經翻譯后修飾的有活性的可溶性神經調節蛋白同種型的制作方法
【專利說明】
[00011 本申請是申請號為200880121853.3的分案申請。
技術領域
[0002] 本發明涉及使用神經調節蛋白-1翻譯后的各種修飾產物或剪切變體，尤其是可溶 于生理溶液的神經調節蛋白-1同種型作為藥物，來治療與認知有關的精神紊亂類疾病，如 精神分裂癥、阿爾茨海默氏癥以及帕金森氏癥。
【背景技術】
[0003] 神經調節蛋白（NRG)為突觸信號傳遞中的關鍵調節物質。這種跨膜蛋白由四種基 因編碼(6-1、置6-2、置6-3和置6-4)，并通過選擇性的1?嫩剪接和啟動子使用以及尤其翻 譯后修飾(如蛋白水解加工，其可自膜結合的全蛋白中釋放可溶性的同種型)使其多樣性進 一步提高。此外經證實還存在磷酸化與糖基化(Buonanno and Fischbach 2001)。它們的特 征在于不同的胞外結構域，且是ErbB受體酪氨酸激酶的配體，其涉及神經炎癥以及基因轉 錄的下游(Holbro and Hynes 2004)。尤其是，NRG-I的可溶性同種型可由跨膜形式的NRG在 電刺激過程中經蛋白水解切割得到，并隨后分泌為依賴于活性的突觸調節物（Ozaki et al.2004)〇
[0004] 包含整個跨膜蛋白的N端胞外結構域(E⑶)的NRG-I的截短同種型(推測為β?)被證 實與學習和記憶相關聯(Schillo et al.2005a;W003/014156)。對功能的研究證明，NRG-I 直接調節NMDA受體亞基組成(Ozaki et al. 1997 ;Eilam et al. 1998)。此外，這類NRG-1片 段由于抗凋亡作用而具有體內神經保護性質（Xu et al.2005A;Xu et al.2005B;Xu et al.2004)〇
[0005] 由于NMDA受體的NRG依賴性調節（Schrattenholz and Soskic2006)，以及隨后的 下游事件（如興奮性中毒、神經炎癥以及凋亡）（在圖1中總結），人們最近越發的認識到 NRG-I在人神經性疾病中扮演中心角色。有結果表明NRG-I在從肌萎縮側索硬化癥、阿爾茨 海默氏癥和帕金森氏癥至中風以及精神分裂癥的疾病中均發揮著重要作用（Britsch 2007)〇
[0006] NRG-I的這些重要的作用暗示其除了在神經保護以及在與認知相關的學習與記憶 中起到積極作用外，NRG-I還是各種特定腦區和細胞類型中的各種損傷后神經原組織再生 中的重要神經營養因子。很明顯，它是維持及修復神經元回路的完整性的重要因子:神經保 護和功能喪失后的正確再生以及活性依賴型神經元可塑性的形成中的作用。
[0007] 在Kastin et al，2004證明調節蛋白1β可穿過血腦屏障后，對神經調節蛋白1β研 究的興趣得到了進一步的點燃。其開辟了神經調節蛋白W的治療應用的新途徑。
[0008] 最近的研究證明了其在神經保護方面具有廣泛的應用范圍。兩份出版物分別獨立 的證明了神經調節蛋白1還是BACE(i3分泌酶、份定粉樣蛋白轉化酶）的底物，而這意味著神經 調節蛋白1與阿爾茨海默氏癥相關聯(Glabe 2006;Schubert 2006)。
[0009] 另外，在雪旺氏細胞中發現神經調節蛋白-1增加了 3-羥基-3-甲基戊二酰-輔酶A 還原酶(雪旺氏細胞中膽固醇生物合成的限速酶）的轉錄(Pertusa et al .2007)。這對髓鞘 受影響的疾病（如神經分裂癥和多發性硬化癥)或涉及所謂的"富含膽固醇的脂後"的認知 相關功能有深遠意義（Schrattenholz and Soskic 2006)。圍繞軸突的雪旺氏細胞在生理 狀態下表達NRGl受體ErbB2/ErbB3以及可溶性NRGla和NRG10。經去神經處理，成體的雪旺氏 細胞脫離與軸突的接觸后，改變其形態學，停止表達NRG10，并上調NRGla及ErbB2/ErbB3的 表達（Geuna et al. 2007 ;Karoutzou et al. 2007) 〇
[0010]此外，遺傳流行病學研究表明神經調節蛋白1與精神分裂癥和阿爾茨海默氏癥(尤 其與其精神病形式)有著明顯的相關性(Farmer et al.，2007)。
[0011] 一些近期的遺傳群體分析顯示，特定NRG-I-SNP與阿爾茨海默氏癥和精神分裂癥 有關（Go et al.2005;Scolnick et al.2006;Ross et al.2006;Meeks et al.2006; Farmer et al.2007)。最近的這些發現與圖I中其他含有功能的NRG的復合物的蛋白有關 (ErbB受體：（Benzel et al.2007;Thomson et al.2007;Hahn et al.2006)。還暗不了NRG-1在多發性硬化中的作用(Esper et al.2006)。
[0012] 有結果提不NRGl的危險等位基因與精神分裂癥之間相關聯的分子機制可能包括α 7亞類煙堿乙酰膽堿受體的下調(Mathew et al,2007)。
[0013] 根據本發明，發現重組的可溶性神經調節蛋白-1β同種型對精神分裂癥、阿爾茨海 默氏癥以及帕金森氏癥的動物模型的學習和記憶狀況可起到一定的藥效。在靜脈注射后， 神經調節蛋白_1β同種型在顯著低于對照藥物濃度的濃度有活性。

【發明內容】

[0014] 因此，本發明的第一方面為重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型用于制備治療神 經性疾病(特別是與認知相關神經性疾病)的藥物的用途。
[0015] 本發明的另一方面為藥物組合物或試劑盒，其包含：（i)重組的可溶性神經調節蛋 白-1同種型、和(ii)其他的尤其是用于治療神經性疾病(尤其是與認知相關的神經性疾病） 的藥物。
[0016]此外，本發明另一方面為重組的可溶性神經調節蛋白-垌種型用于制備增強記憶 和認知的藥物的用途。
[0017] 此外，本發明另一方面為治療神經性疾病的方法，包括:給有需要的受試者施用藥 學有效量的重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型。
[0018] 此外，本發明另一方面為增強記憶和認知的方法，包括:給有需要的受試者施用藥 學有效量的重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型。
[0019] 此外，本發明另一方面為共施用重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型與其他藥 物。
[0020] 據本發明可知，可溶性神經調節蛋白-1同種型已被證明對治療神經性疾病(尤其 是疾病（如精神障礙(如精神分裂癥、雙相型障礙和抑郁型）、神經退行性疾病(如帕金森氏 癥、阿爾茨海默氏癥、多發性硬化(MS)、或肌萎縮側索硬化癥(ALS)、癲癇)或神經性損傷(如 中風、創傷性腦損傷以及脊髓損傷）））有效。優選治療精神分裂癥，特別是精神分裂癥的認 知相關方面、帕金森氏癥和阿爾茨海默氏癥。另外，本發明還涉及重組的可溶性神經調節蛋 白-1同種型用于增強記憶和認知，特別是用于減少和/或抑制與神經性疾病（如阿爾茨海默 氏癥和精神分裂癥)相關的記憶和認知缺失的用途。
[0021] 所述重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型優選為人神經調節蛋白-1同種型，即包 含天然的人神經調節蛋白-1同種型的一級氨基酸序列或與重組同種型全長具有至少90% 的同一性，優選至少95%的同一性，及最優選至少98%的同一性的序列的重組同種型。
[0022] 本發明的可溶性重組神經調節蛋白-1同種型優選包含相應神經調節蛋白-1胞外 結構域的至少一部分(如人神經調節蛋白（如人神經調節蛋白_1β)胞外結構域的至少一部 分)。
[0023] 本發明的重組可溶性神經調節蛋白同種型的長度優選達250個氨基酸（如150~ 250個氨基酸）。例如通過SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)測定的神經調節蛋白同種型的分 子量優選為約15KD~約35KD，尤其為約25KD~約32KD。重組的可溶性神經調節蛋白-1同種 型(尤其為重組的神經調節蛋白_1β同種型）的等電點(Pl)為約4~約9.5,優選為約4~約6。 該同種型可為由未修飾的氨基酸序列構成的未修飾多肽或經修飾多肽，其中所述修飾可選 自：磷酸化、糖基化、甲基化、十四酰化、氧化及它們的任意組合。在特別優選的實施方式中， 神經調節蛋白-1同種型包含至少一個磷酸化的氨基酸殘基。另外，本發明包含綴合異源部 分，如聚(環氧烷烴)部分，特別是聚乙二醇部分。
[0024] 該重組的可溶性同種型可通過任何可有效遞送到目標組織（如神經系統，特別是 中樞神經系統，如腦和/或脊髓)的途徑施用。已發現，神經調節蛋白同種型的藥學有效濃度 可通過全身給藥達到。例如，該同種型可通過注射或輸液(如靜脈注射)施用。該同種型可 根據待治療疾病的類型和嚴重程度，優選以0.1~5000ng/kg待治療受試者體重的量，尤其 以2~1000ng/kg待治療受試者體重的量，及更尤其以3~600ng/kg待治療受試者體重的量 施用。在本發明的其他實施方式中，該可溶性同種型還可局部施用，如通過直接施用于中樞 神經系統（如脊髓和/或腦）。還可考慮通過腹膜內注射或皮下注射或吸入設備以達到500μ g/kg的更高劑量施用。待治療的受試者優選為哺乳動物，更優選為人患者。
[0025] 該可溶性重組神經調節蛋白-1同種型可作為獨立藥物（即作為單一療法)或組合 藥物（即與其他藥物(特別是其他適合于治療神經性疾病的藥物)組合)施用。尤其在治療阿 爾茨海默氏癥和帕金森氏癥、精神分裂癥、雙相型障礙、抑郁癥或其他神經性疾病中的其他 藥物的例子是:影響兒茶酚胺代謝的化合物、乙酰膽堿脂酶抑制劑，MAO-B-或COMT-抑制劑， 美金剛型通道阻斷劑，多巴胺或5-羥色胺受體激動劑或拮抗劑，兒茶酚胺或5-羥色胺再攝 取抑制劑，以及任何類型的精神抑制藥(如氯氮平、奧氯平或加巴噴丁類藥物）。其他藥物的 其他例是神經保護劑，例如PARP-I抑制劑，如W02006/008118和W02006/008119中所公開，所 述文獻通過引用并入本文。
[0026] 因此，本發明的一個實施方式涉及本文所述的重組的可溶性神經調節蛋白-1同種 型與治療精神障礙(如精神分裂癥、雙相型障礙及抑郁癥)的藥物(如奧氮平或氯氮平)的組 合。進一步實施方式涉及重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型與治療神經退行性疾病（如 帕金森氏癥、阿爾茨海默氏癥、MS或ALS)的藥物的組合。再一實施方式涉及重組的可溶性神 經調節蛋白-1同種型與治療神經性損傷（如中風、創傷性腦損傷或脊髓損傷）的藥物的組 合。
[0027] 可通過將重組的可溶性神經調節蛋白-1同種型與其他藥物以藥物組合物或試劑 盒的形式共施用來實現聯合治療，其中單個藥物可分開施用或共同施用。
[0028] 神經調節蛋白-1同種型可為神經調節蛋白-II型、II型、III型、IV型、V型或VI型 同種型，優選為神經調節蛋白_1β同種型，神經調節蛋白-Ia同種型或感覺神經元和運動神 經元衍生因子(SMDF)同種型，特別是神經調節蛋白_1β同種型，更特別為人神經調節蛋白-1 β同種型。
[0029] 神經調節蛋白1β同種型具有穿過血腦屏障轉運的活性。正如實施例中所顯示的一 樣，神經調節蛋白1?3經靜脈注射/腹膜內注射后在腦中的優秀生物利用度為NRG 1β的治療 應用鋪平了道路。
[0030] 其抗凋亡、穩定髓鞘、抗炎癥特性及與BACE的直接相互作用的組合為治療中風、阿 爾茨海默氏癥、MS和精神分裂癥以及其他神經性疾病創造了機會。
[0031] 如上所述，本申請包括未經修飾的以及經修飾的神經調節蛋白-1同種型（特別是 神經調節蛋白_1β同種型）的用途。有證據表明，在神經調節蛋白_1(特別是其胞外結構域） 的特定氨基酸殘基上發生翻譯后修飾(像蛋白水解加工、磷酸化和糖基化）。尤其已報道了 神經調節蛋白-1可溶性片段的釋放(Buonanno and Fischbach 2001;Fischbach 2007)。可 能的氧化也已被報道(Nadri et al.2007)。
[0032]本發明人證明優選的具有生理學活性的神經調節蛋白_1β同種型包含神經調節蛋 白-1邱勺胞外結構域或其已經翻譯后修飾的一部分。該同種型優選被磷酸化修飾，其中1、2、 3個或者更多個氨基酸側鏈殘基(特別是如Tyr、Ser或Thr的有OH-基團的側鏈殘基)被磷酸 化修飾。優選的磷酸化位點位于79~82位氨基酸，133~136位氨基酸和/或158~161位氨基 酸(根據Falquet et al.，2002命名）。更優選的磷酸化位點位于12~14位氨基酸，30~32位 氨基酸和/或85~87位氨基酸。更潛在的修飾位點是:酰胺化位點(優選位于22~25位和/或 30~33位）；糖基化位點（在150~153位，156~159位和/或204~207位）；及十四酰化位點 (優選位于94~99位，149~154位，168~173位，175~180位和/或202~207位），以上根據 Falquet et al.，2002命名。
[0033]以下將使用優選的藥物指標對本申請的實驗數據的關聯性進行解釋。
[0034]精神分裂癥
[0035]精神分裂癥為一種嚴重并致殘的精神障礙，具有如幻聽、思維混亂以及妄想、情感 缺乏、興趣缺失、感情遲鈍以及冷漠的癥狀。流行病學、臨床學、神經心理學以及神經生理學 研究提供了實質性的證據，證明腦發育以及持續的神經成型異常在其發病機理中扮演著重 要的角色（Arnold et al. 2005) 〇
[0036]認為精神分裂癥包括多巴胺能神經傳遞障礙，而由谷氨酸能神經傳遞調節多巴胺 能系統則扮演著重要的角色。此觀點得到神經調節蛋白和dysbindin基因（其對谷氨酸能系 統具有功能性影響）的遺傳學發現的支持(Muller and Schwarz 2006)。變得越來越明晰的 是，現象表明，可能包含有導致精神分裂癥的基因（包括神經調節蛋白）的多個區域也與雙 相情感障礙有關，此發現得到最近兩篇文章的支持（Farmer et al. 2007 ;0wen et al.2007)。
[0037]神經調節蛋白-1，其是精神病易患基因，作用于神經元迀移、軸突導向與髓鞘的形 成，可潛在解釋精神分裂癥和雙相型障礙中異常的解剖學與功能連接的發現(McIntosh et al.2007)。
[0038]有越來越多的重要證據證明神經調節蛋白1與精神分裂癥之間存在基因上的聯系 (綜述:Farmer et al.，2007)。本文提到了神經調節蛋白-1引起的谷氨酸