華支睪吸蟲分泌型磷脂酶a2蛋白在制備腫瘤治療藥物中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白在制備腫瘤 治療藥物中的用途。
【背景技術】
[0002] 現有針對華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白（亦即，CssPLA2蛋白，GenBank登錄號： ABL07371.1)的表達技術只能以包涵體形式表達出無生物活性的華支睪吸蟲分泌型磷脂酶 A2蛋白，由于所表達出的華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白不具有生物活性，而不能用于進 行該蛋白的功能研究。即使進行復雜的蛋白復性技術處理后，所得蛋白的生物性活性仍然 相當低。
[0003] 例如：現有文獻F·Hu et al ·/Molecular & Biochemical Parasitology 167 (2009)127-134以華支睪吸蟲cDNA文庫編號為Cs4e05的質粒為模板，應用設計的特異引物， 進行PCR擴增目的基因。將目的基因和原核表達質粒pET-28a酶切、回收、連接及轉化，構建 重組質粒pET-28a-CssPLA2.將構建的重組質粒轉化入BL21(DE3)感受態細胞，將CssPLA2重 組工程菌液大量培養、IPTG誘導表達后，重組蛋白以包涵體形式表達，12%SDS-PAGE電泳顯 示在分子量約34kDa處出現一明顯條帶。由于重組蛋白以包涵體形式表達，破菌得到的包涵 體經6M尿素變性、稀釋和透析復性后，經過金屬離子親和層析柱，在不同低濃度咪唑梯度漂 洗后，用200mmol/L咪唑洗脫，獲得分子量約34kDa的單一蛋白。MTT法和流式細胞儀檢測了 CssPLA2蛋白刺激人肝星狀細胞LX-2增殖，半定量RT-PCR檢測了 CssPLA2蛋白可促進人肝星 狀細胞LX-2ΙΠ 型膠原的mRNA表達上調，從而導致肝纖維化。
[0004] 至今，現有技術中尚未見實現華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白（CssPLA2蛋白）在 腫瘤治療領域中的報道。

【發明內容】

[0005] 為了克服現有技術中所存在的問題，本發明的目的在于提供華支睪吸蟲分泌型磷 脂酶A2蛋白（亦即，CssPLA2蛋白）在制備腫瘤治療藥物中的用途。
[0006] 為了實現上述目的以及其他相關目的，本發明采用如下技術方案：
[0007] 本發明的第一方面，提供了 CssPLA2蛋白在制備腫瘤治療藥物中的用途。
[0008] CssPLA2 蛋白，GenBank 登錄號：ABL07371.1。
[0009] 優選地，CssPLA2蛋白單獨作為有效成分在制備腫瘤治療藥物中的用途。
[0010]優選地，所述腫瘤選自膽管癌。
[0011] 進一步優選地，所述腫瘤選自肝門部膽管癌。
[0012] 優選地，所述CSSPLA2蛋白為重組CSSPLA2蛋白。
[0013] 進一步優選地，所述重組CssPLA2蛋白，含有CssPLA2蛋白和MBP標簽蛋白。
[0014] 優選地，所述CssPLA2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示，具體為：
[0015] KPRSISRDKPHAELEffSGKLSDNQTIHIffTVASKGLFGEISKPAffIQVDIRGSNSSQDAIRLIFDQEHRLRYCVFGT DTVETSVSLDDADLLTRNPIYLEHFFFTSANEFLRACKELRRASEEPAKLVRRPRTAYRANPMIMPGTLWCGKGNAA TRERTFGDEIETDMCCRTHDRCFENIQSLTSKFGYYNPSPVTISNCECDDEFLSCLENAGTEAATRVGNLYFNVFKI PCFLRRTERICTHNDESGACGQFENREDIELFRPQRFVAPYITV〇
[0016] 優選地，所述MBP標簽蛋白的氨基酸序列為pMAL-c2X質粒上MBP標簽蛋白編碼序列 所對應的氨基酸序列。
[0017] 優選地，CSSPLA2蛋白的N端與MBP標簽蛋白的C端連接。
[0018] 優選地，所述CssPLA2蛋白和MBP標簽蛋白之間通過連接肽連接。
[0019]進一步優選地，所述連接肽的氨基酸序列是pMAL-c2x質粒上MBP標簽蛋白編碼序 列之后到Xbal酶切位點之前的核苷酸序列所對應的氨基酸序列。
[0020] 本發明的第二方面，提供了一種腫瘤治療藥物制劑，含有前述CSSPLA2蛋白和藥學 上可接受的載體。
[0021] "藥學上可接受的"成分是適用于人和/或動物而無過度不良副反應(如毒性、刺激 和變態反應）即有合理的效益/風險比的物質。"藥學上可接受的載體"是用于將本發明的 CssPLA2蛋白傳送給動物或人的藥學上或食品上可接受的溶劑、懸浮劑或賦形劑。載體可以 是液體或固體。
[0022] 藥學上可接受的載體為各種藥學上常用的輔料和/或賦形劑，包括(但不限于)糖 類(如乳糖、葡萄糖和蔗糖），淀粉(如玉米淀粉和土豆淀粉），纖維素及其衍生物(如羧甲基 纖維素鈉、乙基纖維素和甲基纖維素），黃蓍膠粉末，麥芽，明膠，滑石，固體潤滑劑(如硬脂 酸和硬脂酸鎂），硫酸鈣，植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄欖油、玉米油和可可油，多元 醇（如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇），海藻酸，乳化劑(如Tween、聚氧乙烯 蓖麻油），潤濕劑(如月桂基硫酸鈉），著色劑，調味劑，壓片劑、穩定劑，抗氧化劑，防腐劑， 無熱原水，等滲鹽溶液和磷酸鹽緩沖液等;該載體可根據需要提高配方的穩定性、活性及生 物有效性等。
[0023]本發明藥物制劑使用時，所述CssPLA2蛋白作為唯一有效成分，或者所述CssPLA2 蛋白作為有效成分之一，可與一種或多種藥學上可接受的載體或賦形劑混合制成不同給藥 途徑的藥物劑型。
[0024] 優選地，所述藥物制劑的形式為片劑、膠囊、散劑、顆粒劑、糖漿劑、溶液劑、口服 液、醑劑、酊劑、氣霧劑、粉霧劑、注射劑、注射用無菌粉末，或者栓劑。上述制劑類型可以按 照藥劑學(第六版，人民衛生出版社，崔福德）中的相關定義理解，上述制劑的制備可以按照 藥劑學(第六版，人民衛生出版社，崔福德）中的相關制劑的方法配制。
[0025] 優選地，所述藥物組合物的制劑形式為片劑或口服液。
[0026] 優選地，本發明所述藥物制劑可經過口服、靜脈內、肌內或皮下途徑給藥。
[0027] 優選的，本發明的藥物制劑生產時可以通過濾膜過濾除菌，或者進行高壓滅菌。 [0028]本發明的第三方面，提供了一種治療膽管癌的方法，包括步驟:將含有CssPLA2蛋 白的腫瘤治療藥物制劑施用于患者。
[0029] 所施用的劑量可由醫師根據病情決定。
[0030] 與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
[0031]本發明經過廣泛而深入的研究，首次發現了華支睪吸蟲分泌型磷脂酶A2蛋白 (CssPLA2蛋白）對膽管癌細胞的生長有顯著抑制作用，抑制率高達86%以上。亦即，本發明 首次發現了 CssPLA2蛋白在制備膽管癌治療藥物中的新用途。
【附圖說明】
[0032]圖I :CssPLA2目的基因 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳鑒定圖，其中M:DNA標準分子量；1: ddH20陰性對照;2: CssPLA2目的基因 PCR產物。
[0033] 圖2:重組質粒pMAL-c2X/CssPLA2的雙酶切鑒定圖，M1，M2:DNA標準分子量；1:空質 粒XbaI和HindIII雙酶切;2:重組質粒XbaI和HindIII雙酶切;3:CssPLA2目的基因 PCR產物。
[0034] 圖3:重組質粒?]\仏1^-〇2乂/^88?1^2在大腸埃希菌此21/^^3的表達產物的12%303- PAGE電泳分析圖，M:蛋白標準分子量；1:重組質粒pMAL-c2X/CssPLA2IPTG誘導前;2:重組質 粒 pMAL-c2X/CssPLA2IPTG 誘導后上清；3:重組質粒 pMAL-c2X/CssPLA2IPTG 誘導后沉淀；4: 樹脂親和純化后重組CssPLA2蛋白。
[0035]圖4:陰離子交換層析法純化重組CssPLA2蛋白（即MBP-CssPLA2融合蛋白）。
[0036] 圖5:12 % SDS-PAGE分析純化重組CssPLA2蛋白的純度。
[0037] 圖6:Western blotting鑒定重組CssPLA2蛋白。
[0038] 圖7:質譜(Mass spectrum)鑒定重組CssPLA2蛋白。
[0039] 圖8:重組CssPLA2蛋白酶活性測定圖，sPLA2(分泌型磷脂酶A2)酶活檢測試劑盒檢 測出實施例1中所得重組CssPLA2蛋白（MBP-CssPLA2融合蛋白）具有酶活性。
[0040] 圖9:溫度對重組CssPLA2蛋白酶活性的影響。
[0041 ] 圖10:酶濃度對重組CssPLA2蛋白酶活性的影響。
[0042]圖11:底物濃度對重組CssPLA2蛋白酶活性的影響。
[0043] 圖12:CCK8檢測MBP-CssPLA2對人膽管癌FRH細胞的生長抑制作用;ESP(華支睪吸 蟲分泌排泄蛋白）、MBP蛋白（麥芽糖結合蛋白，作為對照）、重組CssPLA2蛋白和PBS(陰性對 照組)分別孵育膽管癌FRH細胞，24小時(A)、48小時(B)、72小時(C)后分別用CCK8試劑檢測 細胞450nm吸光度；由圖可見，72小時后，25ug/ml的MBP-CssPLA2明顯抑制了人膽管癌FRH細 胞的生長，抑制率大約在86%以上。
[0044] 圖13:其中，圖13A:25ug/ml ESP(華支睪吸蟲分泌排泄蛋白）、圖13B:25ug/ml MBP 蛋白（麥芽糖結合蛋白，作為對照）、圖13C: 25ug/ml重組CssPLA2蛋白、圖13D:促凋亡劑（陽 性對照）、圖13E: PBS (陰性對照)分