專利名稱：將核酸分離成不同群體的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離核酸片段的方法。特別地，本發明涉及一種將已被或可被組分標記的核酸從核酸群體中分離出來的方法，其中的組分可被固定于基質上。
大多數生物技術的核心是對DNA的操作和處理。DNA操作一般包括使用可將DNA切割成片段的特異性限制酶進行消化，然后純化DNA片段，將所需片段插入克隆載體并將這些載體轉移入非自然宿主以便轉錄并任選翻譯，從而提供頗有價值的生物學信息和/或將插入的DNA表達成產物，如具有治療作用的產物。舉例來說，這種DNA的操作可以實現真核蛋白在細菌中的表達。對DNA分子的切割和連接是現代生物技術的核心。通常，這些DNA片段是經聚合酶鏈反應(PCR)制備的，后者如今已在研究和工業生物技術領域中普遍使用。這種PCR方法可以通過特異的短核酸引物產生大量的DNA，從而實現特異DNA分子的擴增，而擴增后的DNA可以用于進一步的操作，例如以上所述的克隆技術。
使用例如上述限制酶切割或PCR方法獲得的DNA分子進行的核酸操作方法通常效率較低，其原因至少部分的由于一些不需要的DNA分子的存在。這些“不需要的”分子包括例如將插入的DNA片段從重組分子中切割，特別是不完全切割時產生的載體DNA，部分消化的限制性片段或限制酶切割DNA分子產生的其它副產物，過剩的PCR引物，作為核酸操作副產物的錯誤連接的核酸分子，以及由于PCR引物與模板核酸之間錯誤的退火而產生的PCR產物。主要終產物DNA的質量對于下游操作如連接和細菌或真核宿主細胞的轉化至關重要。能夠將核酸分子的混合物，如DNA分子或DNA片段的混合物分離成不同的群體，從而從想要的或目的核酸分子中去除被認為是“不需要的”或污染性的群體的能力將會因此提高用如此所得核酸分子進行進一步處理或下游步驟的效率。
一系列核酸分子的純化方法已被此行業所共知。然而可以將核酸分子混合物例如含有幾種不同DNA分子的混合物分離成不同群體的已知方法卻很有限。通常，這些方法依賴于按大小分離核酸分子或片段，例如通過瓊脂糖或聚丙烯酰胺凝膠的電泳，進而純化目的分子或片段。這些方法有許多缺點。其中的一個限制性因素是凝膠自身的容量，它限制了可被分離的DNA的量。一般通過溴化乙錠染色的方法使凝膠中的DNA可被觀察到。除了對操作者的毒性外，這一操作可以引起核酸質量的降低，從而可以導致其在下游應用中的性能變差。回收使用凝膠電泳方法分離的核酸分子同樣效率低下而導致顯著的損失，通常損失至少20％的DNA。凝膠電泳方法還耗費時間。DNA是一種脆性分子，在受到核酸外切和內切核酸酶攻擊時很容易被破壞。在電泳分離相對較長的操作過程中，DNA容易被降解，因而這種操作可以破壞DNA的完整性并且影響下游操作的效率。這類分離方法因此是效率低且花費大的。因此，亟需一種可以至少部分的將核酸分子分離成不同群體的新方法。本發明就提供了這樣一種方法。
根據本發明的內容，此項發明提供了一種可以至少部分的將樣品中的核酸分子分離成各個群體的方法，其中一個群體已被或可以被標記了能固定于基質上的組分，上述方法包括將含有核酸的樣品與基質接觸，基質借此捕獲標記分子從而使其與未標記的分子分離。
與前述電泳分離方法比較，這種方法非常簡單而且快捷。因此這種方法也更加經濟，擁有更大的綜合效率，而且并不受電泳分離方法缺點的影響。
本方法依賴于捕獲標記的核酸分子，即將其固定或保留在基質上，從而達到與溶液中剩余的未標記分子相互分離的目的。
本發明方法可以用于將所需未標記核酸分子(目的分子)與標記后的非所需核酸分子或片段分離開來，此時基質將捕獲非所需核酸分子而目的分子則留在溶液中。這種方法在當目的核酸分子將用于下游操作，例如進一步的遺傳學操作技術時具有優勢，因為可以直接進行進一步的步驟而不需要將目的核酸分子從基質上洗脫或分離下來，并且這種方法也可以避免某些情況下必需將標記從核酸分子上去除的需要。因此這就構成了本發明的優選方面。而且，此方法也可用于將標記的目的核酸分子從未標記的非所需核酸片段中分離出來，此時基質將捕獲所需核酸分子而非所需核酸分子則留在溶液中。除此以外，本方法可用于為不同下游操作目的而收集所有分離后的核酸級分。
這里使用的“核酸分子”是指任何的核酸分子，包括DNA、RNA、cDNA和雜合復合物，例如像肽核酸(PNA)這樣的含有核酸和肽的復合物；在DNA中，包括雙鏈和單鏈分子，以及任何合成DNA或RNA分子和DNA/RNA雜合分子(即一條鏈為DNA而另一條鏈為RNA的分子)。“靶”或“目的”DNA是指目的在于使其與其它核酸分子分開或分離的那些核酸分子。在本發明的上下文中“標記物”是指一種組分，它可以被核酸分子附著、粘合、摻入、攜帶或作為核酸分子中核苷酸序列的一部分，或以其它方式連接在核酸分子上，這種組分提供了一種從含有以此方式標記的某一特定群體和其它未標記群體的樣品中捕獲出標記的核酸分子群體的方法。憑借這種標記通過基質保留步驟可將標記分子從未標記分子中分離出來，從而達到核酸混合物分級分離的目的。這種標記可以結合到核酸分子中，即作為核酸分子的一部分，例如它可以是一種修飾后的核苷酸并在合成過程中插入核酸分子中；或者作為分子中核酸序列的一部分，這時核酸分子本身就是標記；或者通過像加入末端核苷酸這樣的合成后步驟可將此類標記附著或粘合于核酸分子上；或者將此類標記結合到核酸序列中的某個識別序列上，此時沒有與標記結合的核酸被描述為“可被標記”。
本方法可以用于分離或分級分離前述任何一類核酸或其混合物。本發明的優選方面是將樣品中DNA分子或片段通過本方法至少部分分離成核酸分子的不同群體。這類方法有DNA標本，如PCR合成的DNA分子或某重組DNA分子，經限制酶消化后從中分離出特定的限制酶切片段并且“純化”PCR反應，即去除引物錯誤退火而產生的PCR產物。本方法也有其它用途，例如可以在診斷型PCR和體外噬菌體包裝中分離線性和環形核酸。
根據本發明，用于標記核酸分子的組分可以是任何能夠標記核酸分子并且能夠固定于基質上的組分。與基質的固定可以通過直接或間接的相互作用。因此，標記物可以單獨起到固定在基質上的作用，或者通過一個可與基質作用的中間物或連接組分，如所述標記物的結合配對物起作用。
因此另一方面，本發明提供了一種可以至少部分的將樣品中的核酸分子分離成各個群體的方法，其中一個群體已被或可以被標記了組分，此組分能直接或通過標記的結合配對物而間接固定于基質上，所述方法包括將含有核酸的樣品與基質接觸，或當標記物通過其結合配對物與基質間接相互作用時，使標記物與其結合配對物及與基質接觸，從而捕獲標記分子并使其與未標記的分子分離。
標記物的特性至少部分依賴于待分離的分子和所用的基質。適合使用的標記包括可以插入核酸分子的組分，例如生物素、熒光素等配基，或類固醇或類固醇樣分子如地高辛配基，或者可用于修飾核酸分子中單個核苷酸的組分，或者蛋白類的組分，例如對核酸分子中特定結合位點具親和性的蛋白。因此，可以在核酸分子的合成過程中通過例如插入標記核苷酸的方法實現標記，或可以在合成后通過例如酶反應在核酸一端加入標記核苷酸的方法實現標記。根據使用基質的不同，標記物可以直接與基質作用或者通過其結合配對物間接作用于基質，其中結合配對物的作用是將標記固定于基質上，即作為一種連接因子。結合配對物本身可以直接作用于基質，或者通過進一步的連接因子起作用，此時標記分子可以經過順序或同時進行的結合步驟而被基質捕捉。
在一個實施方案中，標記物可以是一種小分子配基。此時，被標記的核酸分子可以通過此配基的結合配對物固定于本發明方法中所用的基質上，這種結合配對物可以其衍生型基質的形式本身固定于基質上，或者作為一個獨立的連接基團使標記物固定于基質上。
在此方法的一個實施方案中，核酸樣品首先在溶液中與配基標記物的結合配對物接觸，此結合配對物只與標記的核酸分子結合，此后使用與結合配對物有親和性的基質提取結合了結合配對物的標記核酸分子。在另一個實施方案中，結合配對物首先固定于基質上，然后再與核酸樣品接觸，這樣只有標記的核酸分子存留在薄膜上。在這個實施方案中，采用合適于所選配基和結合配對物類型的傳統方法將結合配對物固定在基質上，這些方法包括直接以化學鍵例如共價鍵結合，吸附或通過親和力結合。
生物素是一個可用于本發明的配基標記物的例子。其它類似物在此行業內已為人所知。當生物素作為配基使用時，其結合配對物應為抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，基質可以選用那些對蛋白有親和性的基質從而能夠捕獲鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白以及任何與鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白結合的分子。抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白可以各自作為生物素的結合配對物，下文中提及的均為細菌蛋白鏈霉抗生物素蛋白，但應說明的是也可以使用抗生物素蛋白。生物素可以很容易的插入核苷酸中，甚至生物素化核苷酸已經可以通過商業渠道獲得。我們也發現在本發明方法中使用生物素標記具有很高的效率。生物素從而代表了本發明方法中一種優選的標記。
在一個以生物素作為配基的實施方案中，生物素化核酸分子可以首先在溶液中與鏈霉抗生物素蛋白保溫，從而使得作為結合配對物的鏈霉抗生物素蛋白與含有生物素的核酸分子結合并形成結合復合物。然后使用能選擇性固定蛋白但至少在所用條件下應不能固定核酸分子的基質將附著有鏈霉抗生物素蛋白的這些標記分子固定，這樣就可以將含有生物素的核酸分子從樣品中分離出來。
在以生物素作為標記物的另一個相關實施方案中，所述基質本身有鏈霉抗生物素蛋白結合或附著于其上。此時，當溶液中的核酸樣品與所述基質接觸后，生物素標記的分子將被保留在基質上，而未標記的分子則游離在溶液中。
在另一個實施方案中，標記物可以是像熒光素或地高辛配基或抗原這樣的配基。這些標記物可以通過結合其配體而被捕獲在基質中，例如結合配基可以是針對標記物的多克隆或單克隆抗體或其片段。若配基是類固醇，捕獲可通過抗體或其片段，或此類固醇的受體或其具有結合類固醇能力的片段實現。這些捕獲方法可以使用與前述鏈霉抗生物素蛋白相似的方法，并聯合對蛋白具親和力的基質。
在本發明的進一步的實施方案中，這種標記物可以是蛋白，尤以在待標記的核酸分子內有特定識別序列的核酸結合蛋白為優選。這些核酸結合蛋白的實例包括結合AP-1識別序列的轉錄因子AP-1，結合特定短識別序列的myb蛋白，以及結合lac操縱子序列的lacI抑制子蛋白。
在一個相關的實施方案中，標記物可被看作是一段核酸序列或核酸分子內諸如特異性識別序列等序列。這種序列標記物可以對能結合基質之蛋白具有親和力。這樣的實例包括前述AP-1識別序列，其上可以結合作為結合配對物的AP-1從而實現與蛋白結合基質的結合。類似的，myb蛋白作為結合配對物可結合到作為標記物的特異短識別序列上，而lacI蛋白作為結合配對物可結合到作為標記物的lac操縱子序列上。
在本發明的這種實施方案中，一種含有包括蛋白識別序列的核酸分子的樣品可首先在溶液中通過接觸被其特異序列識別的蛋白而被進一步標記，然后此樣品與基質接觸從而使被標記的分子保留在基質上，而未被標記的分子即沒有結合蛋白的分子則留在溶液中。或者，這種DNA結合蛋白可被固定在基質上，然后通過與前述使用鏈霉抗生物素蛋白類似的方法從溶液中捕獲核酸。
在每一個這樣的實施方案中，捕獲一定群體的核酸分子的過程都涉及一種或作為標記物本身或作為標記物的結合配對物(例如抗體，或鏈霉抗生物素蛋白)的蛋白。這種方法是優勢的，因為這樣可以將易于接受蛋白的物質用作基質，尤以至少在所使用的條件下能選擇性的結合蛋白而不能結合核酸的物質為優選的基質物質，從而可以保證未被標記的分子不能被薄膜捕獲或從樣品中去除。這種蛋白可被基質捕獲并通過多種作用方式與基質結合，包括離子作用，疏水相互作用及其親和性結合。
這種基質可以采用任何方便的物理形態，并且許多已為業內所共知，例如薄層，凝膠，濾膜，膜，纖維，管，微量滴定板，柱，顆粒，而且既可能是微粒狀的也可以是多孔狀的。無論是濾去非所需的標記DNA或是收集所需的標記DNA，使用多孔材料如濾膜和薄膜等對于本發明分離方法是很方便的。實例包括以下樣品，其中未標記群體將進一步處理，而標記的核酸群體，即構成“非所需”群體的那些，可通過直接濾膜過濾而從溶液中捕獲，這是一種有效而快速的捕獲方法，其可同時將未標記的核酸群體分離至濾液中，從而提供一種迅速而有效的捕獲方法并同時將未被標記的核酸分級分離入濾液中，所以這種方法提供了一種進入下一步操作階段的直接途徑。因此，像濾膜這樣的多孔材料構成了用于本發明中的一種優選的基質。
因此多孔基質可方便的用于濾去不需要的被標記的核酸分子，或用于收集需要的被標記核酸分子。這些基質可用作單步或多步分離設備的組成部分，或作為其它步驟，例如對DNA或下游反應流程中的其它產物進行檢測、評估或定量的步驟中的組成部分。這些多孔基質可被合并入例如離心管，微滴定板，套筒或注射器這樣的分離設備，并且根據樣品和待操作的下游步驟，可用系列的方式提供一種或多種這樣的設備。這種設備可以人工、半自動或全自動的方式操作。
在一個實施方案中可使用NycoCardTM。當被標記的核酸片段是待側的序列或分子時，此片段可通過結合到對所述標記物具有親和力的蛋白上，再直接被保留于NycoCardTM設備中的蛋白結合膜捕獲。這種設備應包括一張合適的薄膜，其一側附有吸收性襯墊如纖維素紙以促進液體樣品通過薄膜。在一個實施方案中，在膜的另一側可安放一個非滲透性的片層并提供一些空洞以允許在多樣品待分析時在膜上加載樣品。當將要去除被標記的序列而收集未被標記的核酸時，可以使用一種蛋白結合濾膜用作預過濾膜，其位于安裝在NycoCard設備上的核酸結合濾膜上，以便將標記的非所需分子存留在預過濾膜上，而未標記的所需分子則存留在核酸結合濾膜上。
基質可由多種業內已知的用于此目的的材料構成，包括聚合材料例如纖維素、聚苯乙烯、瓊脂糖、乳膠，這些材料可以被衍生或修飾以供捕獲標記物本身，或捕獲作為標記物與基質間連接因子的標記物之結合配對物。所述材料可以用諸如對標記物具有親和力的物質、或結合配對物、或用于介導標記物捕獲的連接因子包被。優選地，基質對標記物或其結合配對物比對核酸更有特異結合性，以便未被標記的分子不能被基質存留。在本發明一優選方面，捕獲過程涉及蛋白，標記物或是蛋白，或是含有可連接該標記物與基質之蛋白性結合配對物的物質，從而使所述基質具有可接受蛋白的特性。這方面的實例已為業內所知，包括已知的蛋白結合基質，其至少在所用條件下被對蛋白有特異親和力的多聚體包被。依照業內已知的方法，這種基質可攜帶或被標記物的結合配對物取代，如WO90/04786所述，其包括直接化學鍵結合如共價結合，吸附或親和結合。特別優選含有蛋白結合多聚體的膜，如在WO98/23630、EP-0524800和EP-0580305中所述，如Edge Biosystems，USA出售的Centriflex(TM)膜。
在樣品待分級分離且溶液中未標記的核酸分子將被收集并用于下游步驟時，本發明的分離方法特別方便。但這種方法同樣可用于待收集以便進一步處理的標記的核酸分子。當標記分子是被收集以便進一步操作的那些時，這些分子需要從基質上釋放出來，并且根據所用捕獲方法，還需從標記物的結合配對物中釋放出來。所用釋放方法可能依賴于標記物的特性，其結合配對物，以及它們互相之間結合力的類型和強度。
用于釋放步驟的反應條件也是可選擇的，以便防止已釋放的標記核酸與基質或其結合配對物重新結合。所述方法的實例已為業內所知。因此，可改變化學或物理條件以協助被標記的核酸分子從基質結合復合物中釋放出來。化學方法的實例包括改變離子強度或pH值，加入螯合劑，以及使用競爭性游離標記分子，或化學上與之相關的分子，含有標記物或標記物樣組分的分子，可改變結合配對物的構型而減少、消除或修飾標記-結合配對物間作用的分子或離子，加入去污劑或解離劑，或通過酶處理。物理方法的實例包括改變溫度、超聲處理、振動。這些物理或化學方法的任何組合都可以使用。
根據標記物與其結合配對物之間相互作用強度的不同，可以通過如下方法釋放結合配對物或基質上的標記物或已標記的分子，即加入過量標記物使其與標記DNA競爭對結合配對物或對基質的結合位點，然后被釋放的標記DNA可以簡單的被洗脫下來。因此當標記為熒光素而結合配對物為熒光素抗體時，可以通過在溶液中加入游離熒光素而從基質上釋放熒光素-DNA。但是，當標記物-結合配對物之間的相互作用、結合配對物-基質之間的相互作用或標記物-基質之間的相互作用非常強時，加入游離標記物并非總能有效干擾上述相互作用。此時，可以使用其它方法，如通過調節pH值或用酶降解結合配對物從而使其從基質和/或標記物上釋放下來。通過如用化學試劑干擾基質使其變為不能結合蛋白的形式，從而釋放蛋白-DNA或蛋白-標記物-DNA復合物，或者通過化學方法干擾蛋白與基質之間的相互作用或影響它們之間的親和性也可以達到釋放的目的。
生物素-鏈霉抗生物素蛋白之間的結合配對存在非常強的相互作用，因此很難通過加入游離生物素的方法破壞。即當標記物為生物素，基質通過抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白捕捉標記DNA時，不能通過加入游離生物素的方法使生物素化DNA從薄膜上釋放下來。但這種方法可以用于對鏈霉抗生物素蛋白的結合親和性比生物素低的生物素衍生物，此時標記DNA可以通過加入游離生物素的方法從基質上釋放下來。游離生物素將與生物素化DNA競爭對鏈霉抗生物素蛋白的結合位點，釋放后的生物素化DNA可以簡單的從基質上洗脫下來。
根據所用標記的不同可能需要插入一個步驟，使將要用于下游步驟的標記DNA從標記物的結合配對物上釋放下來，此時結合配對物的作用是將標記DNA固定于基質上。如加入化學物質或離子或應用可以減弱標記與其結合配對物之間結合力的物理條件，然后收集釋放后的DNA。
本發明方法可以用于包括分析、制備和診斷等許多不同的應用，實例見下文。其它應用對于熟悉此行業的人員是顯而易見的。
本發明的一個重要的應用是切割和連接DNA分子，例如分離特定限制酶消化產物，及從連接反應的其它產物中分離已連接的環狀DNA分子。
因此，本發明的一個應用是對限制酶消化的DNA片段的操作，特別是當某一特定片段需要進一步的操作而因此必需從酶反應的其它產物中分離出來時。分離方法可以從未標記分子中分離出一端或兩端帶有標記物的線性DNA分子群體。標記分子可以在合成過程中被標記，例如使用像生物素化核苷酸這樣的標記核苷酸，如以生物素化引物的形式，或可用業內已知的酶學末端標記方法標記DNA分子。
因此另一方面，本發明提供了一種可以至少部分分離DNA的限制酶消化片段之混合物的方法，其中起始材料是線性DNA分子，其一端或兩端已被或可以被組分標記，此組分能固定于基質上，所述方法包括使用限制酶消化DNA分子，然后將樣品與基質接觸借此使基質捕獲來自起始材料某個末端的標記分子，從而使其與未標記的分子分離。
由于合成的操作方式，此方法特別適用于分離PCR所得DNA的消化產物。在使用PCR擴增DNA的方法中使用了兩種特異性寡核苷酸引物，其中一個與編碼鏈的5′端互補并因此雜交而另一個引物則與非編碼鏈的5′端互補并因此雜交，以致當適當DNA聚合酶存在時可以合成靶序列的全長拷貝。該拷貝在兩條合成DNA鏈中，每條鏈5′端均插入有寡核苷酸引物。這種PCR合成方法經常用于為隨后的遺傳學操作制備特異的DNA分子或片段，其中所需特異性DNA片段可以通過限制酶切割較長的PCR產物獲得。如前所述，由于限制酶切割后的其它產物，例如部分消化產物和未消化的DNA分子的連接混合物存在于隨后的操作中，這些隨后的遺傳學操作通常效率不高。當用于下游步驟的目的產物是全長PCR的內部片段時，限制酶消化后的“非所需”副產物將至少包括全長PCR產物的一個末端，通過使用像生物素化引物這樣的標記引物，本發明方法可以用于至少部分的從含有末端的片段和未消化分子中分離出所需產物。通過這樣的方法，可以從核酸樣品中去除標記后的核酸分子，存留于樣品溶液中的只有所需內部限制片段，因為它不含有像PCR引物這樣的末端因此也就未被標記。
本發明涉及PCR方法學的另一個方面是所謂的“純化(clean-up)”PCR反應產物，即去除由于引物錯誤退火而導致的非所需產物。核酸模板越大，這種問題越嚴重。當PCR反應欲擴增的核酸樣品的末端或接近末端處存在唯一的限制酶位點或其它可切割序列時可以應用本發明方法。
這一方法包括使用標記后的或可被標記的PCR引物，此引物與欲擴增的序列末端互補因此可以與模板核酸雜交，并且只與每個唯一限制位點部分重疊。如果使用與模板核酸內全長限制酶識別序列互補并雜交的引物，無論引物是否與目的序列退火或者無論PCR產物是否為引物錯誤退火的產物，PCR反應產生的任何核酸分子都將帶有所述限制酶識別位點。然而使用只與模板中限制酶識別位點部分雜交的引物，產物僅限于在限制酶識別位點按要求退火而的那些。因此通過使用標記后的或可被標記的引物，就有可能通過PCR反應操作，然后用特異于上述限制識別位點的限制酶切割或消化該PCR反應產物而使之純化。通過這種限制酶消化，只有正確的PCR產物，即能被切割并去除引物和標記的那些，可與不能被切割而仍然留有標記物的非所需PCR延伸產物分離開來。
因此從一方面看，本發明提供了一種至少部分的從PCR引物與模板不正確退火造成的PCR產物中分離出所需正確PCR擴增產物的方法，其中模板核酸分子在其一個末端或附近含有一個唯一的限制酶識別位點，并且被標記的或可被標記的PCR引物只與模板上部分延伸至該唯一限制酶位點的序列互補，此方法包括通過PCR擴增模板，使用特異作用于上述唯一限制酶識別位點的限制酶消化PCR產物，以及將所得產物與可以固定標記物的基質接觸，從而通過基質捕獲標記核酸分子使之與未標記分子相分離。
在此文中，唯一限制酶位點是指在模板核酸分子中只有單一識別位點的限制酶，但也包括在特殊情況下在模板的每一端處或附近有同樣的限制位點。
在一個實施方案中，將要用PCR擴增的模板核酸分子只在一個末端出或附近摻入一個唯一限制位點。當用這種酶處理反應產物，將產生部分“純化”的PCR產物，“純化”的程度至少部分依賴于與含有這一唯一位點之模板退火的引物可能造成錯誤退火的程度。在這個實施方案中，只有延伸至所述唯一限制酶位點的引物被標記或可被標記。在一個優選的實施方案中，將要通過PCR擴增的模板在其每一個末端或近側都含有一個唯一的限制酶位點。這些位點可以是同一種限制酶的位點，即一種限制酶切割模板和PCR產物兩次，每次位于一個末端，或者這些位點可以是不同限制酶的位點，只要每個上述限制酶在模板上只有一個單一識別位點并且分別在模板的兩端即可。
在這種方法中，每個唯一限制位點相對于核酸模板末端的位置至少部分依賴于所使用的特定限制酶，因為在有效限制切割時不同的酶對于其位點與末端的最小距離有不同的要求。這些最適參數已為業內所共知，且在如限制酶生產商提供的目錄中均有描述。總體來說，限制酶位點應距末端至少一個堿基。對酶及其位置的選擇可由技術人員根據領域內常識并根據廠家提供的信息很容易地確定。總體來說限制位點應至少距末端有最小距離以便相應酶進行有效切割，但位點也可以遠離所述末端。例如，此最小距離在BamHI為至少距末端一個堿基，在NdeI為至少距末端6個堿基。最小距離可參見限制酶生產商出版的目錄，如New England Biolabs Catalogue 1999，和Moreira and Noren，生物技術，19，56-59(1999)。
因此通過使用或以業內已知的重組DNA技術構建在其每一端或近側含有唯一限制酶位點的模板，就可以去除由于PCR引物與模板非目的位置錯誤退火而產生的非所需PCR副產物。當一對引物都被標記或可被標記時，所有PCR產物的兩端都可以在最初被標記。使用在模板每個末端都有唯一識別位點的前述限制酶同時或順序消化PCR產物，未被切割或只有一端被切割的分子將保留標記物，由限制酶切割出的正確PCR產物的雙末端也是如此；它們可與兩個引物都被去除而因此不再含有標記或可被標記的組分的目的產物分離開來。這一方法的優點在于可以省卻用于精細調整PCR反應的大量時間和材料，而使用凝膠電泳或其它通過大小分離PCR產物的方法則必需對PCR反應進行精細調整。如果兩個PCR引物中只有一個被標記或可被標記則仍可以實現對PCR產物的至少部分“純化”。
標記物為生物素時操作很方便，其中在限制酶消化之前或之后將PCR產物接觸鏈霉抗生物素蛋白，然后可以通過蛋白結合基質將有鏈霉抗生物素蛋白結合的標記分子與未標記分子分離開。如前所述，另一種方法是基質本身可以帶有鏈霉抗生物素蛋白。
在本發明的這個特定實施方案中，標記物可以附加在引物的任何位置，只要引物的3′末端可由PCR聚合酶的延伸。更方便的方法是可在引物的5′末端附加標記物，因為在這一位置添加標記不會導致合成困難。而且一些并非局限于理論的觀點認為位于引物5′末端的標記物較不可能干擾PCR聚合酶的活性，并且在本文中描述的任何捕獲方法中也更容易被捕獲。
以下表示了一個實例
5’-tttactggatcctag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagcc-5’該片段具有兩個唯一的限制位點，一個位于“左側”的BamHI位點(ggatcc)以及一個位于“右側”的AsnI位點(attaat)。以一般方式擴增這一片段通常需要制備兩個引物，可任選在其5’末端標記生物素，如下所示BamHI引物5’-生物素-tttactggatcctag-3’AsnI引物5’-生物素-ccgattaatgtacgtaa-3’在PCR反應中使用這些引物通常將產生許多產物，主要原因是在PCR中引物錯誤的退火。
BamHI和AsnI引物在其序列中充分體現了核酸識別序列。這將使得以這些引物進行的PCR反應所產生的每個DNA片段都含有BamHI和AsnI限制酶識別位點。所有PCR反應所產生的片段，不論正確的(即目的)產物或副產物，都將可以被BamHI和AsnI酶切割。
然而，本發明實施方案中使用稍短的引物，可以非常有效的去除所有非所需副產物。
可用的引物實例如下BamHI短引物5’-生物素-tttactgga-3’AsnI短引物5’-生物素-ccgatt-3’這些引物只與限制酶的識別位點部分重疊。因此，只有通過與其目的核酸位點退火才能形成完整的酶識別位點。其結果是，只有PCR反應產生的正確的(或目的)片段才能被兩種限制酶切割。
使用上述引物可能產生的4組PCR產物如下(B＝生物素標記)5’-Btttactggatcctag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-5’(正確片段-2個限制位點)5’-Btttactggtag------ttacgtacattaatcgg-3’3’-aaatgaccatc------aatgcatgtaattagccB-5’(不正確片段-只方1個限制位點(AsnI))5’-Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-只有1個限制位點(BamHI))
5’-Btttactggatag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-沒有限制位點)以AsnI和BamHI切割得到如下片段5’-Btttactggatcctag------ttacgtaca ttaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgtaattagccB-5’(正確片段-2個限制位點-2個生物素都被去除)5’-Btttactggtag------ttacgtaca ttaatcgg-3’3’-aaatgaccatc------aatgcatgtaattagccB-5’(不正確片段-只有1個限制位點(AsnI)-只有1個生物素被去除)5’-Btttactggatcctag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctaggatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-只有1個限制位點(BamHI)-只有1個生物索被去除)5’-Btttactggatag------ttacgtacaatcgg-3’3’-aaatgacctatc------aatgcatgttagccB-5’(不正確片段-沒有限制位點-由于沒有限制位點無一生物素被去除)在所有上述片段的混合物中，只有一種片段即正確的片段將沒有生物索附著。通過在片段中加入鏈霉抗生物素蛋白并將反應產物與蛋白結合基質接觸，例如通過一個Centriflex薄膜，則只有正確的片段將不被捕獲并且在使用Centriflex薄膜這樣的情況下，其可以不受任何阻礙的通過薄膜。
使用短引物(即不能完全延伸進入模板上限制酶位點的引物)和長引物(摻入了全長限制酶位點)的區別是顯而易見的，因為在使用長引物的情況下，所有的片段甚至錯誤的片段也導入了AsnI和BamHI限制酶位點。此時就無法區分正確和錯誤的PCR反應產物。
本方法也可以用于分離DNA分子經限制酶消化后的產物，這種產物可以是線性的或已經被線性化，并且通過業內已知的末端標記方法，例如酶學方法在一端或兩端進行了標記。一個實例是單獨使用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)或與DNA聚合酶I(Klenow片段)聯合使用，在線性DNA分子3′末端的游離羥基上加入標記的核苷酸，如生物素或熒光素或地高辛配基標記的核苷酸。如果用于限制酶消化的線性DNA是平末端或有突出3′的末端則只需TdT就可以標記3′末端。然而當其5′末端為突出端，3′末端為凹進端時，需另加入Klenow片段等酶填以補凹進末端而提高效率。
當標記物是生物素時，樣品首先在溶液中與鏈霉抗生物素蛋白接觸，然后將樣品通過一個可以結合鏈霉抗生物素蛋白的蛋白結合薄膜，從而存留不需要的、標記的核酸分子而溶液中留下目的片段，其形式適于進一步操作。
這比現有方法有顯著改進，現有方法工作量大，并涉及在瓊脂糖凝膠中分離限制酶消化混合物，通過溴化乙錠染色使片段可見，切除所需DNA片段并將其從凝膠中純化出來，這一過程非常冗長，且操作過程中DNA暴露于核酸酶的危險極大。
本發明此方面的另一應用是在PCR擴增產物的限制酶消化領域。有時需進行部分限制酶消化，即，使用有限量的酶進行消化。限制酶制劑經常含有少量的內切核酸酶，它們可以降解新切割的DNA末端從而降低所需片段的質量，并使進一步操作，如將DNA連接入表達載體發生困難。然而，由于核酸酶污染導致的這類問題可以通過使用有限量的限制酶和縮減保溫時間最小化。但一個缺點是消化產物將會含有一些不需要的限制酶消化副產物，例如只部分切割的分子或未被切割的分子。本發明方法卻可以實現部分消化，方法是使用標記的如生物素化引物DNA通過PCR合成限制酶消化底物，以便任何至少含有一個末端的DNA分子或片段(例如未被消化的分子，或部分消化的分子)可以通過合適的基質被去除，而溶液中只富含所需內部限制片段。
本發明基于標記的分離方法的另一應用涉及診斷型PCR。已知可用PCR檢測突變，包括僅單個核苷酸差異的突變，如鐮刀型細胞貧血癥中出現的情況。有時，PCR片段的大小可以預示特定突變的存在或缺失。但通常，診斷型PCR技術還需在最初PCR后，對患者樣品實施其它技術，以診斷樣品中是否存在突變，如限制酶分析和/或測序。這些技術可能花費巨大，因為它們經常需要使用像肽核酸這樣昂貴的化學制劑并且也相當費時，而且導致延緩了對患者狀況的判斷。使用本發明的標記物-捕獲方法，通過使用至少一種標記的或可被標記的PCR引物進行PCR可以大大簡化現有方法。通過使用標記引物就可以不必進行上述進一步的步驟，即只用PCR擴增的步驟就可以檢測突變的存在。
因此當應用于診斷型PCR時，本發明方法可以代替現有診斷方法中對PCR產物進行測序的需要。在這個實施方案中，與樣品3′末端退火并在其位延伸的引物被標記或可被標記，所用方式使其保留3′OH基團并可因此在PCR反應中延伸，而且它對突變核酸具有特異性；即它可與疾病狀態下改變了的核酸序列雜交。或者，3′引物可以與正常核酸序列雜交。
在一個實施方案中，本方法可以用于檢測單個堿基突變，此時引物的3′末端與突變堿基相對應。當有多個堿基突變時，引物3′末端可以與任何一個突變堿基相對應。
因此當突變已知時，在此實施方案中的一種方案中，對樣品DNA進行兩個PCR反應，每個反應都使用相同的對樣品5′末端的引物，卻使用不同的3′末端引物，一種3′引物雜交并可以產生一種與“正常”DNA相對應的延伸產物，而另一個引物則與突變核酸序列特異互補從而可以產生與該突變序列相對應的延伸產物。在使用適于突變DNA的標記引物對突變的靶序列進行PCR時，PCR擴增產物中將插入標記物，而使用“正常”引物進行PCR反應時，在引物的3′末端將會有錯配堿基，它們將被PCR聚合酶如Tap聚合酶去除，如果3′堿基被標記，則其去除將遠離其攜有的標記物或可被標記的組分。PCR產物將因此不含有標記。因此僅有突變核酸的PCR反應產物，它們由被標記的或可被標記的突變引物延伸而成，并可用任何前述方法檢測。
使用不含待檢測之特定突變的“正常”DNA進行PCR延伸時出現相反的情況。此時，用突變引物可獲得PCR產物，其中引物的3′核苷酸錯配并因此連同標記物一起被去除，因而在全長反應產物中檢測不到，而使用“正常”引物的產物中將會含有標記物或可被標記的組分，它們可被檢測。
在這個實施方案中，標記物或可被標記的組分存在或附著于3′堿基，其方式使3′OH仍能由PCR聚合酶延伸。
因此另一方面，本發明提供了一種診斷型PCR的方法，其中待測樣品分別進行PCR反應，其中如有突變則位于與3′引物互補的序列中，第一PCR反應使用與正常靶核酸互補的3′引物而第二PCR反應使用與突變的靶核酸互補的3′引物，其中突變引物的3′核苷酸與突變核酸中已突變的核苷酸之一相對應，上述3′引物的任何一個在其3′核苷酸上都含有一個標記或可以被標記，在此方法中檢測的是PCR反應產物中標記物的存在或缺失。
在其最簡單的實施方案中，3′引物被諸如生物素標記，而生物素可以通過本文所述的任何一種方法檢測。可以檢測生物素化PCR產物的方法有，加入鏈霉抗生物素蛋白，在蛋白結合薄膜上濾過，檢測存留在薄膜上的DNA，或者加入鏈霉抗生物素蛋白包被的金顆粒，如EP-0564494所述，過膜，如上述NycoCardTM系統中的硝酸纖維素膜。可任選，但優選需要較小PCR片段時，薄膜可用聚賴氨酸包被以增進其DNA結合容量。在這種檢測方法中，PCR反應產物將會全部結合到薄膜上但只有生物素化反應產物有金微粒附著從而發出可檢測的信號。在另一種可選擇的方法中，可以在PCR反應產物中加入鏈霉抗生物素蛋白并將混合物通過Centriflex薄膜。如果在通過薄膜的物質中檢測不到DNA，則說明DNA已經存留在薄膜上，從而證明其已經生物素化了。
在引物本身并未被標記但可以被標記的情況下，需要在檢測步驟前加入標記物。
在另一個實施方案中，可以使用特異性針對正常或突變序列的標記引物進行單次PCR反應，根據引物是特異性針對正常DNA還是突變DNA，可以通過PCR產物中標記物的存在預示突變的存在或缺失。即，如果標記引物對正常DNA有特異性，則正常DNA的PCR產物可以被標記，同時突變DNA的PCR產物則不會被標記，如果標記引物對突變DNA有特異性，則正常DNA的PCR產物將不被標記，同時突變DNA的PCR產物可以被標記并因此被檢測到。因此雖然進行雙重的PCR反應可以給出更加可靠的結果，單一PCR至少可以給出突變存在或缺失的指征。
因此另一方面，本發明提供了針對核酸分子中突變的診斷型PCR方法，應用此方法可檢測核酸樣品中突變的存在或缺失，此方法所用3′引物特異性針對正常核酸或突變核酸，其中與所述引物互補的核酸區在正常與突變DNA之間有一個堿基的差異，而所述引物的3′末端對應于樣品中正常與突變DNA存在差異的位置，所述引物被標記或可被標記，借此檢測PCR產物中所述標記物的存在或缺失。
使用特異性針對正常DNA的3′引物也至少可以進行初步診斷。
因此本發明另一方面提供了一種診斷型PCR方法，其中待測樣品用互補于正常靶DNA的引物進行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物與一段其3′端核苷酸在突變體中已突變的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸處或其上帶有標記物或可被標記，可對PCR反應產物中所述標記物的存在精細檢測。
通過這種方法，產物中可檢測標記的缺失意味著樣品中不含有正常DNA。
檢測單個堿基突變的實例如下所示在這一實例中，用于延伸樣品3′末端的引物的3′末端與模板上突變的DNA對應。
假定本實例的目的是確定某患者基因正常還是帶有異常的遺傳突變。
所述基因的正常DNA序列是5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’此患者的DNA似乎是5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’其中存在一個突變。本檢驗并非必需了解患者的DNA情況。只需知道正常狀況以便診斷突變。
為了進行PCR需要一對引物，其中一個引物在5’末端區域退火，而另一個則在3’末端區域退火。5’端引物對于有無突變的患者來說是完全相同的，如下所示1號引物5’-ccccatg-3’對于另一個3’區域，需要一條與正常狀態匹配的引物，如下所示2號正常引物5’-aggtggg-3’如果突變已知，可以按以下所示構建引物2號異常引物5’-aggtggt-3’為了使此方法達到預期效果，最后一個3’末端核苷酸被生物素標記，其仍然保留在PCR反應中延伸的能力(具有游離的3’端OH)。
所述3’末端引物如下所示2號正常引物5’-aggtgggB-3’2號異常引物5’-aggtggtB-3’(B＝生物索)使用這些引物擴增正常DNA獲得的PCR產物將會是
(1號引物+2號正常引物)5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’|生物素(1號引物+2號異常引物)5’-ccccatg------atgacctaggAccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccTggtgga-5’+生物素只有用2號正常引物擴增正常模板DNA才會得到生物素化PCR產物。PCR酶會從2號異常引物上將生物素去除，從而得到非生物素化產物。
使用以下引物擴增異常DNA模板得到的PCR產物將會是(1號引物+2號異常引物)5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’|生物素(1號引物+2號正常引物)5’-ccccatg------atgacctaggCccacct-3’3’-ggggtac------tactggatccGggtgga-5’結果如上所述，但正好相反。
生物素化產物的存在將可以說明患者是否帶有突變。
以下對單個堿基突變所致鐮刀形細胞貧血癥的診斷型PCR實例在這個實例中，引物表示為已經被生物素標記。這只是可用之標記的一個實例，并非限于此例；也可以使用其它標記物。
正常人血紅素A1中，單元型A1β-球蛋白基因的第1外顯子(編碼部分)的DNA序列如下起始正常DNAatg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成
正常氨基酸序列MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…對于人類鐮刀形細胞貧血癥，單元型Sβ-球蛋白基因的第1外顯子的DNA序列如下起始鐮刀形細胞貧血癥DNAatg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成鐮刀形細胞貧血癥氨基酸序列MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…對正常DNA和鐮刀形細胞貧血癥DNA的比較發現，單個堿基取代足以將正常血紅素基因轉變為異常血紅素基因，而后者已知可以引起嚴重的鐮刀形細胞貧血癥。Gag密碼子突變為gtg密碼子導致酸性氨基酸谷氨酸被非極性氨基酸纈氨酸取代。
為檢測這種突變的存在與否，分離基因組DNA，且必要時在診斷型PCR之前進行傳統形式的PCR擴增。
用于擴增血紅素β鏈基因一部分的引物是基于EMBEL搜索程序對獨特標示EMBL-IDHSBETGLOB′搜索后給出的DNA序列而得到的。
血紅素β鏈基因(以下表示為分隔的三聯體)之前有一個內含子序列(內含子1)，之后接以另一個序列(內含子2)，這兩個內含子均以斜體表示如下。
部分內含子(下劃線)可用于構建引物(見下)。
gcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg gtg cac ctg act cct gaggag aag tct gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtggat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc aggggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacc...
此基因編碼序列兩側為非編碼性的內含子；第2內含子將上述編碼序列與處于更下游的下一部分編碼序列分開。
為擴增此基因的第1編碼部分以便隨后進行診斷型PCR，可以使用例如分別與第1和第2內含子退火的一對引物。與引物退火的序列如上以下劃線的斜體表示。
引物l5’-ctagcaacctcaaacagacacc-3’引物25’-gtaaccttgataccaacctgcc-3’這一對引物只用于PCR擴增以獲得更多用于診斷型PCR的DNA模板，因此并不需要生物素化或任何形式的修飾。
由于已知突變的特點，即上述外顯子第6密碼子的單個堿基突變，為進行診斷型PCR，設計了3個引物，它們對應于正常和異常(鐮刀形細胞貧血癥)DNA。
對應于正常血紅素的引物引物N5’-atg gtg cac ctg act cct ga-生物素-OH對應于鐮刀形細胞貧血癥血紅素的引物引物S5’-atg gtg cac ctg act cct gt-生物素-OH對應于該基因另一末端的引物引物25’-gtaaccttgataccaacctgcc-3’(這個引物可以與擴增步驟所用的引物相同；其不需標記或修飾)然后以第1步中的引物和樣品或PCR擴增樣品進行診斷型測試。
進行了兩個PCR反應a)使用引物N+引物2的PCRb)使用引物S+引物2的PCR然后如上述檢測PCR反應a)和b)所得產物中是否存在生物素。
檢測兩個PCR反應a)和b)的結果為以下四種可能之一。
本方法也可以用于診斷多堿基突變，如下所示，同樣以鐮刀形細胞貧血癥為例在β球蛋白基因的第1外顯子中存在一個多堿基突變(以粗體下劃線表示)，其DNA序列如下所示atg gtg cac ctg act cctaacgag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成以下氨基酸序列MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…諸如引物N等上述引物可用于揭示是否存在正常基因。為了檢測潛在突變的存在需要可以檢測這種突變的引物。
其中一個可用的引物對應于突變血紅素如下5′-atggtgcacctgactcctaac-生物素-OH這條引物將會準確鑒定出第6密碼子中的′acc′突變。
另一條可用的引物如下5′-atggtgcacctgactccta-生物素-OH這種引物可用來鑒定第6密碼子中以′a′堿基起始的所有突變。
以正常引物N和一個或多個對應于(即互補于)突變序列的引物進行PCR反應。
這一方法可以用于正常基因的任何已知序列，血紅素鐮刀形細胞突變只是其中一例。當群體中常見的突變已知時，可以使用多種引物以明確查明所存在的突變。
本發明方法的另一用途是從重組分子中切割并分離所需DNA片段以便進一步操作。其中一個相關方面是切割并分離載體DNA以便。克隆及其它生物技術性方法中需要能獲得高質量線性化載體DNA片段的有效方法。正如業內已知的，質粒和病毒等載體中除含有調控復制和轉錄的相應元件外，還含有一或多個克隆位點以便插入異源性DNA并擴增或表達。正如限制酶可用于將異源片段插入克隆載體以制備重組載體，限制酶也可用于切割異源性片段或載體元件以便進一步遺傳學操作。這類載體包含環狀DNA分子。這些包括一個填充片段，通常還有一個多聚接頭以及一個含前述調控序列的片段。在一種方法中，插入了異源性DNA片段的重組載體通過限制酶消化以切割插入的DNA片段，這一過程將會產生線性DNA分子的混合物，包括載體本身的填充片段，插入片段和部分切割的重組DNA分子。本發明方法用于當需要切除異源插入片段之重組DNA分子中的填充(或載體)元件包含特異性蛋白識別序列，如AP-1識別序列時。在本發明方法中，限制酶消化產物在溶液中與此核酸特異性蛋白接觸，此例中應為AP-1，然后使溶液通過蛋白選擇性膜從而捕獲與AP-1結合的核酸分子，只有那些含有異源性插入DNA因此沒有AP-1識別序列的DNA分子存留于溶液中。
在另一個相關的實施方案中，本方法可用來分離載體本身的線性化形式，即通過限制酶消化而線性化并已切除填充片段的載體以便進一步操作。這類載體片段可隨后用于插入并連接異源性DNA，環化后又可繼續使用，如轉化宿主細胞。
在一實例中，填充片段是或包含帶有唯一限制酶識別位點的多聚接頭。該載體用所述酶之一切割而產生線性化分子。然后使用前述酶學技術可以在這些線性分子末端進行標記。為使后續操作簡化，優選此唯一切割酶是可產生3′突出端的限制酶。此時，線性載體分子可以通過加入標記的核苷酸如利用TdT加入生物素化核苷酸而進行末端標記。如果所述酶產生5′突出端，則需要再加入Klenow片段以延伸3′末端。我們發現這種方法效率較高，特別是當使用了大于10μg的較大量DNA時。在標記了線性載體后，進一步用一個或多個限制酶消化，優選在最初切割位點兩側各有一個的填充片段中具有唯一切割位點的限制酶。這樣可以對末端片段進行標記，并通過本發明方法從填充片段中分離出未標記的所需片段。因此當樣品通過濾膜時，充分切割的載體將會通過薄膜。
在進一步的應用中，本發明的方法可用于從連接混合物中去除非復制型連接產物。使用DNA連接酶對兩個DNA片段進行共價連接是生物技術的中心環節。一般來說，連接反應包括將小DNA片段或插入片段插入到較大的載體DNA中。確保最終的連接產物被正確的環化是非常重要的，因為只有這樣才能避免其在轉化入宿主細胞如細菌后不被降解。因此，線性連接產物是沒有用途的，而且在宿主細菌中也無法存在。不幸的是，連接酶反應的效率并不高，通常只有80％的線性產物可連接。這就降低了大腸桿菌攝取環狀復制型連接產物的效率。從這個角度看，線性產物因此可以看成是連接反應的污染物或副產物。如果能夠在轉化前從反應混合物中去除不需要的線性連接產物，那將會提高連接產物的轉化效率。然而現在沒有可行的方法。由于環狀復制型連接產物的多形性特點，因而其不能通過切割從凝膠中回收。
因此本發明另一方面提供了一種將樣品中線性核酸分子與環狀核酸分子分離的方法，該方法包括在線性核酸分子末端引入標記物，該標記可通過直接與基質作用或通過其結合配對物間接與基質作用而固定于基質上，使樣品與基質接觸，或當所述標記物與基質是間接相互作用時，使樣品與該標記物的簡化配對物以及與基質接觸，從而將上述被標記的線性核酸分子固定于基質上。
本發明方法可用于此例，因為連接混合物中除目的環狀分子以外的所有DNA分子都有游離末端，以及暴露的反應性磷酸基團和羥基。它們可通過前述酶學方法使用標記的核苷酸如生物素化核苷酸進行末端標記。環狀分子由于沒有反應性3′羥基可供標記附著因而不能被標記。這樣，被標記的線性分子可以被基質捕獲從而與存留在溶液中的環化分子分離，這些環狀分子就可以用于后續步驟如轉化宿主細胞。
在本發明另一實施方案中，所述方法可用于噬菌體顆粒如λ噬菌體的體外包裝，如在構建基因文庫以及噬菌體展示文庫時。噬菌體既可以在體外包裝也可以在細菌內包裝，體外包裝時將病毒DNA與各種病毒衣殼蛋白成分在體外混合從而引發病毒裝配，細菌中包裝時病毒DNA被引入適當細菌，由細菌提供病毒裝配所必需的蛋白成分。體外包裝比細菌轉化方法更快捷，因為體外包裝可以在若干分鐘內完成，而細菌轉化方法則需要1-2天。然而與細菌轉化方法相比，體外包裝的效率較低，特別是當被包裝的噬菌體DNA已經被操作過，例如已經插入了異源性DNA的λDNA，有實驗表明與未被修飾的線性λ病毒相比，經分子操作后得到的線性DNA的包裝效率可以減少103/μg DNA。這種效率的降低至少部分是由于DNA操作中副產物的存在。因此如果包裝前將這些副產物去除較有利，因為這樣可提高體外包裝的效率，使這種體外包裝方法成為更快捷且更有效的綜合方法從而得以取代細菌轉化的方法。本發明方法可通過使用標記系統標記不需要的片段并使其從所需連接產物中分離而實現上述設想。
本方法得益于噬菌體基因組中存在的cos位點。在λ噬菌體基因組的兩個末端都有一DNA單鏈互補區域，當線性λDNA插入到細菌細胞后，這兩個區域相互退火形成一個環形基因組，這種環形基因組可以復制，并且不象線性DNA那樣易被細菌核酸內切核酸酶降解。
在這個實施方案中，在將異源DNA克隆到λ載體之前，首先通過如加入雙脫氧核苷酸以及適當DNA聚合酶如klenow片段來封閉λ載體的3′末端，klenow片段可以有效的去除3′cos位點的反應性OH而只留下非反應性氫，這樣的末端既不能被延伸也不能被標記。因此在克隆反應結束后，將DNA分子標記上只能加入到3′OH基團的標記物。這樣，只有正確連接的產物沒有3′OH基團且不能被標記；所有其它的DNA分子，包括已切割的載體片段以及將要克隆的片段都有反應性3′OH基團而可以被標記。由于只有正確連接的DNA分子沒有被標記，因而可以使用本文所述的任何方法將這些正確連接的DNA分子很容易地從不需要的副產物中分離出來。
因此本發明另一方面提供了一種重組噬菌體體外包裝的方法，其中載體DNA用一個或多個限制酶切割，載體DNA的3′OH基團被封閉，載體和將被插入的DNA在適合DNA片段連接的條件下相接觸，連接產物用可以附著于反應性3′OH基團的組分標記，隨后分離標記和未標記的分子。
在本文中，封閉3′OH基團是指3′OH基團缺失、或被保護或經某些方式被修飾而因此不能進一步被延伸。
在一個方便的實施方案中，標記物是生物素，其可以通過使用酶學方法如用klenow片段以生物素化核苷酸的形式加入到反應性3′OH基團中。
在一個實施方案中，首先使用諸如雙脫氧核苷酸封閉載體的3′末端，然后使用在載體內部只有單一識別位點的酶切割載體，此識別位點應位于克隆所用的兩個識別位點之間。EcoRI就是這樣的限制酶的一個實例。這個起始限制酶切割的目的在于通過標記去除所有在隨后的步驟中不被切割的載體DNA分子。然后使用兩個分別在載體中只有唯一切割位點的酶在兩個位置切割載體從而形成克隆位點。在產生用于克隆的載體片段以外，也將獲得許多可通過標記(例如當標記為生物素時通過上述鏈霉抗生物素蛋白結合)去除的被部分切割的限制酶切產物。然后將用于克隆的DNA片段連接到λ載體DNA中。為了去除所有不需要的反應產物，所有暴露的3′末端均使用例如生物素進行標記。正確的連接產物因沒有3′OH基團而不能被標記，從而可以通過本文所述方法從所有標記分子中分離出來。
現在參考以下非限制性的實施對本發明進行詳細的介紹。
實施例實施例1對帶有5′突出型DNA末端的限制酶切DNA片段進行末端標記試劑5μg經HindIII切割后的λDNA(Gibco 15612-13)40個單位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μlDNA聚合酶I，Klenow大片段的緩沖液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)5 nmol dATP (Gibco 10216-018)5 nmol dTTP(Gibco 10219-012)5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)蒸餾水100μl反應混合物在25℃保溫45分鐘。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
在Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中加入反應混合物并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
在1％瓊脂糖(FMC#50080)凝膠電泳中分析洗脫物，按Maniatis，分子克隆實驗指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
在凝膠中未見λDNA的痕跡，表明有鏈霉抗生物素蛋白附著的末端帶標記的線性分子已存留在薄膜上。
實施例2有鈍端和3′突出端的DNA片段的末端標記試劑
2μg Low DNA MassTM序列梯(Gibco 10068-013)40個單位末端化雙脫氧核苷酸轉移酶，重組型(Gibco 10533-016)20μl末端化雙脫氧核苷酸轉移酶緩沖液，重組型(Gibco)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)蒸餾水100μl反應混合物在37℃保溫45分鐘。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
在Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中加入反應混合物并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，按Maniatis，分子克隆實驗指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
在凝膠中未見λDNA的痕跡，表明有鏈霉抗生物素蛋白附著的末端帶標記的線性分子已存留在薄膜上。
實施例3通過去除填充片段來制備載體DNA使用Qiagen maxiprep(Qiagen#12166)制備含有待測插入片段的Cantab5E載體(Pharmacia-Amersham 279401-01)Cantab 5E載體含有SfiI、NotI和BsmI的唯一限制位點，其中SfiI和BsmI位點位于NotI位點的兩側。
試劑25μg上述的Cantab 5E載體40個單位的NotI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)的緩沖液用水補平至50μl反應混合物在37℃保溫1小時。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，隨后加入40個單位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μlDNA聚合酶I，Klenow大片段的緩沖液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)用蒸餾水補平至100μl反應混合物在25℃保溫45分鐘。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)。
將反應混合物樣品(5μg)稀釋到50μl并加入到一個Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，按Maniatis，分子克隆實驗指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
在凝膠中未見載體DNA的痕跡，表明所有DNA均已存留在薄膜上。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275140-01)，對每一等分試樣處理如下(1)33μl反應混合物置于一個單獨的試管(1)中，其中再加入20個單位的BsmI(Boehringer-Mannheim 1292315)5μl BsmI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1292315)用蒸餾水補平至50μl反應混合物在65℃保溫1小時。
(2)33μl反應混合物置于一個單獨的試管(2)中，其中再加入20個單位的SfiI(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)
用蒸餾水補平至50μl反應混合物在50℃保溫1小時。
(3)33μl反應混合物置于一個單獨的試管(3)中，其中再加入20個單位的SfiI(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補平至50μl反應混合物在50℃保溫1小時。然后將反應混合物通過一個S400 HRMicroSpin柱，隨后在反應混合物中加入以下試劑20個單位的BsmI(Boehringer-Mannheim 1292315)5μl BsmI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1292315)用蒸餾水補平至50μl反應混合物在65℃保溫1小時。
上述3種反應混合物的每一種分別通過S400 HR MicroSpin柱純化，在每種混合物中加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將每種反應混合物樣品分別加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
3種反應混合物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
只有來自于第3個反應樣品中的純化的載體DNA在凝膠中可見，樣品1和2沒有可檢測到的DNA痕跡。這表明只有正確限制性切割的載體通過了薄膜。
實施例4生物素化PCR片段的限制使用高質量生物素化PCR引物擴增scFV構建體而獲得PCR產物。
上述scFV構建體是800堿基對的片段，其在40和760位堿基處分別有SfiI和NotI的唯一位點。
將1μg的PCR產物與2μg的鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)混合，并在25℃保溫5分鐘。
將反應混合物加入到一個Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
檢測不到任何PCR產物的痕跡，表明所有的PCR產物均已存留在薄膜上。
然后將各等分試樣處理如下(1)3μg的PCR產物加入到一個單獨的試管(1)中，該試管中有20個單位的NotI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液用蒸餾水補平至50μl在37℃保溫1小時。
(2)3μg的另一份PCR產物加入到一個單獨的試管(2)中，該試管中有20個單位的SfiI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補平至50μl在50℃保溫1小時。
(3)3μg的另一份PCR產物加入到一個單獨的試管(3)中，該試管中有20個單位的SfiI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補平至50μl反應混合物在50℃保溫1小時。
將反應混合物通過S400 MicroSpin柱，再加入以下試劑20個單位的NotI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1014714)用蒸餾水補平至50μl并在37℃保溫1小時。
上述3種反應混合物的每一種分別通過S400 HRMicroSpin柱純化，在每種混合物中加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將每種反應混合物樣品分別加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
只有來自于第3個反應樣品中的純化的PCR產物在凝膠中可見，樣品1和2沒有可檢測到的DNA痕跡。這表明含有末端的片段存留在薄膜上，而內部片段通過了薄膜。
實施例5非生物素化PCR片段的限制性切割使用高質量生物素化PCR引物擴增scFV構建體而獲得PCR產物。
1μg的PCR產物與2μg的鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)混合，并在25℃保溫5分鐘。
將反應混合物加入到一個Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
在凝膠中檢測到PCR產物，表明PCR產物并未存留在薄膜上。
在3μgPCR產物中加入以下試劑40個單位的末端化雙脫氧核苷酸轉移酶，重組型(Gibco 10533-016)20μl末端化雙脫氧核苷酸轉移酶緩沖液，重組型(Gibco)5nmol生物素-14-dCTP(Gibco 19518-018)用蒸餾水補平至100μl37℃保溫45分鐘。
將反應混合物通過S200 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將反應混合物加入到Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于2％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
在凝膠中檢測不到PCR產物，表明PCR產物已存留在薄膜上。
然后對3種等分試樣處理如下(1)3μg的PCR產物加入到一個單獨的試管(1)中，該試管中有20個單位的NotI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液用蒸餾水補平至50μl并在37℃保溫1小時。
(2)3μg的另一份PCR產物加入到一個單獨的試管(2)中，該試管中有20個單位的SfiI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補平至50μl并在50℃保溫1小時。
(3)3μg的另一份PCR產物加入到一個單獨的試管(3)中，該試管中有20個單位的SfiI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1288032)5μl SfiI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1288032)用蒸餾水補平至50μl并在50℃保溫1小時。
將此種反應混合物通過S400 MicroSpin柱，再加入以下試劑20個單位的NotI內切核酸酶(Boehringer-Mannheim 1014714)5μl NotI緩沖液(Boehringer-Mannheim 1014714)
用蒸餾水補平至50μl并在37℃保溫1小時。
上述3種反應混合物的每一種分別通過S400 HR MicroSpin柱純化，在每種混合物中加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將每種反應混合物樣品分別加入Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，用溴化乙錠染色。
只有來自于第3個反應樣品中的純化的PCR產物在凝膠中可見，樣品1和2沒有可檢測到的DNA的痕跡，這表明含有末端的片段存留在薄膜上，而內部片段通過了薄膜。
實施例6從環狀和線性DNA分子的群體中去除線性DNA環狀DNA起始物質是pUC19克隆載體，其在多聚接頭克隆位點處有唯一的HindIII位點。
將5μg pUC19載體DNA(New England Biolabs#301-1S)加入40個單位的HindIII限制酶(New England Biolabs#104S)5μl HindIII緩沖液(New England Biolabs)用蒸餾水補平至50μl并在37℃保溫1小時。
將反應混合物通過S400 HR MicroSpin柱，然后加入到5μl pUC19載體DNA(New England Biolabs#301-1S)40個單位的DNA聚合酶I，Klenow大片段(New England Biolabs#210S)10μl DNA聚合酶I，Klenow大片段的緩沖液(New England Biolabs)5 nmol生物素-14-dCTP(Gibco 195 18-018)5 nmol dATP(Gibco 10216-018)5 nmol dTTP(Gibco 10219-012)
5 nmol dGTP(Gibco 10218-014)用蒸餾水補平至100μl反應混合物在25℃下保溫45分鐘。
將反應混合物通過S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，加入10μg鏈霉抗生物素蛋白(Promega#7041)并在25℃保溫5分鐘。
將反應混合物加入到Centriflex柱(Edge Biosystems#73883)中，并按生產商所描述的方法使其擴散入薄膜中，隨后10000xg離心30秒。在薄膜上加10μl蒸餾水，水平翻轉180°并再次10000xg離心。
為觀察，洗脫物于1％的瓊脂糖(FMC#50080)凝膠中電泳，按Maniatis，分子克隆實驗指南，第2版，1989中所述方法用溴化乙錠染色。
凝膠(FMC#50080)上只檢測到環狀載體，表明環狀載體通過了薄膜，而線性DNA存留在薄膜上。
實施例7使用預先切割的λ載體體外包裝λ噬菌體使用預切割的λ載體Uni-ZAPXR(Stratagene，產品目錄號236612)。
試劑10μg預切割的λ載體雙脫氧鳥苷三磷酸(終濃度為200μM)雙脫氧腺苷三磷酸(終濃度為200μM)Klenow片段(10個單位)NEB EcoPol緩沖液總體積為30μl反應混合物在24℃保溫20分鐘。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱以去除蛋白和核苷酸，純化后的反應混合物中加入200ng預先制備的DNA插入片段T4 DNA連接酶NEB T4連接酶的緩沖液體積為40μl反應混合物在16℃保溫48小時。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱，純化后的反應混合物中加入生物素化dCTP(5 nmol)生物素化dATP(5 nmol)dTTP(終濃度為200μM)dGTP(終濃度為200μM)Klenow片段(10個單位)NEB緩沖液體積為50μl反應混合物在24℃保溫20分鐘。
將反應混合物通過S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，并按照實施例2中的方法在純化的反應混合物中加入鏈霉抗生物素蛋白并將反應混合物加入到Centriflex柱中。
進一步的操作應按照Stratagene公司提供的包裝插入片段的操作指導進行。對細菌板的嗜菌斑計數顯示，所述連接比標準方法得到更多的活性噬菌體。
實施例8使用未切割的λ載體體外包裝λ噬菌體使用含有一個待測插入片段的未切割的λ載體Uni-ZAPXR(Stratagene)。
試劑5μg未切割的λ載體雙脫氧鳥苷三磷酸(終濃度為200μM)雙脫氧腺苷三磷酸(終濃度為200μM)Klenow片段(10個單位)NEB緩沖液總體積為20μl反應混合物在24℃保溫20分鐘。此步驟將封閉載體的3′末端。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱，在純化后的反應混合物中加入EcoRI限制性內切核酸酶(20個單位)
NEB EcoRI緩沖液總體積為30μl。
反應混合物在37℃保溫120分鐘。此步驟將載體消化成適當的等長片段。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱，在純化后的反應混合物中加入生物素化dATP(5 nmol)dTTP(終濃度為200μM)dCTP(終濃度為200μM)dGTP(終濃度為200μM)Klenow片段(10個單位)NEB緩沖液體積為40μl反應混合物在24℃保溫30分鐘。此反應中，生物素將標記EcoRI消化的λ載體。
在反應混合物中加入NEB 2緩沖液中的Xbal和Xhol限制性內切核酸酶(各20個單位)，總體積為50μl。此反應將形成克隆位點。
反應混合物在37℃保溫60分鐘。
將反應混合物通過S400 HR MicroSpin柱(Pharmacia-Amersham275120-01)，并按照實施例2中的方法在純化的反應混合物中加入鏈霉抗生物素蛋白并加入到Centriflex柱中。此步驟中，鏈霉抗生物素蛋白將結合未被切割的載體。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱，純化后的反應混合物中加入200 ng預先制備的DNA插入片段T4 DNA連接酶NEB T4連接酶的緩沖液體積為60μl反應混合物在16℃保溫48小時。
將反應混合物通過一個S400 HR MicroSpin柱，純化后的反應混合物中加入生物素化dCTP(5 nmol)生物素化dATP(5 nmol)dTTP(終濃度為200μM)dGTP(終濃度為200μM)Klenow片段(10個單位)NEB緩沖液體積為70μl反應混合物在24℃保溫20分鐘。此反應中，所有以前未封閉的暴露的3′OH末端可以被標記。
將反應混合物通過S400 HR MicroSpin柱，并按照實施例2中的方法在純化的反應混合物中加入鏈霉抗生物素蛋白并加入到Centriflex柱中。此步驟將標記分子從未標記分子中分離出來。
進一步的操作應按照Stratagene公司提供的包裝插入片段的操作指導進行。對細菌的嗜菌斑計數顯示，所述連接比標準方法得到更多的活性噬菌體。
實施例9純化再擴增的PCR反應a)修飾Cantab5E載體(Pharmacia)從而獲得Cantab5EBamHI(1)在100μl的總反應體積中加入10個單位的BamHI和10μl NEBBamHI緩沖液以切割Cantab5E載體(1μg)，體系在37℃保溫1小時。在1％瓊脂糖凝膠中分離反應混合物并用普通凝膠提取方法分離出分子量最大的片段。在分離所得大片段500 ng中加入1 Weiss單位的T4 DNA連接酶和5μl NEB連接酶緩沖液并使總反應體積為50μl，體系在24℃保溫1小時。用電穿孔的方法將連接混合物轉化入TGI細胞中，并將細菌細胞在含氨芐青霉素(100μg/ml)的瓊脂板上保溫過夜。分離形成克隆的細菌中的DNA并通過大小和限制性內切核酸酶切割驗證其只含一個BamHI限制位點。此DNA命名為Cantab5EBamHI(1)。
b)使用修飾后的載體Cantab5EBamHI(1)為模板進行PCR試劑
10μg Cantab5EBamHI(1)載體dNTP混合物(由Finnzyme提供；終濃度為200μM)10μl expand高保真酶的緩沖液(Boehringer-Mannheim AG)30 pmol與唯一的afiIII限制位點部分重疊的引物1和30 pmol與唯一的BamHI限制位點部分重疊的引物2用蒸餾水補平至100μl在加入1μl expand高保真酶(Boehringer-Mannheim AG)之前將PCR反應物96℃加熱2分鐘。
在熱循環僅上對反應混合物進行20個循環，條件如下-首先96℃2分鐘，然后按如下方式進行20個循環-55℃，30秒-72℃，80秒-96℃，30秒。
瓊脂糖凝膠電泳后用溴化乙錠染色的方法鑒定PCR產物。通常可以觀察到不需要的副產物。
將熱循環反應混合物通過S400 HR MicroSpin柱。
使用限制性內切核酸酶AflIII和BamHI以常規操作對純化的PCR產物進行酶切，隨后加入鏈霉抗生物素蛋白并將反應混合物加入到Centriflex柱中(如實施例2)。在瓊脂糖凝膠電泳結果中只能觀察到正確切割的PCR產物，因為不需要的雜質存留在蛋白結合基質上。
實施例10在對鐮刀形細胞貧血癥的診斷型PCR中使用含生物素的DNA正常人血紅素A1中單元型A1β-球蛋白基因的第1外顯子(編碼部分)以如下所示的DNA序列開始正常DNAatg gtg cac ctg act cct gag gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…上述核酸序列將翻譯成正常氨基酸序列MVHLTPEEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…
對于人類鐮刀形細胞貧血癥，單元型Sβ-球蛋白基因的第1外顯子以如下所示的DNA序列開始鐮刀形細胞貧血癥DNAatg gtg cac ctg act cct gtg gag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…上述核酸序列將翻譯成鐮刀形細胞貧血癥氨基酸序列MVHLTPVEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…對正常DNA和鐮刀形細胞貧血癥DNA的比較發現，單個堿基取代足以將正常血紅素基因轉變為異常血紅素基因，而后者已知可以引起嚴重的鐮刀形細胞貧血癥。Gag密碼子突變為gtg密碼子導致酸性氨基酸谷氨酸被非極性氨基酸纈氨酸取代。
為檢測這種突變的存在與否，分離基因組DNA，且必要時在診斷型PCR之前進行傳統形式的PCR擴增。
實施例10(a) 患者DNA的分離用商品化試劑盒(GFX Genomic Blood DNA純化試劑盒；Pharmacia-Amersham #27-9603-01)按照生產商的建議從患者血液樣本中分離基因組DNA。
如果獲得了足夠的DNA，可以直接進行實施例10c中的步驟。如果沒有獲得足夠的DNA，需擴增部分的血紅素β鏈基因(實施例10b)。
實施例10(b)擴增步驟(可選，材料不足時必需)將實施例10a分離得到的DNA擴增以增加可用于進一步操作的DNA的量，如下所示。
250 ng基因組DNA10μl expand高保真酶的緩沖液20 nmol dNTP各20 pmol的兩種引物(引物1和引物2；見下)用蒸餾水補平至100μl3個單位的Expand高保真PCR酶混合后，在以下標準條件下進行30輪PCR
96℃熱起始56℃退火30秒72℃聚合1分鐘96℃變性30秒用于擴增血紅素β鏈基因一部分的引物是基于EMBEL搜索程序對獨特標示EMBL-IDHSBETGLOB′搜索后給出的DNA序列而得到的。
血紅素β鏈基因(以下表示為分隔的三聯體)之前有一個內含子序列(內含子1)，之后接以另一個序列(內含子2)，這兩個內含子均以斜體表示如下。
部分內含子(下劃線)可用于構建引物(見下)。
gcataaaagtcagggcagagccatctattgcttacatttgcttctgacacaactgtgttcactagcaacctcaaacagacaccatg gtg cac ctg act cct gaggag aag tct gcc gtt act gcc ctg tgg ggc aag gtg aac gtggat gaa gtt ggt ggt gag gcc ctg ggc aggggcaggttggtatcaaggttacaagacaggtttaaggagaccaatagaaactgggcatgtggagacagagaagactcttgggtttctgataggcactgactctctctgcctattggtctattttcccacc...
此基因編碼序列兩側為非編碼性的內含子；第2內含子將上述編碼序列與處于更下游的下一部分編碼序列分開。
為擴增此基因的第1編碼部分以便隨后進行診斷型PCR，可以使用例如分別與第1和第2內含子退火的一對引物。與引物退火的序列如上以下劃線的斜體表示。
引物15′-ctagcaacctcaaacagacacc-3′引物25′-gtaaccttgataccaacctgcc-3′這一對引物只用于PCR擴增以獲得更多用于診斷型PCR的DNA模板，因此并不需要生物素化或任何形式的修飾。
實施例10c 診斷型PCR步驟1-引物的構建由于已知突變的特點，即上述外顯子第6密碼子的單個堿基突變，為進行診斷型PCR，設計了3個引物，它們對應于正常和異常(鐮刀形細胞貧血癥)DNA。
對應于正常血紅素的引物
引物N5′-atg gtg cac ctg act cct ga-生物素-OH對應于鐮刀形細胞貧血癥血紅素的引物引物S5′-atg gtg cac ctg act cct gt-生物素-OH對應于該基因另一末端的引物引物25′-gtaaccttgataccaacctgcc-3′(這個引物可以與擴增步驟所用的引物相同；其不需標記或修飾)步驟2-使用步驟1的引物和實施例10b的PCR產物進行診斷型檢測在與實施例10b相同的條件下進行了兩個PCR反應a)使用引物N+引物2的PCR100 ng實施例10b的PCR產物DNA10μl expand高保真緩沖液20 nmol dNTP各20 pmol的擴增引物(引物N和引物2)3個單位的Expand高保真PCR酶用水補平至100μlb)使用引物S+引物2的PCR除使用擴增引物AB代替引物N外，其它均與PCR反應(a)相同。
然后按照實施例1中所述方法，使用S400HR MicroSpin柱純化由PCR反應a)和b)獲得的PCR產物。然后按照實施例1中所述的方法通過centriflex薄膜檢測產物中是否存在生物素。將反應混合物分為兩部分。在9/10的反應混合物中加入過量的鏈霉抗生物素蛋白(5μg)，并按照實施例1中所述方法在25℃下保溫5分鐘，然后加到一張centriflex薄膜上。按照實施例1中所述的方法，在瓊脂糖凝膠中分析收集到的洗脫物中是否存在DNA產物。另1/10未與鏈霉抗生物素蛋白接觸的反應混合物作為對照樣品于瓊脂糖凝膠中平行電泳。
檢測兩個PCR反應a)和b)的結果為以下四種可能之一。
本方法也可以用于診斷多堿基突變，如下所示，同樣以鐮刀形細胞貧血癥為例實施例11對鐮刀形細胞貧血癥的診斷型PCR(多堿基突變)在β球蛋白基因的第1外顯子中存在一個多堿基突變(以粗體下劃線表示)，其DNA序列如下所示atg gtg cac ctg act cctaacgag aag tct gcc gtt act gccctg tgg ggc aag gtg aac gtg gat gaa gtt ggt ggt gag gccctg ggc agg…以上核酸序列將翻譯成以下氨基酸序列MVHLTPNEKSAVTALWGKVNVDEVGGEALG…雖然有3個堿基發生改變，但可用類似于實施例10的方法檢測突變。
如實施例10，用引物N揭示是否存在正常基因。為了檢測潛在存在的突變構建了兩個引物。
對應于突變的血紅素的引物如下所示引物AB 2a5′-atggtgcacctgactcctaac-生物素-OH該引物將會準確鑒定出第6密碼子中的′acc′突變。
第2個引物為引物AB 2b5′-atggtgcacctgactccta-生物素-OH此引物可鑒定出第6密碼子中以′a′堿基起始的所有突變。
在與實施例10相同的條件下，以正常引物N和一個或多個對應于(即互補于)突變序列的引物進行PCR反應。
這一方法可以用于正常基因的任何已知序列，血紅素鐮刀形細胞突變只是其中一例。當群體中常見的突變已知時，可以使用多種引物以明確查明所存在的突變。
實施例12-22重復實施例1-11，只是用帶有NycoCard的蛋白結合薄膜代替centriflex柱以去除或分離帶有生物素標記并與鏈霉抗生物素蛋白形成復合體的DNA分子。
序列表<110>Nycomed Pharma ASIhle，OysteinMichaelsen，Terje EinarJohne，BeritGrant，Anne R<120>將核酸分離成不同群體的方法<130>28.69235/001<140>PCT/GB99/03995<141>1999-11-30<150>GB9826247.0<151>1998-11-30<160>26<170>PatentIn Ver. 2.1<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述BamHI引物的靶片段<400>1tttactggat cctag 15<210>2<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述AsnI引物的靶片段<400>2ttacgtacat taatcgg17<210>3<211>17<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述AsnI引物的靶片段<400>3ccgattaatg tacgtaa 17<210>4<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正確的限制性位點<400>4ttacgtacaa tcgg14<210>5<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正確的限制性位點<400>5tttactggta g 11<210> 6<211>12<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中不正確的限制性位點<400>6tttactggat ag 12<210>7<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述片段中正確的限制性位點(互補鏈)<400>7gatccagtaa a11<210>8<211>13<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正確的限制性片段(互補鏈)<400>8ttaatgtacg taa 13<210>9<211>11<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正確的限制性片段(互補鏈)<400>9ctaccagtaa a11<210>10<211>14<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述不正確的限制性片段(互補鏈)<400>10ccgattgtac gtaa 14<210>11<211>17<212>DNA<213>人<400>11atgacctagg accacct 17<210>12<211>17<212>DNA<213>人<400>12atgacctagg cccacct 17<210>13<211>93<212>DNA<213>人<400>13atggtgcacc tgactcctga ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>14<211>30<212>PRT<213>人<400>14Met Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp1 5 10 15Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>15<211>93<212>DNA<213>人<400>15atggtgcacc tgactcctgt ggagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>16<211>30<212>PRT<213>人<400>16Met Val His Leu Thr Pro Val Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp15 10 15Gly Lys Val Asn Val Asp Glu Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>17<211>306<212>DNA<213>人<400>17gcataaaagt cagggcagag ccatctattg cttacatttg cttctgacac aactgtgttc 60actagcaacc tcaaacagac accatggtgc acctgactcc tgaggagaag tctgccgtta 120ctgccctgtg gggcaaggtg aacgtggatg aagttggtgg tgaggccctg ggcaggggca 180ggttggtatc aaggttacaa gacaggttta aggagaccaa tagaaactgg gcatgtggag 240acagagaaga ctcttgggtt tctgataggc actgactctc tctgcctatt ggtctatttt 300cccacc306<210>18<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>18ctagcaacct caaacagaca cc 22<210>19<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>19gtaaccttga taccaacctg cc 22<210>20<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>20atggtgcacc tgactcctga 20<210>21<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>21atggtgcacc tgactcctgt 20<210>22<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>22gtaaccttga taccaacctg cc 22<210>23<211>93<212>DNA<213>人<400>23atggtgcacc tgactcctaa cgagaagtct gccgttactg ccctgtgggg caaggtgaac 60gtggatgaag ttggtggtga ggccctgggc agg 93<210>24<211>30<212>PRT<213>人<400>24Met Val His Leu Thr Pro Asn Glu Lys Ser Ala Val Thr Ala Leu Trp1510 15Gly Lys Val Asn Val Asp G1u Val Gly Gly Glu Ala Leu Gly20 25 30<210>25<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>25atggtgcacc tgactcctaa c21<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>26atggtgcacc tgactccta 19
權利要求
1.一種可以將樣品中的核酸分子至少部分分離成各個群體的方法，其中一個群體已被或可以被能固定于基質上的組分標記，上述方法包括將含有核酸的樣品與基質接觸，基質借此捕獲標記分子從而使其與未標記的分子分離。
2.權利要求1的方法，其中一個分子群體已被或可以被固定于基質上的組分標記，所述組分能直接或通過所述標記物的結合配對物而間接固定于基質上，上述方法包括將含有核酸的樣品與基質接觸，或當所述標記物與基質是通過結合配對物間接相互作用時，使含有核酸的樣品與所述標記物的結合配對物以及基質接觸，從而由所述基質捕獲標記分子并使標記分子與未標記的分子分離。
3.以上任一權利要求的方法，其中所述標記物是可加入核酸分子中的組分或與核酸分子有親和性的組分。
4.以上任一權利要求的方法，其中所述標記物直接與基質相互作用。
5.權利要求1-3中任一項的方法，其中所述標記物通過該標記物的結合配對物間接作用于基質。
6.以上任一權利要求中的方法，其中所述標記物是一種配基。
7.權利要求6中的方法，其中所述配基選自生物素或熒光素。
8.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述標記物是類固醇或類固醇樣分子。
9.權利要求8中的方法，其中所述類固醇是地高辛配基。
10.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述標記物是一種抗原。
11.權利要求1-5中任一項的方法，其中所述標記物是一種蛋白。
12.權利要求11中的方法，其中所述蛋白是一種核酸結合蛋白。
13.權利要求1-5任一項的方法，其中所述標記物是一種核酸分子。
14.權利要求1-7中任一項的方法，其中所述標記物是生物素，且所述標記物由鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白捕獲。
15.以上任一權利要求中的方法，其中所述基質的形式是薄層，凝膠，濾膜，膜，纖維，管，微量滴定板，柱或顆粒。
16.權利要求15中的方法，其中所述基質是多孔材料。
17.權利要求16中的方法，其中將所述基質加入一種分離設備，所述設備選自離心管、微量滴定板、套筒和注射器。
18.權利要求15-17中任一項的方法，其中在所述多孔材料上放置一吸收墊，在所述吸收墊遠離所述多孔材料的一面放置一個不能滲透液體的薄層，而在所述多孔材料遠離所述吸收墊的一面放置一個帶有一或多個空洞的不能滲透液體的薄層，從而待測樣品可上樣于所述空洞之一并可通過所述吸收墊的吸收而橫向擴散至整個多孔材料。
19.以上任一權利要求中的方法，其用于至少部分分離限制酶消化產物，或用于純化PCR反應產物。
20.以上任一權利要求中的方法，其用于至少部分分離DNA之限制酶消化片段混合物的方法，其中起始材料是線性DNA分子，在其一個末端或兩個末端處或附近已被或可以被能固定于基質上的組分標記，所述方法包括用限制酶消化DNA分子，然后使樣品與基質接觸，借此使來自起始材料某個末端的標記分子被基質捕獲從而使其與未標記的分子分離。
21.以上任一權利要求中的方法，其用于使所需正確PCR擴增產物與PCR引物與模板不正確退火造成的PCR產物至少部分分離，其中模板核酸分子在其一個末端處或附近含有一個唯一的限制酶識別位點，已被或可以被標記之PCR引物與模板上部分延伸至所述唯一限制酶位點的序列互補，此方法包括通過PCR擴增模板，使用特異作用于上述唯一限制酶識別位點的限制酶消化PCR產物，以及將所得產物與能固定所述標記物的基質接觸，以使標記的核酸分子被該基質捕獲，從而與未標記的分子分離。
22.權利要求21中的方法，其中所述標記物附著于引物的5′末端。
23.權利要求1到18中任一項的方法，其用于診斷型PCR。
24.權利要求23的診斷型PCR方法，該方法中對待測樣品分別進行PCR反應，其中如果有突變則該突變應位于與3′引物互補的序列中，第一PCR反應使用與正常靶核酸互補的3′引物而第二PCR反應使用與突變的靶核酸互補的3′引物，其中突變引物的3′核苷酸對應于突變核酸中已突變的核苷酸之一，上述每一3′引物均在其3′核苷酸處攜有標記物或可以被標記，此方法對PCR反應產物中標記物的存在或缺失進行檢測。
25.權利要求23中對核酸分子中的突變實施診斷型PCR的方法，其中對核酸樣品中突變的存在或缺失進行檢測，其中使用特異性針對正常核酸或突變核酸的3′引物，其中所述引物互補于在正常和突變型DNA之間有一個堿基差異的核酸區域，所述引物的3′末端對應于樣品中正常型與突變型有差異的位置，所述引物已被或可以被標記，該方法對PCR產物中所述標記物的存在或缺失進行檢測。
26.權利要求23的診斷型PCR方法，其中使用互補于正常靶DNA的引物對待測樣品進行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物與一段其3′端核苷酸在突變體中已突變的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸處或其上攜有標記或能被標記，該方法對PCR反應產物中所述標記物的存在進行檢測。
27.權利要求1-18中任一項的方法，其用于使線性DNA分子與環狀DNA分子分離。
28.權利要求27中將樣品中的線性核酸分子與環狀核酸分子分離的方法，所述方法包括在線性核酸分子的末端引入標記物，所述標記物能通過直接與基質作用或借該標記物的結合配對物間接與基質作用而被固定于基質上，使樣品與基質接觸，或當所述標記物與基質間接作用時，使樣品與所述標記物的結合配對物以及與基質接觸，從而使所述標記的線性核酸分子固定于基質上。
29.權利要求1-18中任一項的方法，其用于噬菌體顆粒的體外包裝。
30.權利要求29的方法，其用于重組噬菌體的體外包裝，其中所述載體DNA用一或多種限制酶切割，該載體DNA的3′OH基團被封閉，該載體與待插入的DNA在適于DNA片段連接的條件下相接觸，所得連接產物用能附于反應性3′OH基團的組分進行標記，然后使標記和未標記的分子分離。
31.一種可以將樣品中的核酸分子至少部分分離成各個群體的方法，其中一個群體已被或可以被能固定于基質上的組分標記，此組分直接固定于基質上或通過其結合配對物而間接固定，所述方法包括將含有核酸的樣品與基質接觸，或當所述標記物與基質為間接相互作用時使樣品與標記物的結合配對物及與基質接觸，從而使標記分子由所述基質捕獲并因此與未標記的分子分離。
32.一種對DNA的限制酶消化片段的混合物進行至少部分分離的方法，其中起始材料是線性DNA分子，在其一個末端或兩個末端處或附近已被或可以被能固定于基質上的組分標記，所述方法包括用限制酶消化DNA分子，然后使樣品與基質接觸，借此使來自起始材料某個末端的標記分子被基質捕獲從而使其與未標記的分子分離。
33.一種用于使所需正確PCR擴增產物與PCR引物與模板不正確退火造成的PCR產物至少部分分離的方法，其中模板核酸分子在其一個末端處或附近含有一個唯一的限制酶識別位點，已被或可以被標記之PCR引物與模板上部分延伸至所述唯一限制酶位點的序列互補，此方法包括通過PCR擴增模板，使用特異作用于上述唯一限制酶識別位點的限制酶消化PCR產物，以及將所得產物與能固定所述標記物的基質接觸，以使標記的核酸分子被該基質捕獲，從而與未標記的分子分離。
34.一種診斷型PCR方法，該方法中對待測樣品分別進行PCR反應，其中如果有突變則該突變應位于與3′引物互補的序列中，第一PCR反應使用與正常靶核酸互補的3′引物而第二PCR反應使用與突變的靶核酸互補的3′引物，其中突變引物的3′核苷酸對應于突變核酸中已突變的核苷酸之一，上述每一3′引物均在其3′核苷酸處攜有標記物或可以被標記，此方法對PCR反應產物中標記物的存在或缺失進行檢測。
35.一種對核酸分子中的突變實施診斷型PCR的方法，其中對核酸樣品中突變的存在或缺失進行檢測，其中使用特異性針對正常核酸或突變核酸的3′引物，其中所述引物互補于在正常和突變型DNA之間有一個堿基差異的核酸區域，所述引物的3′末端對應于樣品中正常型與突變型有差異的位置，所述引物已被或可以被標記，該方法對PCR產物中所述標記物的存在或缺失進行檢測。
36.一種診斷型PCR方法，其中使用互補于正常靶DNA的引物對待測樣品進行PCR，其中用于延伸所述靶3′末端的引物與一段其3′端核苷酸在突變體中已突變的序列退火，所述3′引物在3′核苷酸處或其上攜有標記或能被標記，該方法對PCR反應產物中所述標記物的存在進行檢測。
37.一種將樣品中的線性核酸分子與環狀核酸分子分離的方法，所述方法包括在線性核酸分子的末端引入標記物，所述標記物能通過直接與基質作用或借該標記物的結合配對物間接與基質作用而被固定于基質上，使樣品與基質接觸，或當所述標記物與基質間接作用時，使樣品與所述標記物的結合配對物以及與基質接觸，從而使所述標記的線性核酸分子固定于基質上。
38.一種重組噬菌體體外包裝的方法，其中所述載體DNA用一或多種限制酶切割，該載體DNA的3′OH基團被封閉，該載體與待插入的DNA在適于DNA片段連接的條件下相接觸，所得連接產物用能附于反應性3′OH基團的組分進行標記，然后使標記和未標記的分子分離。
全文摘要
一種可以將樣品中的核酸分子至少部分分離成各個群體的方法,其中一個群體已被或可以被能固定于基質上的組分標記,上述方法包括將含有核酸的樣品與基質接觸,基質借此捕獲標記分子從而使其與未標記的分子分離。本方法可以用于多種不同的用途,包括分離限制性內切核酸酶消化產物,從環狀核酸分子中分離出線性核酸分子,噬菌體顆粒的體外包裝,診斷型PCR。
文檔編號C12QGK1344331SQ9981576
公開日2002年4月10日 申請日期1999年11月30日 優先權日1998年11月30日
發明者奧伊斯坦·伊爾, 特杰·E·邁克爾森, 貝里特·約翰尼 申請人:尼康姆德法爾馬公司