一種用于促進顱腦損傷后神經功能修復的組合物及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及神經干細胞領域，具體而言涉及一種包含膠原、含膠原結合區(CBD)的 神經營養因子、以及表達Trk受體的神經干細胞的組合物及其制備方法。本發明還涉及該組 合物在促進神經功能修復，優選顱腦損傷后的神經功能修復，尤其優選外傷性顱腦損傷后 的神經功能修復中的用途。
【背景技術】
[0002] 外傷性顏腦損傷(traumatic brain injury,TBI)是常見的致殘性疾病。在美國每 年有170萬人罹患TBI，TBI導致的死亡人數約占美國每年因傷死亡總數的三分之一。在我國 TBI主要的發病原因是交通事故。近年來我國經濟的快速發展，汽車保有量成倍增加，TBI已 經成為一個沉重的公共衛生問題。
[0003] 在過去的20年里，由于急救、影像、重癥監護和康復等學科的進展，TBI患者的護理 水平已明顯提高。但是，仍沒有確切的臨床治療手段能逆轉TBI病理進程、改善遺留的神經 系統功能障礙。
[0004] TBI的病理生理過程可分為三個階段。早期，原發損傷的應激使腦血流減少，使神 經元因發生興奮性中毒而死亡，減少的腦血流使大腦代謝水平下調，最終局部能量被耗竭。 中期，細胞因子和趨化因子釋放，神經炎癥反應開始加強，血腦屏障破壞，使得循環中的免 疫調節因子得以進入中樞神經系統，這進一步加重神經炎癥。晚期，修復活動開始，神經網 絡重構。
[0005] 隨著對TBI病理認識的逐漸深入，干細胞替代修復療法越來越多的用于TBI的治 療，包括刺激內源性干細胞及外源性干細胞植入。在創傷性顱腦損傷發生后，中樞神經系統 可以動員內源性的神經干細胞來對受損的區域進行修復，但是數量有限。常用于中樞神經 系統疾病治療的外源性干細胞主要有神經干細胞、間充質干細胞和胚胎干細胞等。
[0006] 快速流動的腦脊液能帶走位于目標組織的干細胞，移植的干細胞通常在幾小時至 幾天內丟失，造成移植細胞濃度不足影響治療效果。為了獲得更好的療效，移植的干細胞最 好能夠固定在目標組織中以保持足夠的局部細胞濃度。另一個影響干細胞治療療效的主要 因素是細胞成活率低，這可能同移植造成的機械損傷、移植細胞的占位效應、急性炎癥、免 疫反應等因素有關。因此，一個合適的環境對于提高移植干細胞的生存至關重要。
[0007] 神經干細胞(NSC)療法在創傷性顱腦損傷的臨床前研究中顯示出明顯的治療作 用，目前神經干細胞移植方法主要包括：1、細胞懸液立體定位腦內注射法；2、靜脈/動脈內 細胞懸液輸入法;3、細胞懸液蛛網膜下腔注射法。但是，現有神經干細胞移植方法存在以下 缺點：1)局部干細胞及神經生長因子濃度不足:動靜脈血管內輸入神經干細胞，神經干細胞 迀移到損傷灶的數量有限；對于蛛網膜下腔腦內注射法，快速流動的腦脊液會帶走位于目 標組織的干細胞及神經生長因子，影響治療效果;立體定向腦內注射法雖然局部干細胞濃 度較高，但干細胞周邊的微環境差，缺乏細胞賴于生存的營養因子，細胞難以較長時間的存 活，很快死亡。2)損傷灶內炎性、免疫抑制環境:損傷灶內產生大量細胞、化學及免疫調節因 子，影響神經干細胞存活。

【發明內容】

[0008]本發明通過生物工程方法，將制備出具有結合膠原結合區（Collagen binding (1〇11^;[11，030)的神經營養因子3(116111'01：1'(^11；[113，階3)。具有良好的生物容性、可降解、多孔 的膠原通過結合含CBD的NT3(CBD-NT3)，為神經干細胞(NSC)提供良好的微環境。同時利用 生物工程方法將編碼Trk C(NT3的受體）的多核苷酸轉入神經干細胞，增強神經干細胞同 NT3的結合能力。膠原、NT3、神經干細胞，三者通過生物工程技術的連接，提高了腦損傷灶周 圍的神經干細胞及NT3的濃度，極大改善了神經干細胞的微環境，促進神經干細胞的存活及 對外傷性顱腦損傷的治療作用。
[0009] 本發明的多肽與現有技術相比所具有的有益效果在于：1、膠原疏松多孔的特性將 神經干細胞固定在損傷灶周邊，減少了干細胞的流失，維持干細胞在局部的治療濃度；另 外，膠原內的CBD-NT3和膠原特異性結合，使得神經營養因子NT3在神經干細胞周邊的微環 境中有持續的高濃度，表達Trk C的神經干細胞又增強了和NT3的結合能力，從而促進了神 經干細胞的存活、增殖和分化;2、顱腦損傷灶內空腔形成后再注射我們優化的神經干細胞 體系，此時炎性反應減退，能減少神經干細胞的凋亡；另外，空腔的存在使得結合膠原的神 經干細胞移植物注入腦內后不會對周圍腦組織產生占位壓迫效應。
[0010] -方面，本發明提供一種促進神經功能修復的組合物，其包含:膠原，優選膠原凝 膠;含CBD的神經營養因子，所述神經營養因子選自神經生長因子(Nerve Growth Factor， NGF)、腦源神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF)、NT4/5和NT3,優選 NT3,更優選所述NT3的氨基酸序列如SEQ ID No. I所示；以及表達Trk受體的神經干細胞，所 述Trk受體選自Trk A、Trk B和Trk C，優選Trk C，更優選所述TrkC的氨基酸序列如SEQ ID No. 3所示。
[0011] 進一步地，CBD的氨基酸序列如SEQ ID No.7所示。
[0012]進一步地，CBD與神經營養因子通過連接肽連接，優選連接肽的氨基酸序列如SEQ ID No .9所示。
[0013] 進一步地，含CBD的神經營養因子是含CBD的NT3，優選含CBD的NT3的氨基酸序列如 SEQ ID No .5所示。
[0014] 進一步地，膠原與含CBD的神經營養因子的比例為40ng: 0.8-1.2ml，優選為40ng: Iml;膠原與表達Trk受體的神經干細胞的比例為50μ1:0.8-1.2 X IO6個，優選為50μ1:1 X IO6 個。
[0015]進一步地，含CBD的神經營養因子與膠原特異性地結合，優選含CBD的ΝΤ3與膠原凝 膠特異性地結合。
[0016] 進一步地，Trk C是ΝΤ3的受體，表達Trk C的神經干細胞可以和ΝΤ3結合。
[0017]進一步地，膠原凝膠是可注射的。
[0018] 另一方面，本發明提供一種促進神經功能修復的組合物的制備方法，其包括：
[0019] 1)構建編碼含CBD的神經營養因子的多核苷酸的第一載體，其中所述神經營養因 子選自NGF、BDNF、NT4/5和ΝΤ3,優選ΝΤ3,更優選編碼含CBD的ΝΤ3的多核苷酸的序列如SEQ ID No.6所示；
[0020] 2)將第一載體轉化至宿主細胞并表達，從而獲得含CBD的神經營養因子；
[0021] 3)將含CBD的神經營養因子與膠原混合；
[0022] 4)構建編碼Trk受體的多核苷酸的第二載體，然后將第二載體轉染神經干細胞，從 而獲得表達Trk受體的神經干細胞，其中所述Trk受體選自Trk A、Trk B和Trk C，優選Trk C，更優選編碼Trk C的多核苷酸的序列如SEQ ID No.4所示；
[0023] 5)將含CBD的神經營養因子與膠原混合后的混合物和表達Trk受體的神經干細胞 混合，從而獲得促進神經功能修復的組合物，
[0024] 其中步驟4)于步驟1)至3)中任一步驟之前或之后進行。
[0025]進一步地，將第二載體轉染神經干細胞的轉染復數為100、200、300、500，優選為 100〇
[0026]進一步地，膠原為膠原凝膠。
[0027] 進一步地，含CBD的神經營養因子與膠原以40ng:0.8-1.2ml，優選40ng: Iml的比例 混合;含CBD的神經營養因子與膠原混合后的混合物和表達Trk受體的神經干細胞按照50μ 1:0 · 8-1 · 2 X IO6個，優選50μ1:1 X IO6個的比例混合。
[0028] 進一步地，含CBD的神經營養因子中CBD與神經營養因子通過連接肽連接，優選編 碼連接肽的多核苷酸的序列如SEQ ID No. 10所示。
[0029] 進一步地，編碼CBD的多核苷酸的序列如SEQ ID No.8所示。
[0030] 進一步地，編碼NT3的多核苷酸的序列如SEQ ID No.2所示。
[0031 ]進一步地，用于構建第一載體的表達載體為原核表達載體，原核表達載體選自 PGEX-4T-1 和 pET28a，優選 pET28a。
[0032] 進一步地，用于構建第二載體的病毒載體選自逆轉錄病毒、慢病毒和腺病毒載體， 優選腺病毒載體;腺病毒載體可為第一代腺病毒載體、第二代腺病毒載體、第三代腺病毒載 體，優選第三代腺病毒載體。
[0033] 進一步地，宿主細胞可為大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細胞、昆蟲細胞等，優選大腸 桿菌；大腸桿菌可為E.coli