一種蟾酥靶向脂質體及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于藥物制劑領域，涉及靶向脂質體，尤其涉及碳酸酐酶CA9抗體修飾的 蟾酥脂質體及其構建方法及其在抗腫瘤中的應用。
【背景技術】
[0002] 蟾酥（Bufotoxin)為蟾蜍（Toad，俗名癩蛤蟆）的耳后腺和皮膚腺體的干燥分泌 物，能強心、興奮呼吸中樞和橫紋肌，具有升高血壓、鎮痛、平喘、鎮咳、抗炎和抗腫瘤作用， 是重要的傳統中藥材。蟾酥多入丸、散，著名中成藥六神丸、喉癥丸、梅花點舌丹都含有蟾 酥這味藥，除此之外，國家食品藥品監督管理局還批準上市的蟾酥藥品有蟾酥錠、蟾酥注射 液、蟾酥鎮痛膏、復方蟾酥丸、復方蟾酥膏、蟾酥鎮痛巴布膏。但蟾酥屬2類毒性中藥，最高 用量為0. 015-0. 03g，所含的蟾酥毒素通過興奮迷走神經中樞或末梢，直接作用于心肌，出 現惡心、嘔吐、腹瀉、腹痛、體力不支、頭暈、心悸、胸悶、口唇及四肢麻木等癥狀，嚴重者會發 生口唇青紫、抽搐，甚至出現循環、呼吸系統衰竭而導致死亡。這些毒副作用大大增加了蟾 酥臨床使用的風險，所以臨床合理用藥、制劑工藝的改進，對提高藥物安全性顯得尤為重 要。
[0003] 1993年，有學者在與人乳腺癌細胞聯合培養的宮頸癌的HeLa細胞系中發現了 MN 蛋白。隨后的研究發現，該蛋白結構與碳酸酐酶（CA)相似，并被確認為是一種碳酸酐酶的 異構酶，遂被命名為CA9。它是由酸性氨基酸組成的跨膜糖蛋白，由459個氨基酸組成，分布 在細胞膜和細胞核，相對分子質量分別為58kD、54kD。碳酸酐酶CA9參與調節細胞內外的 酸堿度，在腫瘤細胞的生長和存活過程中發揮重要作用。在一般情況下，CA9僅表達于極少 的正常組織，如胃、膽管、胰腺、小腸和輸精管上皮，而且表達量極少，而在結腸癌、膀胱癌、 腎癌、子宮頸癌、腦膠質瘤、胃癌中可以高表達碳酸酐酶CA9,現有技術中大部分被用于腫瘤 的診斷，雖然現有技術中有描述可以將CA9用于治療，但是并沒有給出具體怎樣利用CA9進 行治療。

【發明內容】

[0004] 1、本發明的目的。
[0005] 本發明為了解決現有技術中既能有有效利用蟾酥的藥性，同時減少蟾酥藥物的巨 大毒性對人體產生的毒副作用，并且能夠有針對性的對癌細胞進行抑制，減少對人體正常 細胞的傷害和患者治療痛苦，提高治療效果，從而提出的一種蟾酥靶向脂質體及其制備方 法和應用。
[0006] 2、本發明所采用的技術方案。
[0007] (一）蟾酥靶向脂質體 蟾酥靶向脂質體，括碳酸酐酶CA9抗體、蟾酥和脂質體，蟾酥包裹在脂質體內，并與CA9 連接。更具體地，與CA9連接方式為將CA9抗體連接到脂質體聚乙二醇鏈末端。
[0008] 在進一步具體的實施例中，蟾酥靶向脂質體的膜材料選自以下材料：a、天然大豆 卵磷脂或合成的磷脂；b、膽固醇；c、聚乙二醇-磷脂復合物和d、碳酸酐酶CA9抗體-聚 乙二醇-磷脂復合物的組合物。所述的材料c中聚乙二醇-磷脂復合物中聚乙二醇的分子 量為1000-5000 g/mol ;所述的材料d中碳酸酐酶CA9抗體-聚乙二醇-磷脂復合物中聚 乙二醇的分子量為1000-8000 g/ mol。
[0009] 在進一步具體的實施例中，脂質體膜材料的摩爾比為a : b=4:1-1: 1， a:c=1000:1-1000:100, a:d=1000:1-1000:100。
[0010] 在進一步具體的實施例中，蟾酥與所述脂質組分的質量比是0. 1%至50%。
[0011] 在進一步具體的實施例中，脂質體粒徑范圍為20-200nm。
[0012] 在進一步具體的實施例中，所述的聚乙二醇-磷脂復合物或碳酸酐酶CA9抗 體-聚乙二醇-磷脂復合物中的磷脂選自二硬脂酰磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰乙醇胺、 二油酰磷脂酰乙醇胺、氫化大豆磷脂酰乙醇胺、氫化蛋磷脂酰乙醇胺、大豆磷脂酰乙醇胺或 蛋磷脂酰乙醇胺。
[0013] (二）蟾酥靶向脂質體的制備方法 本發明的蟾酥靶向脂質體的制備方法，按照如下步驟進行： 1)制備蟾酥脂質體 使用擠出機經過聚碳酸酯過濾器用數個循環擠出，控制粒徑在20-200nm之內。
[0014] 2)制備蟾酥靶向脂質體 添加蟾酥脂質體、1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基硫代琥珀 酰亞胺、碳酸酐酶CA9抗體，置于4°C條件下反應4-20小時； 3) 純化 使用透析袋透析，除去未包封的蟾酥、蟾酥脂質體、未連接的碳酸酐酶CA9抗體、 EDC ? HC1.S-NHS ； 4) 干燥 對透析得到的蟾酥靶向脂質體冷凍干燥，得到粉末狀樣品，以便于保存。
[0015] 在進一步具體的實施例中，所述的步驟1中蟾酥脂質體的終濃度控制在5-20mg/ ml〇
[0016] 在進一步具體的實施例中，步驟2中蟾酥脂質體、1-(3_二甲氨基丙基）-3_ 乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基硫代琥珀酰亞胺、碳酸酐酶CA9抗體比例為（10-100) : (100-1000)：(100-1000) ： (1-10)〇
[0017] 在進一步具體的實施例中，所述的步驟2中反應時間為8-12小時。
[0018] 本發明蟾酥靶向脂質體可以應用于制備治療癌癥藥物，優選的制備癌癥藥物包括 結腸癌藥物、膀胱癌藥物、腎癌藥物、子宮頸癌藥物、腦膠質瘤藥物、胃癌藥物。
[0019] 3、本發明的有益效果。
[0020] ( 1)本發明通過將蟾酥脂質體和CA9的協同作用，能夠降低蟾酥的藥物毒性，減少 了對人體正常細胞的傷害。
[0021] (2)本發明將蟾酥脂質體和CA9的結合，其治療效果也遠高于現有技術中的蟾酥 脂質體的治療效果，抑瘤率高達60%以上。
[0022] (3)本發明通過將蟾酥脂質體和CA9的制備工藝和協同作用，能夠有針對性的到 達癌癥病灶區，而現有技術中并沒有給出CA9是如何具體制備并應用于治療癌癥藥物的方 法。
[0023] (4)本發明蟾酥靶向脂質體制備工藝簡便，碳酸酐酶CA9抗體與蟾酥脂質體耦合 率達到68%-70%，包封率可達80-85%，粒徑20-200nm，穩定性較好，蟾酥靶向脂質體在PBS溶 液中16天泄漏率僅為3. 4%。
[0024]
【附圖說明】
[0025] 圖1蟾酥靶向脂質體制備示意圖 圖2蟾酥靶向脂質體隨時間變化的滲透率 圖3蟾酥靶向脂質體對結腸癌HCT116細胞存活率的影響 圖4蟾酥靶向脂質體對宮頸癌hela細胞存活率的影響 圖5蟾酥靶向脂質體對腎癌796-P細胞存活率的影響。
【具體實施方式】
[0026] 為了使專利局的審查員尤其是公眾能夠更加清楚地理解本發明的技術實質和有 益效果，申請人將在下面以實施例的方式作詳細說明，但是對實施例的描述均不是對本發 明方案的限制，任何依據本發明構思所作出的僅僅為形式上的而非實質性的等效變換都應 視為本發明的技術方案范疇。
[0027] 實施例1蟾酥靶向脂質體的制備方法 1、包裹蟾酥脂質體的制備 1)取二硬脂酰磷脂酰膽堿（DSPC)60mg，膽固醇（Chol)lOmg，二硬脂酸磷脂酰乙醇 胺-聚乙二醇2000 (DSPE-PEG2000) 9mg，二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-羧基交 連物（DSPE-PEG2000-C00H)1.5mg溶于15ml氯仿中（A溶液）；蟾酥溶于甲醇中（B溶液），A 溶液與B溶液按照1:1比例混合，采用薄膜分散法，60°C，40r/min，蒸去氯仿、甲醇。
[0028] 2)將該脂質膜在10mM的Tris-等滲鹽緩沖液（10mM的Tris，137mM氯化鈉， 25°C，pH7. 4)水化。將脂質的終濃度控制在5-20mg/ml。
[0029] 3)然后將所述混合物在80°C (超過所有脂質的轉變溫度)保持60min以使所述脂 質體結構固化。在固化期間，分別在開始的、中間的和末端的時間點將它用渦流攪拌3次， 并且每一次連續攪拌5min。
[0030] 4)最后將得到的MLV使用10ml擠出機經過直徑為25mm的Whatman 100nm聚碳酸 酯過濾器用數個循環擠出，直到粒徑在20-200nm之內。
[0031] 、靶向脂質體制備方法 如圖1所示，蟾酥靶向脂質體的制備流程： 1)取1_(3_二甲氨基丙基）_3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC.HCL)和N-羥基硫代琥珀 酰亞胺（S-NHS)加入上述制備的包裹蟾酥的脂質體PBS緩沖液中（pH7. 4)，室溫攪拌30min 后，加入碳酸酐酶CA9抗體，置于4°C條件下反應12h。
[0032] 2)純化：用pH7. 4、濃度為10mM的PBS作為透析介質，透析袋透析lh，更換透析 介質，重復上述操作2次，除去未包封的蟾酥、未反應的碳酸酐酶CA9抗體、EDC ?HC1、S-NHS 及普通脂質體。
[0033] 干燥：對透析得到的蟾酥靶向脂質體冷凍干燥，得到粉末狀樣品，以便于保存。
[0034] 實施例2蟾酥靶向脂質體的表征 1、包封率的測定 將150ML新制備的蟾酥靶向脂質體用Avanti J-E離心機（JA-20, 17400*g，6°C，20min) 通過可截留分子量為10KD慮份的Microcon Y-10離心過濾裝置（Millipore)離心。在 296nm下用分光光度法測定離心溶液中的蟾酥濃度。該濃度表示所述脂質體的連續相中的 蟾酥濃度(非包封的蟾酥)。分光光度法還用作測定脂質體的分散相和連續相中的蟾酥總濃 度。將無水乙醇添加到脂質體混懸液中以完全破裂所述脂質體并且將包封的蟾酥完全溶解 在溶液中。通過裝備有恒溫石英室的UV-VIS Varian Cary 50分光光譜儀在296nm的波長 下測量吸光度。用下式計算包封率（EE): EE (%) = (C 總-C 游離）/C 總 X 100 其中（^胃是脂質體分散體/溶液的連續相中的未包封的蟾酥濃度，C總是脂質體分散 體/溶液中的蟾酥總濃度。經過計算，包封率可達80-85%。
[0035] 、蟾酥脂質體粒徑 目前關于脂質體的乳滴粒度測定常采用方法有顯微鏡法、動態光散射法、Coulter 計數法等。本實驗中蟾酥靶向脂質體粒度測定采用光學顯微鏡及光子相關光譜法 (Photon-Correlation Spectroscopy, PCS)，也稱動態光散射原理（Dynamic light scatter, DLS, NicompTMPS