單純皰疹病毒i型ul5基因缺失的dna疫苗的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫藥技術領域，尤其涉及一種單純皰疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制備方法。
【背景技術】
[0002] 單純痕疼病毒(Herpes simplex virus，HSV)，屬于痕疼病毒科(Herpesviridae family)，a痕疼病毒亞科(Alpha herpesvirinae familyXHSV病毒為雙鏈DNA病毒，從 外到內含有囊膜、皮層、衣殼及基因組等四種病毒結構。HSV-1是單純皰疹病毒的一種，主 要引起喉、口、眼、臉及神經系統的感染，可引起皰疹性腦炎，唇皰疹等多種疾病。有調查結 果顯示，90%以上的人一生中均會受到皰疹病毒的感染，單純皰疹病毒感染已成為世界上第 四大的傳染性疾病。
[0003] HSV病毒在細胞內的增殖是一個有序的復雜過程，按先后順序HSV病毒的胞內增殖 過程大致可以分為以下幾個階段：1)病毒吸附于宿主細胞膜的表面;2)病毒穿過細胞膜;3) 病毒基因組進入細胞核內；4)病毒基因的表達;5)基因組DNA的復制;6)病毒核衣殼的組裝； 7)病毒顆粒的形成;8)子代病毒的釋放。HSV病毒在細胞內基因組DNA的復制是病毒產生致 病性的必須過程，若缺少該過程，將不能組裝成完整的病毒顆粒，從而嚴重減低對機體的致 病性。
[0004] 病毒減毒活疫苗是最為經典的疫苗形式，傳統的減毒活疫苗主要是通過連續培養 篩選得到的，但這種方法耗時費力，用這種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。 中國專利申請201010253601.5公開了單純皰疹病毒I型基因重組減毒活疫苗及其制備方 法，該減毒活疫苗敲除了單純皰疹病毒I型基因組中的見43、此44、1^45、1^46和1^47基因。 該減毒活疫苗是敲除了其基因組中的復制或感染非必需基因片段，能夠誘導機體的免疫應 答系統，及時清除感染的病毒，抑制感染的進一步發展，但其制備方法有諸多不足之處：（1) 選取擬敲除基因序列上下游700bp至2000bp的同源側翼序列和熒光蛋白基因組成同源 重組框，由于目的片段太長使PCR擴增困難；（2)選擇pShuttle-CMV載體，同源重組框整合到 擬敲除基因的正確位置效率偏低，成功機率不大；（3)用熒光蛋白基因代替擬敲除病毒基因 用于篩選鑒定，雖然此方法快速、簡便，但最終未能將熒光蛋白基因去除，構建的減毒活疫 苗仍表達該蛋白。
[0005] 因此，現有技術存在減毒活疫苗的制備方法復雜、成功效率偏低等缺點。

【發明內容】

[0006 ]為解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種單純皰疹病毒I型UL5基因缺失的 DNA疫苗的制備方法，通過該方法可以制備得到減毒活疫苗，具有疫苗安全有效、不易發生 毒力回復等優點，可有效防治HSV-1的感染。
[0007]本發明提供一種單純皰疹病毒I型UL5基因缺失的DNA疫苗的制備方法，包括如下 步驟： S1單純皰疹病毒I型UL5基因的同源重組敲除，得到不含UL5基因和外源基因的重組菌 株，所述同源重組敲除的重組敲除系統為包含BAC-HSV-1載體和pREDI重組質粒的宿主菌； S2 BAC載體的切除及HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的獲得。
[0008] 優選地，所述步驟S1包括如下步驟： SI. 1 pREDI重組質粒的構建:設計啟動子PrhaB的PCR擴增引物，PCR擴增得到PrhaB片 段;設計I-Scel的PCR擴增引物，PCR擴增得到I-SecI片段;將所述PrhaB片段和所述I-SecI 片段通過重組PCR連接，得到PrhaB-1-SecI片段;將所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 A-red recombinase載體連接，獲得pREDI重組質粒； S1.2重組敲除系統的構建:將所述pREDI重組質粒轉入含BAC-HSV-1載體的宿主菌中， 得到同源重組敲除的重組敲除系統； S1.3 UL5基因同源重組片段的PCR擴增：以所述重組敲除系統的Kam-SacB全片段為 模板，以 CATGACCGCACCACGCTCGCGGGCCCCCACTACGCGTGCGCGGGGGGACACGAITTAITCAACAAAGCCA (SEQ ID N0.1) 為上游引物，以 GGCCGAGGCCTTTTTAAATTTTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGCAAGAATGGCGC(SEQ ID NO . 2 )為下游引物，通過PCR擴增獲得UL5C-Kam-SacB-B片段，再以該片段為模板， GTGAGTCCCCCGGGCCGGGTTCGGTGGAACTGTAAGGGGACGGCGGGTTACATGACCGCACCACGCTCGC(SEQ ID NO ? 3)為上游引物，以GGCCGAGGCCTTITTAAATITTACGTCTATGCACGGGGTGCAGCCAATCCGCATCTTGC AAGAATGGCGC(SEQ ID NO. 4)為下游引物，通過PCR擴增獲得UL5A-C-Kam-SacB-B片段，即UL5 基因同源重組片段； S1.4攜帶正反選擇標記基因的重組菌株的篩選:將所述UL5基因同源重組片段電轉 化至所述重組敲除系統中，通過正向篩選標記基因Kam進行重組細菌的篩選;對轉化獲得 的單克隆進行PCR鑒定，確定篩選的重組菌株UL5基因的成功去除及正反標記基因的正確 插入； S1.5去除正反選擇標記基因的重組菌株的鑒定：鼠李糖誘導I-Scel內切酶合成，切除 Kam-SacB片段，發生第二次同源重組，得到不含UL5基因和外源基因的重組菌株。
[0009] 本發明中重組敲除系統的構建與中國專利申請CN104894046中HSV-1病毒體外基 因敲除系統的構建方案相同，在此將中國專利申請CN104894046的相關內容引入本發明中。
[0010] 優選地，所述步驟S2包括如下步驟： S2.1將所述不含UL5基因和外源基因的重組菌株進行擴大培養，進行質粒抽提，獲得 BAC-17.37 AUL5質粒，電轉化至Ver〇-pCDNA3.1-UL5-Cre細胞，使用含G418的培養基進行培 養，通過藍白斑實驗挑選白斑，反復凍融，離心取上清得到HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗； S2.2將S2.1得到的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗感染Ver〇-pCDNA3.1-UL5細胞，再 通 過藍白斑實驗挑取白斑，反復凍融，離心取上清，得到純化后的HSV-1 UL5基因缺失的 DNA 疫苗。
[0011] 優選地，所述質粒抽提采用BAC大量抽提試劑盒進行;所述含G418的培養基包括 DMEM基礎培養基、1~4%體積百分含量的胎牛血清和0.5~2 ug/ml的G418。
[0012] 優選地，所述Ver〇-pCDNA3.卜UL5-Cre細胞的制備包括如下步驟： A) 以BAC-17.37穿梭質粒為模板，設計引物擴增UL5基因，將該基因片段用BamHI和 BstXI限制性內切酶酶切后亞克隆到p⑶NA3.1 (+)質粒，得到p⑶NA3.1-UL5質粒； B) 通過反轉錄P1噬菌體的RNA，擴增得到Cre基因片段，將所述p⑶NA3.1-UL5質粒和Cre 基因片段經BamHI酶切后用T4連接酶進行連接，挑選單克隆進行Cre基因和UL18基因的PCR 鑒定和測序，得到真核表達P⑶NA3.1-UL5-CRE質粒； C) 將所述PCDNA3.1-UL5-CRE質粒利用lipo2000脂質體轉染到Vero細胞內，使用G418溶 液進行篩選，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE細胞。
[0013] 優選地，所述Vero_pCDNA3.1-UL5細胞的制備包括如下步驟： A) 以BAC-17.37穿梭質粒為模板，設計引物擴增UL5基因，將該基因片段用BamHI和 BstXI限制性內切酶酶切后亞克隆到p⑶NA3.1 (+)質粒，得到p⑶NA3.1-UL5質粒； B) 將所述PCDNA3.1-UL5質粒利用lip〇2000脂質體轉染到Vero細胞內，使用G418溶液進 行篩選，得到Ver〇-pCDNA3 ? 1-UL5細胞。
[0014] 優選地，所述UL5基因的擴增引物包括:上游引物:AATTGGATCCGAGCGTGGTGCG
[0015] 與現有技術相比，本發明的有益效果包括： (1)本發明提供的制備方法簡單、高效，制得的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗不易發 生毒力回復，其病毒度滴度和感染能力明顯減弱，保留了較高的免疫原性，進入機體后僅能 刺激機體產生免疫應答而無致病作用，安全有效。
[0016] (2)本發明提供的HSV-1 UL5基因缺失的DNA疫苗的制備方法合理、簡單、高效， BAC載體上的red基因表達能夠提高同源重組效率，鼠李糖誘導的I -See I內切酶合成使基因 組發生第二次同源重組，切除外源性抗性基因和SacB基因，在敲除目的基因的同時未引入 外源基因，可控性強。
[0017] (3)構建的Ver〇-pCDNA3.1-UL18-CRE細胞可以在切割去掉BAC質粒的同時，還可以 提供基因缺失病毒株生長所需的VP23蛋白，使得HSV-1 UL18基因缺失減活疫苗得到順利的 純化篩選，提高了純化效率。
【附圖說明】
[0018] 圖1 Cre基因的PCR擴增產物驗證電泳圖；其中，M指DNA marker，1指Cre基因目標 條帶。
[0019]圖2 UL5基因的PCR擴增產物驗證電泳圖；其中，M指DNA marker，l指陽性對照，2指 UL5基因目標條帶。
[0020]圖3去除正反選擇標記基因的PCR擴增產物驗證電泳圖；其中A指UL5基因的驗證 電泳圖，B指Kam片段的驗證電泳圖，C指SacB片段的驗證電泳圖，M指DNA marker，P指陽性對 照，N指陰性對照。
【具體實施方式】
[0021]下面結合附圖和實施例對本發明做進一步詳細說明。
[0022]實施例1 UL5基因表達載體的真核細胞株的構建 以BAC-17.37穿梭質粒為模板，設計引物（SEQ ID N0.5、SEQ ID ^).6)擴增此5基因 (2696bp)，將該基因片段用BamHI和BstXI限制性內切酶酶切后亞克隆到pCDNA3.1( + )質粒 (購自優寶生物公司，貨號VT1001)，得到pCDNA3 ? 1-UL5質粒； 通過反轉錄P1噬菌體的RNA，擴增得到Cre基因片段，將所述p⑶NA3.1-UL5質粒和Cre基 因片段經BamHI酶切后用T4連接酶進行連接，挑選單克隆進行Cre基因和UL5基因的PCR鑒定 和測序，結果如圖1和圖2所示，得到真核表達p⑶NA3.1-UL5-CRE質粒； 將所述PCDNA3.1-UL5-CRE質粒利用lipo2000脂質體（購自invitrogen，貨號為11668-019 )轉染到Vero細胞(購自美國ATCC公司）內，使用lmg/ml濃度的G418溶液(購自東巨化 工公司）進行篩選，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5-CRE細胞。
[0023] 將所述pCDNA3.1-UL5質粒利用lipo2000脂質體轉染到Vero細胞內，使用lmg/ml濃 度的G418溶液進行篩選，得到Ver〇-pCDNA3.1-UL5細胞。
[0024] 實施例2 HSV-1 UL5基因的同源重組敲除 2.1 pREDI重組質粒的構建 設計啟動子PrhaB的PCR擴增引物，PCR擴增得到PrhaB片段(2. Okb);設計I-Scel的PCR 擴增引物，PCR擴增得到I-SecI片段(0.7 kb);將所述PrhaB片段和所述I-SecI片段通過重 組PCR連接，得到PrhaB-1-SecI片段；將所述PrhaB-1-SecI片段和pKD46 A-red recombinase載體連接，獲得pREDI重組質粒。pREDI重組質粒具有由L-阿拉伯糖誘導啟動 的入-red recombinase，以及由鼠李糖誘導啟動的I-SecI內切酶基因。
[0025] 2.2重組敲除系統的構建 將構建的pREDI重組質粒轉入含BAC-HSV-1載體的宿主菌中，宿主菌為EPI300E.Coli， 得到同源重組敲除的重組敲除系統。
[0026] 2.3 UL5基因同源重組片段的PCR擴增 以重組敲除系統的K a m - S