專利名稱：核酸的固相分離法的制作方法
技術領域：
本發明涉及核酸的分離，具體地說是一種將固相細胞分離步驟與固相DNA分離步驟相結合從細胞中分離DNA的方法。
在許多生物化學和診斷方法中，核酸的分離是重要的一步。例如，只有將核酸從它們通常所處的復雜混合物中分離出來后才能進行例如檢測、克隆、測序、擴增、雜交、cDNA合成等其他研究和過程；混合物中含大量諸如細胞、蛋白質或碳水化合物之類雜質，常會妨礙分子生物學中的許多反應和技術。此外，DNA會污染RNA制劑，反之亦然。所以，從諸如細胞和組織等復雜混合物中分離核酸的方法不僅為制備所需要，而且為目前使用的許多基于DNA或RNA鑒定的方法所需要，例如微生物感染的診斷、法醫學、組織和血液分型、遺傳變異的檢測等。
目前，DNA或RNA鑒定已被廣泛用于區分不同細胞或細胞類型或相同細胞含DNA突變的變體。所以，通常用抗體鑒定特征性表面抗原來進行的HLA分型可以換成鑒定編碼所述抗原的DNA。微生物感染或污染可以通過檢測靶生物的核酸分析來鑒定，而不是依賴于用形態學或生物化學方法檢測微生物細胞的特征。遺傳變異也可以用類似的方法來鑒定。
一般的說，DNA或RNA是通過在足以確保低水平非特異性雜交的嚴謹條件下與一種或多種寡核苷酸的雜交來檢測的。通常，發生雜交的核苷酸成對地作為引物用于目前各種形式的體外擴增，主要是聚合酶鏈反應(PCR)，但也包括連接酶擴增反應(LAR)、自身維持序列復制(3SR)和Q-β復制酶擴增系統。擴增后，可以通過Sanger法等進一步測序鑒定DNA的特征。擴增和測序可以組合在一起。
如前所述，各種方法都需要最初的核酸分離步驟，將核酸與蛋白質等會干擾雜交和擴增技術的物質相分離。
已知有許多分離核酸的方法，但總的說來，它們都依賴于一系列復雜的抽提和洗滌步驟，既費時又費事。
從諸如血液或血制品或組織等復雜的起始物質中分離核酸的經典方法包括用除垢劑或離液劑，可能在蛋白質降解酶存在下，裂解生物材料，然后用有機溶劑(例如苯酚和/或氯仿)抽提數次，乙醇沉淀，離心和核酸透析。這些方法不僅費事費時，而且較多的步驟增加了降解、樣品損失或在同時處理多份樣品時樣品交叉污染的可能性，所以一直以來都在試圖改進分離核酸的方法，最近提出了依賴于使用固相的其他方法。例如，在美國專利5,234,809說明的方法中，核酸在例如胍鹽等離液劑存在下與二氧化硅顆粒形式的固相結合，由此與樣品中的其余物質相分離。WO91/12079說明的方法中，核酸通過沉淀被固相的表面所捕獲。通常，使用醇類和鹽類作為沉淀劑。
雖然這些方法加快了核酸分離過程，但是仍然需要更快和更簡單的方法以便獲得無損耗的良好得率，尤其是便于修改以適用于在核酸濃度可能很低的混合物或環境中從細胞中分離核酸，作為在以核酸為基礎的細胞檢測過程中從靶細胞中分離核酸的第一制備步驟。本發明滿足了這一需要。具體地說，雖然例如PCR等基于雜交的技術和其他基于核酸的技術能夠高靈敏度地檢測出樣品或樣品制劑等中的細胞，但是靶細胞濃度和核酸純度是此類方法達到高靈敏度和高再現性的關鍵因素。目前，通常先通過過濾、離心或親和性結合固定于固相的抗體來從樣品中分離細胞。如此將細胞濃縮之后，再從濃縮細胞中純化DNA，一般是通過前述經典的苯酚/氯仿抽提法，但伴有他們附帶的缺點。
現在，我們提出一種解決這一問題的新方法，該方法通過將同一固相即用于細胞吸附又用于核酸純化，將細胞分離與核酸純化結合成“一步”。該方法是如下實現的，首先使細胞與固相支持物結合，然后在可使細胞裂解和結合的條件下使用同一固相支持物，使核酸與支持物結合。
如此，可以在45分鐘之內簡單而迅速地從樣品中分離出核酸，成為適合擴增或其他下游過程的形式。
所以，本發明內容之一提供了一種從細胞樣品中分離核酸的方法，它包括(a)使所述樣品中的細胞與固相支持物結合以從樣品中分離出細胞；(b)裂解分離細胞；(c)使經所述裂解的細胞釋放出的核酸與前述同一固相支持物結合。
核酸可以是DNA、RNA或他們的天然或人工修飾形式，以及它們的混合物。但是，核酸以DNA為佳，可以是單鏈、雙鏈或任何其他形式，例如線形或環狀。
“細胞”一詞在此包括所有原核細胞(包括古細菌)和真核細胞，以及諸如病毒和支原體等其他活性生物體，還包括諸如細胞器等亞細胞組分。所以，代表性“細胞”包括各類哺乳動物和非哺乳動物細胞，植物細胞，原生質體，細菌，原生動物和病毒。
所以，樣品可以是包含上述細胞內核酸的各種材料，包括例如食物和及相關產品，臨床和環境樣品。所以，樣品可能是生物樣品，其中含各種病毒或細胞物質，包括各種原核和真核細胞、病毒、噬菌體、支原體、原生質體和細胞器。所以，這些生物材料可包含各類哺乳動物和非哺乳動物細胞、植物細胞、包括藍綠藻在內的藻類、真菌、細菌、原生動物等。所以，代表性樣品包括全血或血制品(諸如血漿或黃色白細胞層)、尿液、糞便、腦脊髓液或其他各種體液、組織、細胞培養物、細胞懸浮液等，還包括諸如土壤、水等環境樣品，或食物樣品。
樣品還包括較純或部分純化的起始材料，例如用其他細胞分類方法獲得的半純制劑。
可用各種已知或常規方法使細胞與固相支持物結合。例如，選擇合適的固相支持物和條件來實現細胞與支持物的非特異性結合。所述條件例如固相支持物表面的化學和物理特征等，(如疏水性或電荷)，分離介質的pH或組成等。靶細胞的特征也起著一定的作用，例如，已經證明某些疏水性細胞易于非特異性地結合疏水性表面，而親水性細胞則結合親水性更高的表面。已經發現，帶負電的細胞例如B淋巴細胞與帶弱正電的表面有高程度的非特異性結合。所以可以使用表面帶有合適電荷的固相支持物來結合所需的細胞類型。合適的緩沖液等可用作細胞分離步驟的介質來獲取適宜細胞結合的條件，即在合適的介質中簡單地令固相支持物與樣品接觸。較好的是，可以在接觸固相支持物之前、同時或之后在樣品中添加具有適宜電荷和滲透壓等的緩沖液。
較好的是，根據本發明，可以用沉淀劑將細胞沉淀在支持物上實現細胞的非特異性結合，例如，通過在樣品中添加含有醇和鹽的緩沖液，使得細胞與支持物在醇和鹽的存在下相互接觸。在分離和純化步驟(例如沉淀)中使用醇或鹽是本領域的公知常識，適用于此類過程的各種醇或鹽都適用于本發明。所以，較好的是，醇可以是已知適用的各種烷基醇和低級烷基醇，例如異丙醇和乙醇。其他合適的醇包括甲醇和正丁醇。
鹽可以是各種常用來源的，例如鈉或鉀的氯化物或乙酸鹽，或是乙酸銨。醇和鹽的合適濃度可根據所用的具體系統和反應試劑來確定。一般說來，在樣品中添加0.5至3體積，例如1體積的醇比較合適。較好的是，可以使用50％-100％(w/v)的醇。已經發現，使用0.1至10.0M的鹽濃度比較合適，0.1至7.0M更好，例如0.1至3.0M，而且，以上濃度的鹽宜含于醇溶液中。所以，可使用含有所需濃度醇和鹽的緩沖液作為所謂的“細胞結合緩沖液”。或者，可以分別添加鹽和醇。根據本發明，用醇作為細胞的沉淀劑，在將本發明方法用于臨床診斷時具有優越性，因為通常用醇來保存臨床樣品。所以，可以方便地將患者樣品加入含醇的細胞結合緩沖液中，由此保存樣品并便于純化核酸。
不用鹽/醇沉淀，也可使用其它沉淀劑，例如聚乙二醇(PEGs)或性能類似的其它高分子聚合物，它們可以單獨使用或與鹽和/或醇結合使用。這些聚合物的濃度取決于具體的系統，例如聚合物和細胞的類型，但是一般為約1至50％(w/v)，例如2-30％。
可以利用其“結合”或“吞噬”顆粒固相(例如微珠)的能力來捕捉具有吞噬活性的細胞，并方便地加以收集。此時，只需將含細胞樣品在合適的條件下與固相接觸或一起培養。這種細胞捕捉法與特異性結合無關。
可以使固相支持物具有有助于細胞非特異性結合的部分，例如細胞非特異性結合的蛋白質或蛋白質片段或多肽。所以，例如，包被或攜帶了抗體的固相支持物可以通過細胞表面的Fc受體非特異性地結合細胞。將抗體或其它蛋白質或多肽固定在固相表面上的技術是本領域眾所周知的。
最后，如前所述，可以用緩沖液，通常和鹽一起，形成適宜結合的pH條件，以實現細胞與具有帶電、疏水性或親水性表面的固相支持物非特異性結合。具體的緩沖液和條件取決于細胞和固相支持物等的類型。
混合各種組分，靜置一段合適的時間，讓細胞與支持物結合。然后，可用各種方法從溶液中分離出支持物，所用方法取決于支持物的特性，并包括各種形式將支持物與細胞清液相分離的方法，例如，離心、傾浙、移液等。
以上過程的條件無關緊要，但是已經發現，較好的是，只需在固相存在下將樣品與“細胞結合緩沖液”混合，室溫靜置例如5至30分鐘，例如20分鐘，然后分離。如前所述，反應時間并不重要，通常，短至5分鐘可能已足夠。但是，如果方便的話，可以使用較長的時間，例如20分鐘至3小時，或甚至通宵。可用各種合適的方法進行混合，例如僅通過攪和或渦流加以攪拌。此外，必要時可以使用較高或較低的溫度，但這并非必需。
“細胞結合”組合物中的其它可選組分包括PEG等高分子聚合物，諸如TritonX-100、NP-40等無電荷溫和除垢劑，DNA酶和其它酶，只要它們不破壞細胞的完好性。
例如，較好的“細胞結合”組合物可以包含異丙醇，0.75M乙酸銨，75％乙醇，0.75M乙酸銨。
雖然本發明優選細胞的非特異性結合，但是也可以使用經修飾的固相支持物允許選擇性地捕捉所需含核酸細胞。所以，可使用帶有例如專一于所需細胞類型的抗體、或凝集素等其它結合蛋白的支持物。這可以使得核酸的分離具有一定程度的選擇性，因為可以只分離復雜混合物中來自所需靶源的核酸。所以，可以使用此類支持物從樣品中分離或得到所需類型的靶細胞等。
此類選擇性細胞捕捉基質的制備是本領域眾所周知的，在文獻中已有所記載。
固相支持物可以是目前廣泛用于固定化和分離等目的各種常用支持物或基質。其形式可以是顆粒、薄片、凝膠、過濾介質、薄膜、纖維、毛細管、微滴條/管/板/格等。
較好的是，支持物用玻璃、二氧化硅、乳膠或聚合材料制成。較好的是具有高表面積以用于結合細胞繼而結合核酸的材料。這類支持物一般具有不規則的表面，可以是例如多孔或顆粒狀的，例如顆粒、纖維、織物片、燒結物或篩網。一般優選顆粒材料，例如微珠，尤其是聚合物微珠，因為它們具有更大的結合容量。
較好的是，本發明所用顆粒狀固體支持物包括球形微珠。微珠的大小并不重要，但它們的(例如)直徑約至少1微米，至少2微米更好，直徑不宜超過10微米，不超過6微米更好。例如，直徑2.8微米和4.5微米的微珠被證明性能良好。
單分散顆粒即大小基本一致的顆粒具有反應再現一致性高的優點。尤其適用的是用US-A-4336173所述技術生產的單分散聚合物顆粒。
適用于本發明方法的非磁性聚合物微珠可向Dyno Particles AS(Lillestrom，Norway)、Qiagen、Pharmacia、和Serotec購買。
但是，為了幫助操作和分離，以使用磁性微珠為宜。“磁性”在此表示支持物能夠在處于磁場中時帶上磁性，使得它能夠在磁場作用下被移動。換言之，包含磁性顆粒的支持物能夠方便地用磁性聚集(aggregation)來移動，這就提供了一種在細胞和核酸結合步驟之后迅速、簡便而有效地分離顆粒，而且比常規技術溫和得多的方法，常規技術中例如離心會產生破壞細胞和降解核酸的剪切力。
所以，采用本發明方法，可以(例如)用永磁體產生磁場將結合有細胞的磁性顆粒移動到合適的表面上。通常，用磁體作用于含有樣品的容器壁就足以使得顆粒聚集于器壁，然后倒去樣品的其余部分。
尤其好的是超順磁性顆粒，例如Sintef在EP-A-106873中說明的那些，因為它們可以避免顆粒在反應過程中發生磁性聚集和結塊，由此確保均勻性和核酸抽提操作。公知的Dynal AS(Oslo，Norway)出售的磁性顆粒DYNABEADS尤其適用于本發明。
用于本發明的功能化包被顆粒可以通過修飾美國專利4,336,173、4,459,378和4,654,267所述的微珠來制備。這樣，可以制備出具有不同類型功能化表面，例如帶正電或負電，親水性或疏水性表面的微珠或其它支持物。
不同細胞表現出與不同表面和支持物不同程度的非特異性結合，為了優化細胞結合條件和確定最佳支持物面積，例如給定系統中顆粒的濃度，宜“滴定”每體積單位中固相支持物的量(例如顆粒數)。
細胞結合之后，分離或與支持物結合的細胞被裂解以釋放出它們的核酸。細胞裂解的方法是本領域眾所周知的，在許多文獻中有所記載，任何一種已知技術都可使用。對不同細胞用不同的方法可能更合適，但是以下方法都可以使用，例如在合適的緩沖液中用SDS、LiDS或十二烷基肌氨酸鈉等的除垢劑裂解法；用鹽酸胍(GHCl)、異氫酸胍(GTC)、碘化鈉(NaI)、高氯酸鹽等離液劑；用French壓力，超聲波處理，用玻璃微珠、氧化鋁或液氮研磨等的機械破壞；例如用溶菌酶、蛋白酶、鏈霉蛋白酶或纖維素酶或其它市售裂解酶的酶裂解法；噬菌體或病毒感染裂解細胞；冷凍干燥；滲透壓休克；微波處理；溫度處理；例如加熱或沸煮，或在干冰或液氮中冷凍后再融化；堿裂解。如前所述，這些方法都是標準裂解法，都是本領域眾所周知的，以上方法中任一種或以上方法的組合都可以使用。
較好的是，可根據本發明用離液劑和/或除垢劑來裂解。例如，就細菌細胞而言，將離液劑與除垢劑結合被發現特別有效。因此，一例合適的裂解劑包含諸如GTC和GHCl的離液劑和諸如SDS或十二烷基肌氨酸鈉的除垢劑。裂解劑可以簡單水溶液的形式使用，也可以包含在緩沖液中形成所謂的“裂解緩沖液”。各種合適的緩沖液都可以使用，其中包括例如Tris Bicine、Tricine和磷酸鹽緩沖液。或者，多種裂解劑可分別加入。合適的裂解劑濃度和量取決于具體的系統、細胞特性等，這是可以正確確定的，但是可以使用例如2M至7M諸如GTC、GHCl、碘化鈉和高氯酸鹽的離液劑，0.1M至1M諸如NaOH的堿，和0.1至50％(w/v)例如0.5至15％除垢劑。這樣，一例代表性的合適的裂解劑緩沖液包含4M GTC水溶液，1％(w/v)十二烷基肌氨酸鈉。
要實施本發明，可方便地將分離的、與支持物結合的細胞與樣品其余部分相分離，由此濃縮或富集細胞。這樣，細胞結合步驟起到了富集或濃縮細胞使其體積小于最初樣品的作用。然后，加入合適的含所需裂解劑的裂解緩沖液或讓分離細胞處于所需的裂解條件下，如此就可以裂解細胞。例如，如果是簡單地加入含合適裂解劑的裂解緩沖液，只需將分離細胞在裂解緩沖液存在下培養合適的時間使裂解得以發生。對于不同的裂解系統宜使用不同的培養條件，這些是本領域眾所周知的。例如，對于含除垢劑和/或離液劑的裂解緩沖液來說，培養可在室溫或例如37℃或65℃等較高溫度下進行。同樣，培養時間可從幾分鐘(例如5分鐘或10分鐘)至數小時(例如1至2小時)不等。如果是GTC/十二肌氨酸鈉裂解緩沖液和細菌細胞，已證明，65℃培養10-20分鐘比較適宜，當然，這可以根據需要加以改變。對于酶(例如K蛋白酶)裂解來說，可能需要較長的處理時間，例如通宵。
裂解之后，釋放出的核酸與被裂解細胞所結合的同一支持物結合。這一步核酸結合可用本領域已知的各種核酸結合固相支持物的方法來進行。較簡便的是核酸與支持物非特異性(即與序列無關)結合。這樣，例如，可用各種已知核酸沉淀劑，例如醇類、醇/鹽混合物、聚乙二醇(PEG)等，將釋放出的核酸沉淀在支持物上。例如WO91/12079說明了用這種方式將核酸沉淀在微珠上。所以，可向含支持物和釋放的核酸的溶液添加鹽，然后添加醇，引起核酸沉淀。或者，鹽和醇可以同時加入，或者也可以不加鹽。如前文就細胞結合步驟所述，任何合適的醇和鹽都可以使用，確定適宜的量和濃度是很容易的。
其他非特異性核酸結合技術包括如Dynal A.S.的WO96/18731所述使用除垢劑(所謂的“DNA直接”法(DNA direct))，如Akzo N.V在EP-A-0389063中所述使用離液劑和二氧化硅顆粒之類核酸結合固相。
可用表面帶電的固相支持物，例如聚胺包被的支持物，實現核酸與支持物的離子性結合。
本發明所用支持物可帶有協助特異性或非特異性核酸結合的官能團，例如可在支持物上涂以亮氨酸拉鏈或組蛋白DNA結合蛋白或嵌入染料(例如溴乙錠或Hoechst42945)。
可使支持物帶上協助選擇性捕捉核酸的結合部分。例如，可使用互補DNA或RNA序列，或DNA結合蛋白，或結合病毒核酸的病毒蛋白。可用本領域的公知技術將所述蛋白與固相支持物結合。
本發明簡便的沉淀核酸法是在含支持物和被裂解細胞的混合物中添加醇之類沉淀劑。可簡單地在混合物中添加適量的醇，例如100％或96％的乙醇，培養足夠長的時間使釋放的核酸與支持物結合。這一步的培養條件并不重要，可能僅是室溫培養5-10分鐘。但是，根據選擇，可以改變培養時間和提高培養溫度。
雖非必要，但較好的是在本發明分離方法中引入一步或多步洗滌步驟，例如在核酸結合步驟之后進行。各種常規洗滌緩沖液或其它介質均可使用。一般說來，優選低或中等離子強度的緩沖液，例如10mM Tris-HCl，pH8.0/10mM NaCl。根據需要，也可使用其它標準洗滌介質，例如含醇的介質，例如用70％乙醇洗滌。
使用磁性顆粒便于洗滌，只需聚集顆粒，去除核酸結合介質，添加洗滌介質，再次聚集顆粒，根據需要重復多次。
在核酸分離和視要求選用的洗滌步驟之后，可將結合有核酸的支持物轉移(重懸或浸沒)入各種合適的介質(例如水或低離子強度緩沖液)中。根據支持物和后續加工的特性，可將核酸從支持物上釋放也可以不釋放。
如果是諸如磁性或非磁性微珠之類顆粒固相支持物，許多時候，核酸無需從支持物上洗脫就可直接用于例如PCR或其它擴增反應。而且，對許多DNA檢測或鑒定方法來說不必進行洗脫，因為雖然DNA與微珠表面的接觸是隨機的，并且在許多位點是靠氫鍵或離子鍵或其它力結合的，但是DNA的長度一般已足以與寡核苷酸雜交，也足以發生擴增反應。
但是，如果需要，用已知技術例如通過加熱(例如65℃加熱5-10分鐘)可方便地洗脫核酸，此后可從介質中去除支持物而只在溶液中留下核酸。所述的加熱在PCR中是通過循環程序前的DNA變性步驟自動實現的。
如果要去除DNA中的RNA，可通過在DNA分離步驟之前破壞RNA，例如添加RNA酶或NaOH之類的堿來實現。
本發明優點之一是迅速而簡便，而且，通過細胞結合、裂解和核酸結合步驟的適當組合，提供了一種在短時間內(許多情況下少于1小時，甚至少于45分鐘)獲得分離的核酸的可靠而簡便的方法。方法的簡單性提高了樣品處理能力。同時，細胞結合步驟富集或濃縮了細胞，由此優化了核酸分離過程。
本發明便于自動化，尤其是在用顆粒特別是磁性顆粒作為支持物時。
如前所述，本發明方法具有特殊的用途，即在制備核酸用于基于核酸的檢測過程時作為預備性的第一步。
這樣，本發明的另一方面內容是應用該核酸分離方法如前文所述制備用于基于核酸的靶細胞檢測法的核酸。
換言之，本發明的這方面內容提供了一種檢測樣品中有無靶細胞的方法，該方法包括(a)樣品中的細胞與固相支持物結合以從樣品中分離出細胞；(b)裂解分離出的細胞；(c)從所述裂解細胞中釋放出的核酸與同一固相支持物結合；(d)檢測素數結合的核酸中有無所述靶細胞的特征性核酸。
如前所述，本發明的優點在于不必在檢測步驟之前將結合核的酸從支持物上洗脫或分離，雖然也可以根據需要進行上述操作。是否洗脫核酸還取決于核酸結合步驟中使用的具體方法。所以，這種可靠的核酸結合過程會使核酸的結合比其它方法更緊密。如果是用除垢劑進行DNA結合(例如DNA直接法)，在引入洗脫緩沖液或其它合適的介質時，核酸將從固相支持物上洗脫。處于緩沖介質中時，通過例如醇或離液劑沉淀結合的核酸將仍與支持物緊密結合，此時可能需要加熱洗脫。
這樣，支持物-結合核酸可直接用于基于核酸的檢測，特別是當支持物是顆粒時，只需將支持物重懸在檢測步驟的合適介質中，或將所述介質加入支持物。將核酸洗脫到介質中，或如前所述，洗脫不是必需的。
許多檢測核酸的技術是已知的，并在文獻中有所記載，其中任何一種都可用于本發明。最簡單的是通過與探針的雜交來檢測核酸，許多文獻記述了此類雜交方案(參見Sambrook等，1989，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbour Press，Cold Spring Harbor，NY)。最常見的是，檢測包括原位雜交，和/或用文獻中所述方法進行的體外擴增。這樣，如前所述，可使用例如LAR、3SR和Q-β復制酶系統等技術。但是，通常選用PCR及其修改形式(例如使用嵌套引物)(有關核酸擴增技術的綜述，參見Abramson&Myers，1993，CurrentOpinion in Biotechnology，441-47)。
其它檢測可能以測序為基礎，例如Syvanen&Soderlund在1990，Genomics中所述的微測序法，8684-692。
在例如PCR的擴增技術中，第一步熔解DNA雙螺旋所需的加熱會使結合的DNA從支持物上釋放。這樣，在其后的檢測步驟例如PCR中，可將與支持物結合的核酸直接加到反應混合物中，核酸將在檢測過程的第一步被洗脫。可將本發明獲得的全部分離出的與支持物結合的核酸樣品用于檢測步驟，或使用其中一份。
可用多種方法檢測或顯示PCR或其它檢測步驟的結果，這些是本領域的已知技術。例如，可對PCR或其它擴增產物進行凝膠電泳，例如用已知技術溴乙錠染色瓊脂糖凝結。或者，可用DIANA系統，該系統是嵌套引物技術的一種修改形式。DIANA(固定化擴增核酸的檢測)系統中(參見Wahlberg等，Mol.Cell.Probes4285(1990))，內部第二引物對分別帶有捕捉擴增DNA的固定化工具和一種標記或用于結合標記以便識別的工具。其雙重優點在于既降低了背景信號，又可迅速而簡便地檢測出擴增DNA。
還可以通過測序來檢測擴增的核酸或最后確認產物，可用許多不同的已知測序技術進行測序，例如標準測序法，固相測序法，循環測序法，自動測序和微測序。
本發明的優點在于，已發現，室溫下，分離細胞可在“細胞結合”緩沖液(例如鹽/醇緩沖液)中維持至少1周，在其后的檢測步驟中沒有測得靈敏度降低。這種穩定性在實際情況中是非常有利的。
較方便的是，可以試劑盒的形式提供用于實施本發明方法所需的各種反應試劑和組分。所述試劑盒即本發明的另一方面內容。
簡而言之，本發明的這方面內容提供了用于從樣品中分離核酸的試劑盒，它包括(a)固相支持物；(b)可選的，使所述細胞與固相支持物結合的工具；(c)裂解所述細胞的工具；(d)使所述裂解細胞所釋放的核酸與前述同一固相支持物結合的工具。
在本發明方法中，各種工具(b)、(c)和(d)如前文所述。
另一可選組成是(e)，即檢測所述結合的核酸中有無靶細胞的特征性核酸的方法。如前所述，這類方法包括用于雜交和/或基于擴增的檢測的合適的探針或引物寡核苷酸序列。
試劑盒中還可以包括緩沖液、鹽、聚合物、酶等。
在以下實施例中，參照以下附圖，將對本發明進行更詳細的說明。附圖中

圖1顯示用本發明方法從5種藍細菌中獲得的DNA經PCR擴增后的EtBr染色瓊脂糖凝膠電泳結果。泳道1-7對應于實施例1中的樣品1-7。
實施例1材料樣品1Planktothrix rubescens NIVA-CYA1；樣品2Planktothrix agardhii NIVA-CYA29；樣品3Planktothrix rubescens NIVA-CYA55；樣品4Planktothrix mougeotii NIVA-CYA56/1；樣品5Planktothrix agardhii NIVA-CYA116；樣品6細胞和DNA純化試劑的陰性對照；樣品7PCR試劑陰性對照。
細胞和DNA分離方案含約105個細胞的0.5ml水與20μl微珠(1μg/ml)和0.5ml細胞結合緩沖液(異丙醇，0.75M NH4Ac)在微離心管中混合。混合物室溫孵育20分鐘，然后試管在MPC-E磁體(Dynal A.S.)上放置2分鐘。小心地去除清液。加入50μl 4M GTC、1％十二烷基肌氨酸鈉，65℃孵育10分鐘。然后加入200μl 96％EtOH，室溫下繼續孵育5分鐘。用磁體使得微珠附著于試管壁，去除清液。復合物用500μl 70％乙醇洗滌2次。完全清除乙醇，加入50μl水。為了去除殘余乙醇，試管在65℃開蓋孵育10分鐘。
PCR擴增擴增的是RuBisCo大亞基(Rbcl)和小亞基(Rbcs)編碼基因之間的區域。擴增是在含10pmol引物(CW)5’CGTAGCTTCCGGTGGTATCCACGT3’和(DF)5’GGGCARYTTCCACAKNGTCCA3’，200μM dNTP，10mM Tris-HCl(pH8.8)，1.5mM MgCl2，50mM KCl，0.1％Triton X-100，1單位DynaZyme熱穩定性DNA聚合酶(Finnzymes Oy)和5μl微珠/DNA溶液的50μl體積中，用GeneAmp 2400 PCR系統(Perkin Elmer)進行的。所用的PCR程序包括，先在94℃變性4分鐘，然后94℃30秒，40℃30秒和72℃2分鐘循環2輪，再94℃30秒，60℃30秒，72℃2分鐘循環40輪。最后，延伸7分鐘。通過DNA測序證實擴增片段就是RuBisCo大亞基(Rbcl)和小亞基(Rbcs)編碼基因之間的區域。
凝膠樣品1-7的擴增產物各10μl在EtB染色的瓊脂糖凝膠上100伏電泳30分鐘。分子量標準物是φX174 HaeIII消化的DNA。結果如圖1所示。
結果圖1清楚地顯示來自樣品1至5的細胞都可以檢測。根據所得的PCR結果，如EtB染色的瓊脂糖凝膠所示，檢測的極限可能是10-100細胞/ml。
權利要求
1.一種分離細胞樣品中核酸的方法，所述方法包括(a)樣品中的細胞與固相支持物結合以從樣品中分離出細胞；(b)裂解分離出的細胞；(c)所述裂解細胞釋放出的核酸與同一固相支持物結合。
2.根據權利要求1所述的方法，所述的核酸是DNA。
3.根據權利要求1或2所述的方法，在步驟(a)中，用沉淀劑將細胞沉淀在支持物上。
4.根據權利要求3所述的方法，所述的沉淀劑含醇和鹽。
5.根據權利要求1或2所述的方法，在步驟(a)中，細胞通過支持物上或支持物內的細胞結合部分與支持物結合。
6.根據權利要求5所述的方法，所述的細胞結合部分可選擇性結合靶細胞。
7.根據權利要求1至6中任一項所述的方法，其中的固相支持物是顆粒狀的。
8.根據權利要求7所述的方法，其中的支持物包含磁性微珠。
9.根據權利要求1至8中任一項所述的方法，在步驟(b)中，用除垢劑和/或離液劑裂解細胞。
10.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，在步驟(c)中，核酸與支持物非特異性結合。
11.根據權利要求10所述的方法，用沉淀劑將核酸沉淀在支持物上。
12.根據權利要求11所述的方法，其中的沉淀劑含醇，可有可無鹽，和/或除垢劑。
13.根據權利要求1至9中任一項所述的方法，在步驟(c)中，核酸通過支持物上協助選擇性捕捉核酸的結合部分與支持物結合。
14.根據權利要求1至13中任一項所述的方法，結合的核酸從支持物上被洗脫。
15.權利要求1至14中任一項所述的核酸分離方法的用途，它用于制備基于核酸的靶細胞檢測方法中所用的核酸。
16.一種檢測樣品中有無靶細胞的方法，所述方法包括(a)樣品中的細胞與固相支持物結合以從樣品中分離出細胞；(b)裂解分離出的細胞；(c)所述裂解細胞釋放出的核酸與同一固相支持物結合；(d)檢測結合的核酸中有無靶細胞的特征性核酸。
17.根據權利要求16所述的方法，所述的檢測步驟(d)包括原位雜交和/或體外擴增和/或核酸測序。
18.一種用于分離樣品中核酸的試劑盒，它包括(a)固相支持物；(b)任選的、使細胞與所述固相支持物結合的工具；(c)裂解所述細胞的工具；(d)使所述裂解細胞釋放出的核酸與固相支持物結合的工具；其中所述固相支持物(a)和工具(b)至(d)如權利要求1至13中任一項所定義的。
全文摘要
本發明提供了一種分離細胞樣品中核酸的方法,所述的方法包括:(a)使樣品中的細胞與固體支持物相結合以分離出細胞;(b)裂解分離出的細胞;(c)使裂解細胞釋放出的核酸與上述同一固體支持物結合。本發明還提供了實施以上方法的試劑盒。該方法可用于制備核酸以供基于核酸的靶細胞檢測法所用。
文檔編號C07H21/00GK1260800SQ98806278
公開日2000年7月19日 申請日期1998年5月13日 優先權日1997年5月13日
發明者K·魯迪, K·S·雅各布森 申請人:簡珀恩特聯合股份有限公司