所示為Popeye結構域結構模型示意圖。通過對突 變蛋白的上述結構模型的研究，發明人發現突變P. S201F、p. R172H、p. R129W和p. R143G均 能影響保守的Popeye結構域的功能。Popeye結構域類似于一個cAMP結合結構域，并且與 核苷酸結合后能引起構象變化，因此Popeye結構域可能是引發蛋白相互作用的一個功能 結構域。在Popeye結構域的3D模型中，S201位于朝向cAMP分子的那部分核苷酸結合區 域；而R172則在緊接著Popeye結構域，很接近cAMP結合口袋；R129和R143則位于Popeye 結構域的N末端。通過cAMP親和沉淀，發明人發現，突變體蛋白對cAMP的親和力下降。可 見突變體很可能通過影響Popeye結構域的cAMP親和能力，改變了 P0PDC1蛋白的功能，從 而引發疾病。
[0140] 因此，綜上所述，發明人認為本發明找到的P0PDC1基因的4個突變位點，即 с. 602C>T、c. 515G>A、c. 385C>T和c. 427A>G位點，極可能是LGMD (肢帶型肌營養不良癥） 的致病變異位點。
[0141] 實施例3
[0142] 對實施例1中檢測到二號、三號和四號家庭的突變基因檢測結果進行基因相互作 用分析，具體分析內容如下：
[0143] 在對在二號家系的分析中，發明人利用臨床外顯子分析檢測到LMNA基因的錯義 突變（c. 1070A>C，p.D357A)以雜合的形式出現在患者II 2及其患病的姐妹和一個健康的兒 子身上，而LMNA突變以及其另一個亞型在相似的案例中被發現與DCM(擴張型心肌病）相 關。
[0144] 在三號家系中，發明人利用臨床外顯子分析檢測到4個雜合的錯義突變在以下四 個基因中 ：30擬〇?465〇)，05?(11216￥)，&11(111^(633394〇311(13359391')，共分離分析顯示 這些突變遺傳自母親I 2.在來自意大利的四號家系中，根據Polyphen軟件預測SDHA的突 變為有害突變，根據雙基因遺傳模型，預測P0PDC1/SDHA雙雜合在全部人口中出現的頻率 為0. 0016,而在亞洲人中出現頻率上升為0. 076.但基因型的頻率沒有達到對于單基因病 人群中基因型頻率小于1/2000的要求，因此兩個基因之間相互作用出現頻率可能需要進 一步更大量散發人群中的研究支撐。
[0145] 在四號家系中，臨床外顯子測序的結果顯示，四個雜合突變：位于MYH6上的Indel 突變（c. 5476_5477delinsAA)、TTN上的兩個錯義突變（D25814Y，V3925L)和一個缺失突變 (c. 44427_44429delGGT)都在患者中發現并且有極高的致病性，共分離分析的結果顯示， TTN上的錯義突變在其他家系成員中沒有出現，而MYH6的缺失突變以雜合的形式出現在了 患者的一個健康兒子III 2身上而另一個III 1沒有。另外，已有MYH6 (c. 5476_5477delinsAA) 對擴張型心肌病的致病性報道。因此，綜上所述發現在該家系中只有當P0PDC1和MYH6兩 個基因的突變同時存在并發生雙基因遺傳時，心臟的病例表型才會出現。
[0146] 因此，該分析進一步證明了 P0PDC1基因的四個突變位點，即c. 602C>T、c. 515G>A、 c. 385C>T突變和c. 427A>G位點突變，是LGMD (肢帶型肌營養不良癥）的致病變異位點。
[0147] 實施例4
[0148] 制備一檢測試劑盒，其包含能夠檢測P0PDC1基因的c. 602C>T、c. 515G>A、 c. 385C>T突變和c. 427A>G突變的引物，用于篩選肢帶型肌營養不良癥的生物樣品，其中這 些引物為P0PDC1基因外顯子特異性引物，本實施例中采用實施例2的P0PDC1基因外顯子 4和3的引物對。
[0149] 利用上述試劑盒篩選肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的具體步驟為：按照實施例 2的步驟1所述的方法提取待測者DNA，以所提取的DNA為模板與上述P0PDC1基因的外顯 子特異性引物進行PCR反應，PCR反應的反應體系和反應條件如實施例2所示，并按照本領 域常規方法對PCR產物純化，將純化的產物進行測序，然后通過觀察測序所得到的序列是 否具有 c. 602C>T、c. 515G>A、c. 385C>T突變和c. 427A>G突變之一，能夠有效地檢測本發明 的P0PDC1基因突變體在待測者DNA中是否存在，從而能夠有效地檢測待測者是否易患肢帶 型肌營養不良癥，進一步，能夠從待測者中篩選出肢帶型肌營養不良癥的生物樣品。
[0150] 在本說明書的描述中，參考術語"一個實施例"、"一些實施例"、"示例"、"具體示 例"、或"一些示例"等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特 點包含于本發明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不 一定指的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任何 的一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。
[0151] 盡管已經示出和描述了本發明的實施例，本領域的普通技術人員可以理解：在不 脫離本發明的原理和宗旨的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本 發明的范圍由權利要求及其等同物限定。
【主權項】
1. 一種分離的編碼P0PDC1突變體的核酸，其特征在于，所述核酸與SEQ ID NO :1相比， 具有c. 602OT突變、c. 515G>A突變、c. 385C>T突變和c. 427A>G突變的至少之一， 任選地，所述核酸為DNA。2. -種分離的多肽，其特征在于，與SEQ ID NO :4相比，所述分離的多肽具有p. S201F 突變、p. R172H突變、p. R129W突變和p. R143G突變的至少之一， 任選地，所述多肽由權利要求1所述的核酸編碼。3. -種篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的系統，其特征在于，包括： 核酸提取裝置，所述核酸提取裝置用于提取所述生物樣品中的核酸樣本； 核酸序列確定裝置，所述核酸序列確定裝置與所述核酸提取裝置相連，用于對所述核 酸樣本進行分析，以便確定所述核酸樣本的核酸序列；以及 判斷裝置，所述判斷裝置與所述核酸序列確定裝置相連，以便基于將所述核酸的序列 與 SEQ ID N0:1 相比，是否具有 c.602C>T 突變、c.515G>A 突變、c.385C>T 突變和 c.427A>G 之一，判斷所述生物樣品是否易患肢帶型肌營養不良癥。4. 根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所述核酸提取裝置進一步包括： RNA提取單元，所述RNA提取單元用于從生物樣品中提取RNA樣本；以及 逆轉錄單元，所述逆轉錄單元與所述RNA提取單元相連，用于對所述RNA樣本進行逆轉 錄反應，以便獲得cDNA樣本，所述cDNA樣本構成所述核酸樣本。5. 根據權利要求3所述的系統，其特征在于，所述核酸序列確定裝置進一步包括： 文庫構建單元，所述文庫構建單元用于針對所述核酸樣本，構建所述核酸的文庫；以及 測序單元，所述測序單元與所述文庫構建單元相連，通過對所述文庫進行測序，以便確 定所述核酸的序列。6. 根據權利要求5所述的系統，其特征在于，所述文庫構建單元進一步包括： PCR擴增模塊，所述PCR擴增模塊中設置有P0PDC1基因外顯子特異性引物，以便利用所 述特異性引物，對所述核酸樣本進行PCR擴增， 任選地，所述特異性引物至少包括以下引物對之一： 第一引物對，具有SEQ ID NO :7和8所示的核苷酸序列，用于擴增c. 602OT突變位點； 第二引物對，具有SEQ ID NO :9和10所示的核苷酸序列，用于擴增c. 515G>A突變位 點， 第三引物對，具有SEQ ID NO :11和12所示的核苷酸序列，用于擴增c. 385C>T突變位 點， 第四引物對，具有SEQ ID NO :13和14所示的核苷酸序列，用于擴增c. 427A>G突變位 點， 任選地，所述測序單元包括選自HISEQ2000、S0LiD、454和單分子測序裝置的至少一 種。7. -種用于篩選易患肢帶型肌營養不良癥的生物樣品的試劑盒，其特征在于，含有： 適于檢測P0PDC1基因突變體的試劑，其中與SEQ ID N0:1相比，所述P0PDC1基因突變 體具有c. 602OT突變、c. 515G>A突變、c. 3850T突變和c. 427A>G突變的至少之一， 任選地，所述試劑為核酸探針或者引物， 任選地，所述核酸探針或者引物包括以下至少之一： 第一核酸探針或者引物對，具有SEQ ID NO :7和8所示的核苷酸序列，用于擴增 c. 602OT突變位點； 第二核酸探針或者引物對，具有SEQ ID NO :9和10所示的核苷酸序列，用于擴增 c. 515G>A突變位點， 第三核酸探針或者引物對，具有SEQ ID NO :11和12所示的核苷酸序列，用于擴增 c. 3850T突變位點， 第四核酸探針或者引物對，具有SEQ ID N0:13和14所示的核苷酸序列，用于擴增 c.427A>G突變位點。8. -種構建體，其特征在于，包含權利要求1所述的分離的編碼P0PDC1突變體的核酸。9. 一種重組細胞，其特征在于，所述重組細胞是通過表達權利要求8所述的構建體轉 化受體細胞而獲得的。10. -種構建藥物篩選模型的方法，其特征在于，包括： 使動物的至少一部分細胞表達權利要求1所述的核酸， 任選地，所述動物為小鼠、豬、狗、靈長類動物。
【文檔編號】C12N5/10GK105821047SQ201510013324
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2015年1月9日
【發明人】張建國, 亞歷山大·費利利, 方明艷, 蔣慧, 徐訊, 王俊
【申請人】深圳華大基因股份有限公司