專利名稱:包新形狀顆粒高免疫原性乙肝表面抗原的制備方法
本發明是關于一種可用作為疫苗或疫苗中間體的顆粒溶液或懸液。本發明是關于含有新形狀顆粒、高免疫原性乙肝表面抗原制備的方法。本發明涉及含有該物質的抗原的滅活過程，滅活是通過加熱于高濃度抗原性物質而完成的，高濃抗原性物質就是指在其中不需加入諸如白蛋白之類的蛋白質給以稀釋的意思。本發明是關于該抗原組合物制備的方法，此抗原組合物可用于免疫動物，尤其是可免疫人類。
多年前，Alyred M.Prince對于乙肝表面抗原和乙肝病毒的關系曾明確的給以闡明(Pro.Nat.Acad.Sci.U.S.，60814-821，1968)。此抗原主要位居埋于脂蛋白顆粒的膜蛋白上，此脂蛋白顆粒具有大小約為18-24納米的顆粒和同樣大小直徑的絲狀物。現知，這些顆粒和絲狀物形成膜的片斷相當于乙肝病毒粒子的圍繞物，也就是“Dane”顆粒。
此后，Blumberg etal.在美國專利中(專利號3，636，191)，公布了含有這種顆粒的疫苗。以后，Prince etal.公布了另一種乙肝病毒疫苗，此疫苗含有由“Dane”顆粒和絲狀物而來的膜蛋白。這些“Dane”顆粒和絲狀物相當于乙肝e抗原或與乙肝e抗原有關，乙肝e抗原見于許多慢性乙肝病毒攜帶者體內。
由于上述工作的開展，在美國采用了抗乙肝病毒的疫苗，此疫苗含有乙肝表面抗原顆粒。此疫苗是由慢性乙肝病毒感染病人的血漿中取得含顆粒的乙肝表面抗原，再以酶消化法制備而成，上述美國專利(專利號3，636，191)中對此有些敘述。該疫苗是以耗資巨大的純化過程制備而成，并造成大量免疫原性的丟失。其結果，為了保證有足夠的免疫反應，就必須加大所制成的抗原(乙肝表面抗原)的劑量。因為這些因素，使用該疫苗時，其價格相當昂貴，每個劑量約需30美元或更高。因為免疫時必須有初次注射和二次加強注射，故在美國，抗乙肝病毒免疫開支約為100美元。像這樣的開支，在世界上需要疫苗數量十分巨大的那些國家和地區是負擔不起的。
因此，提供一種含乙肝表面抗原的、本質上更純形狀的、具有大大增強免疫原性的乙肝疫苗成為人們所期望，以便可以使用更小的劑量和較少的開支。當然，同樣重要的是感染性病毒進入血漿之始必須是完全滅活的，以保證無感染之危險。
乙肝感染大部分是涉及居住在亞洲和非洲發展中國家的人們，這些國家用于公共衛生事業基金有限。在20世紀，提供這樣一種疫苗，保護億萬人民免遭乙肝病毒的感染，繼而免遭續發的肝硬變和肝癌的危險，而且提供疫苗的費用又是人們可以負擔的起的，這確是一件迫切而有意義的事。在許多發展中國家，假若使用疫苗，其免疫費用必須在每人1美元以下。
在共同未決專利申請中(專利申請號656833)公布了一個制備疫苗或疫苗中間體的方法，此疫苗或疫苗中間體的特征在于含顆粒乙肝表面抗原極大限度地轉變為一種在自然界尚未見過的新形態，這些新形狀驚人地加強了免疫原性。
根據在那里報告的實驗，含該物質的高濃度乙肝表面抗原的制備步驟是
1.由血漿中沉淀乙肝表面抗原，例如，人血漿中含有乙肝表面抗原，加入聚乙二醇將乙肝表面抗原與血清中所含的其它血清蛋白分離開;
2.將分離得到的乙肝表面抗原通過羥基磷灰石柱的負吸附作用，進一步除去大部血清蛋白;
3.將負吸附的乙肝表面抗原經等密度離心處理，以分離存留下的完整的“Dane”顆粒并進一步除去殘存、夾雜的血清蛋白;
4.將離心分離得到的顆粒經加熱滅活處理，顆粒加熱處理時的濃度為0.5-10mg/ml，溫度為101-104℃，2-5分鐘。此后，將加入顆粒冷卻，例如，將顆粒通過冷水浴冷卻。
上述第四步驟中加熱滅活的一步必須要使蛋白質濃度不斷處于穩定之中，以避免顆粒的變性。
現已令人驚奇地發現，上述第三步得到的物質可以在不加入任何乙肝表面抗原穩定劑的條件下加熱滅活，即在含顆粒的乙肝表面抗原中不加入諸如白蛋白之類物質的稀釋劑。還進一步發現，加熱滅活不僅提供一個不含白蛋白的組合物，而且這一組合物具有新的乙肝表面抗原的形態樣式，易于以電子顯微鏡觀察。
可以相信，血清中存在的其它病毒(例如人類血清)，以同樣的滅活方法可得到其它抗原體尤其是病毒的高濃抗原性組合物，假若對病原體的滅活是按照本發明的方法，即不加入諸如辛酸鈉穩定的白蛋白穩定劑的方法，此高濃抗原性組合物還可作為疫苗或疫苗中間體使用。應注意到提供一個盡可能純的疫苗，即幾乎含外源蛋白(如白蛋白)是有很大優點的。
這樣，本發明顯然地涉及病毒滅活的改進方法，制成含該病毒和抗原組分的高濃物質并加熱滅活之。其中該高濃物質乃由含有上述病毒的血清獲得，而血清蛋白應根本上除去。在加熱滅活該高濃物質的處理中不需加入蛋白性稀釋劑穩定之。在抗原組分的濃縮期間，或在病毒的加熱滅活期間，整個過程完成的任何時間最好都不加入蛋白。在此以后，如果愿意的話，可以在高濃物質中加入諸如蛋白的稀釋劑;(如血清白蛋白)或加入佐劑。也可加入生理鹽水稀釋以供注射使用或供進一步的處理使用。病毒的加熱滅活是加熱含抗原組分的高濃物質，即乙肝表面抗原顆粒，顆粒濃度為0.5-10mg/ml，溫度為101-104℃，2-5分鐘，此后，將加熱了的顆粒冷卻，例如，將顆粒置于冰浴之中。
總之，乙肝疫苗的制備，根據本發明的步驟如下
1.由血漿中沉淀乙肝表面抗原，例如，在人的含有乙肝表面抗原的血漿中加入聚乙二醇，將乙肝表面抗原與血清中含有的其它蛋白質分離開;
2.將分離出的乙肝表面抗原通過羥基磷灰石柱負吸附，進一步除去大部血清蛋白;
3.將負吸附的乙肝表面抗原經等密度離心，分離出存留下來的完整的“Dane”顆粒，并進一步除去殘存，夾雜的血清蛋白;
4.將如此離心分離得到的顆粒經加熱滅活處理。處理時不加入蛋白性稀釋劑，顆粒濃度為0.5-10mg/ml，溫度為101-104℃，2-5分鐘。此后，將加熱的顆粒置于冰水中冷卻之。
根據本發明，該物質經上述1至3各步處理后，含顆粒乙肝表面抗原的蛋白重量與樣本蛋白總重量之比，至少應為95%，最好應為99%。加熱滅活期間，在該組合物內，不需加入辛酸鈉處理的白蛋白作為稀釋劑穩定之。這樣，加熱滅活過程是在沒有穩定劑，也沒有其它血漿蛋白的條件下進行的。
加熱滅活最好是在101-104℃下進行，將第三步得到的沒有稀釋的純顆粒溶液通過一個2mm直徑的管子，(例如銅管子或不銹鋼管子等)該管浸入101-104℃的熱介質中，(例如油浴)加熱的總延長時間為2.5-6分鐘。應該認識到本發明采用的方法有時要求溶液在管內不斷加熱至101-104℃，因此，“總加熱時間”要長于溶液真實加熱至101-104℃的時間。當然，二者之差取決于溶液在管內的流速。
應該認識到，當溶液在管內不斷流動著瞬時加熱時，必須要提高壓力以克服溫度100℃以上時，溶液蒸發所產生的阻力。這一問題，可用高壓液相色譜泵和一個連在接受瓶上的水靜壓控制接頭來解決。
如果愿意的話，可對第三步得到的純化抗原，以諸如吐溫80的清潔劑(例如等容積的2%吐溫80加入等容積水中)進行附加的滅揮處理。這一處理可進一步加強疫苗的安全性。然而，最好除去清潔劑處理這一步，因為，滅活過程沒有進行清潔劑處理，產品有更高的免疫原性。
需要時也可以經瞬時加熱滅活步驟處理后，將收獲的純化的病毒滅活顆粒溶液加入佐劑使之吸附于磷酸鋁鹽或氫氧化鋁凝膠上。為了在熱帶國家使用，在加入凝膠鋁之前，可將疫苗冷凍干燥，如果需要，可在疫苗加水溶解后，再加入凝膠鋁。
此后，用諸如0.15M氯化鈉的生理性介質稀釋而制成疫苗的最終產品。
乙肝表面抗原疫苗最終產品含蛋白濃度為0.1-10微克/毫升。適宜的注射劑量取決于接受注射人的年令。成年男性的使用乙肝表面抗原的標準劑量在1至10微克之間，可肌肉、皮下或皮內注射。
圖1表明以瞬時熱處理由小園顆粒產生的絲狀物形態a.線形絲狀物;b.封閉的環形絲狀物;c.分支形絲狀物;d.開放的環形絲狀物;e.分支的環形絲狀物;f.多分支的絲狀物。
圖2圖示本發明制備疫苗的方法。
圖3表示上述第1至第3步處理得到的含顆粒乙肝表面抗原以磷鎢酸負染色的電鏡照片。此顆粒未經本發明瞬時加熱的處理，故含有的乙肝表面抗原顆粒的形態主要為18-24mm的球形顆粒。
圖4為與圖1相似的電鏡照片，表示含顆粒乙肝表面抗原經加熱處理后，顆粒轉變為線形、分支形和環形的絲狀物形態。
圖5為與圖3、圖4相似的上清部分的電鏡照片，此上清部分由圖4所示的溶液離心20分鐘，8000g轉速，經過濾后而得之上清產物。
圖6為與圖3到圖5相似的電鏡照片，此圖6的樣品是通過由離心20分鐘，8000g轉速所得之沉淀物，重新懸于原容積的等滲鹽水中制成。
圖7為與圖3到圖6相似的電鏡照片。圖7的樣品表示以本發明制備的含顆粒乙肝表面抗原瞬時熱處理時，加入3mg/ml辛酸鈉處理的血清白蛋白。電鏡下得到同樣的形態結構，但由于辛酸鈉處理的血清白蛋白的同時存在，使含顆粒乙肝表面抗原在電鏡下不易見到。
圖8顯示在小鼠體內，加熱滅活對純化的乙肝表面抗原免疫原性的效應。該抗原形態已表示在圖3至圖6之中。
此后，在不加入穩定劑或蛋白稀釋劑的情況下，將組合物用0.22微米的過濾膜，過濾處理;在如上所述的給以一定壓力的情況下，將該組合物過濾液通過一個0.1-10mm直徑，最宜為3mm直徑的不銹鋼管子(此管置于102-105℃油浴中)，加熱滅活，101-104℃下，1-15分鐘，最宜為2-5分鐘。給予的壓力必須可足夠地克服沸騰蒸汽壓，即800到1000mm汞柱或900-1000mm汞柱。
然后，將該加熱溶液收集在管子內，管內置于冰水中，使加熱物質冷卻。一般，在熱處理停止后，不斷冷卻，5分鐘內可降至2-4℃。然而，為獲得最好結果，可將溶液通過二級管圈，管圈置于不同溫差的水浴中，如20-100℃或75-90℃。
然后，在瞬時加熱滅活并純化的含該物質乙肝表面抗原中加入佐劑，適宜使用的佐劑為磷酸鋁鹽。一般，將事先消毒滅菌的磷酸鋁鹽在無菌操作下，加入滅活并稀釋的抗原中，每一毫升稀釋的抗原加磷酸鋁鹽0.3-0.6mg。此后，無菌下，將含佐劑組合物裝于適當的容器包裝內，再經“巴氏消毒”，(65℃下10小時)，作為附加的消毒以進一步保證最終產品的安全性。在使用疫苗免疫前，疫苗應保存于2-6℃下，有效期三年。
用上述方式純化乙肝表面抗原，如上述的加熱辦法處理未稀釋的含顆粒乙肝表面抗原，其結果，在沒有穩定劑同時存在的情況下，含顆粒乙肝表面抗原成形的形態與專利號;656，833專利中所述的形態一致。這一過程不僅避免了加入穩定劑/稀釋劑而帶來的消費，而且使一種更為容易的監測系統，確認以本發明的方法制成的新形態成為可能，這些新形態在電鏡下更易于見到。而初始的含顆粒乙肝表面抗原一般是球形，大小為18-24納米(圖3)，經本發明的方法處理后，該顆粒衍化并大部轉變為更多形態絲狀物，見于圖1，4，6，特別是，從圖4到圖7，尤其是圖5所示。在圖4中所見到的絲狀物是迄今尚未看到過的。這些含有乙肝表面抗原抗原性的絲狀物其特征在于分支或呈環形。它們可呈曲線或直線形的構型。一般說來，絲狀物長度至少50納米，通常在100-1000納米之間。
當絲狀結構分支時，分支結構的長度至少50納米，通常是100-300納米。以本發明的方法所得到的絲狀物，其中有些絲狀物具有分支，每一絲狀物結構至少有三個分支，并有一個不規則的結構，其最小長度至少為100納米，更多的為200-1000納米。
通過圖4到圖7的電鏡照片，可以觀察到本發明的含顆粒乙肝表面抗原包括有環形顆粒、分支形絲狀物、線形絲狀顆粒和16-25納米大小的球形乙肝表面抗原顆粒。
形態形式中包括環形顆粒，此顆粒具有自身伸出的絲狀部分。這些絲狀顆粒的長度經常不少于50納米，通常在100-300納米。
當使用清潔劑處理時，不分支絲狀物，可用在20℃下，密度為1.210至1.230GM/CC(平均1.224 GM/CC)之間，而進一步得到驗證。這樣，清潔劑處理的不分支絲狀物便可與某些慢性乙肝表面抗原攜帶者血漿中見到的不分支絲狀物相區別，后者的平均密度為1.200。慢性乙肝表面抗原攜帶者具有所謂的“Dane”顆粒，具有該絲狀物，或與該絲狀物有關。
“環形”顆粒包括那些實質上形成完全的環，以及那些實質上圈起來的一個區域。該區由含該物質的乙肝表面抗原圍繞界限而成，可形成包括橢園形、面包圈形的任何式樣，即它可以具有規則的或不規則的形態結構。
這一形態與以前描述過的分子微園顆粒有明顯的差別。后者的特征在于有一個由多肽鏈疏水端組成的中央核心，肽鏈的親水端則伸向粗略球狀顆粒的表面，而根據本發明制備成的絲狀物則沒有與中央核心相連接。有些絲狀物呈不規則形的環形，環本身可具有許多突出絲狀物，但是，正常情況下，突出絲狀物不超過三個，通常為二個或一個。當然，本發明的顆粒則肯定沒有伴以向外突出絲狀物的致密核心。
本發明著重敘述了由乙肝病毒滅活至乙肝疫苗的過程。但是，此過程以敘述過的方式去滅活其它的活病毒時，也是很有用的，這一滅活是在含該同一病毒的濃縮純化物質和所說病毒的抗原性組分中進行的，這些其它的活病毒，特別包括脂類被覆的病毒，逆轉錄病毒，腺病毒，帶狀皰疹病毒，水痘病毒，呼腸孤病毒，粘液病毒，麻疹病毒，腮腺病毒和白血病病毒。根據本發明，在由抗原性物質制備成疫苗的過程中，可將特異性病毒滅活，這些病毒包括流感病毒，(含各種不同的流感病毒株，如X-31株，日本株)，E-B病毒，脊髓前角灰白質炎病毒，白喉，雞肉瘤病毒，鳥疫病毒，口蹄疾病毒，霍亂，甲肝病毒，人親T淋巴細胞-3型病毒，狂犬病毒和天花病毒。
例1
將從慢性乙肝表面抗原攜帶者采集的含乙肝表面抗原和e抗原的血漿PH調至4.6，用Westphalia循環離心機(Continous flow centrifuge)以10，000轉/分速度離心澄清。在上清液中加聚乙二醇600(PEG600)，使其濃度在4℃時達4%，攪動20分鐘。使其自然沉降2小時得到沉淀，將沉淀溶在原體積1/5的蒸餾水中，調PH至7.5-8。再將PH降至5.0，離心得到沉淀。然后將上清液PH調至4.6，再加聚乙二醇，使其終濃度達3%。
將沉淀置于4℃下過夜，在中和條件將其溶解，將PH降至如前的5.0，將懸液澄清。再將材料的PH值調至6.8，加入0.005M磷酸鹽緩沖液，用等體積羥基磷灰石作柱料，進行2-3次吸附層析，再用0.02M和0.05M磷酸鹽緩沖液洗脫吸附在柱料的物質。最后將初始上清液與通過羥基磷灰石的洗脫液混合，離心澄清，用Amicon中空纖維園筒超濾器濃縮至初始血漿體積的0.3%。用固體溴化鉀將乙肝表面抗原的密度調至1.25毫克/毫升。將其移至具有密度為1.3克/毫升溴化鉀墊的一個1.05到1.2克/毫升溴化鉀線性密度梯度上，在Beckman離心機用Ti-14轉頭，以28，000轉/分速度離心18小時，將水泵入轉頭中心以分級分離離心后管內各部分，將密度1.17克/毫升到1.22克/毫升部分取出。
將純化的抗原濃度調至1毫克/毫升(基于OD280，E1厘米＝3.73)，通過一個0.22微米孔徑的Millipore超濾器過濾。然后將其在950毫米水銀柱壓力下通過一個2毫米直徑的不銹鋼螺旋管，將管懸在102℃的油浴中，使其在102℃下持續2分鐘，升溫到102℃需40秒，因此共需持續2分40秒，稀釋，加入滅菌的磷酸鋁，最后在65℃下用明礬吸附疫苗10小時，進一步滅活病毒。
比較例2
重復例1程序直至在102℃加熱滅活步驟前停止，從而得到例1所述含1.18毫克/毫升蛋白的乙肝表面抗原。用多價或單價人抗血清蛋白對照，根據凝膠擴散研究該抗原純度等于或大于95%。試驗表明該提取物不再含可觀察到量的人血清蛋白。將一部分樣品用2%磷鎢酸負染色后在195，000倍的電鏡下觀察。電鏡圖示在圖3。
例3
將一部分例2的樣品通過一個直徑2毫米的不銹鋼管，該管浸在102℃的油浴中，40秒是達到102℃所需時間，故需持續2分鐘40秒。其中該蛋白組合物在102℃下熱處理2分鐘。加熱后樣品是略帶乳白色，說明有些凝集。取部分樣品，負染色后在電鏡下拍片。如圖4所示，加熱后出現了線性分支，一般呈環形絲狀的表面抗原顆粒。這些顆粒在初始制備液中沒出現。這些顆粒是由于膜融和產生，而不是樣品凝集的結果。因為既使將其超聲振蕩30分鐘，也不會影響其形態。
通過離心將絲狀和球狀顆粒彼此分離，測定其相對免疫原性。
例4
將熱處理的例3的樣品在8，000g下離心20分鐘，將分離的上清液中加入50微克/毫升的吐溫20(Tween)，再通過孔徑為0.22微米的Millipore濾膜過濾，加吐溫可減小樣品在過濾時的損失。然后將過濾后樣品負染色，再在電鏡下觀察，電鏡圖示在圖5。
例5
將例4過濾的沉淀物重懸在等滲鹽溶液，使懸液體積為初始體積，負染色，在電鏡下觀察，電鏡圖示在圖5。
例6在有清蛋白存在下瞬時加熱滅活
將例3所述含3毫克/毫升人血清清蛋白，并用辛酸鹽穩定的制備物瞬時加熱。又產生了多晶型絲狀物。(見圖7)。
例7制備加佐劑的蛋白組合物
分別在30微升例2和例3的組合物，40微升例4的組合物和90微升例5的組合物加入10毫升滅菌的普通鹽水，得到每毫升4微克蛋白懸液(基于OD280計算)。由于加熱這些懸液略呈乳白色，這種蛋白濃度的懸液被認為是最合適的。通過BIORAD蛋白試驗可測得更準確的蛋白含量。用等體積的荷蘭Voor de Volksgesundheid of Bilthoven的Rijks研究所制備的含1.2毫克/毫升的磷酸鋁凝膠調整其濃度，每0.3毫克明礬磷酸鹽可吸附1微克/0.5毫升劑量的蛋白。
用鹽水稀釋，含1/4和1/16各種抗原的懸液同樣如上述吸附到明礬佐劑上，得到的劑量約為0.25到0.6微克。
用0.5毫升各例所述制劑，腹膜內接種到三組雌ICR瑞士小鼠中，每組20只，每只體重20到22克。這樣，每種樣品制劑接種60只鼠，三個稀釋液每個接種20只。用對照佐劑給10只鼠接種。將所有小鼠的心血排空，將血分別收集到各試管中，在室溫下凝血，擱置4℃下過夜，然后離心回收血清(以3，000轉/分離心15分鐘)。用AUSAB
試驗箱(美國伊利諾州，芝加哥Abbott試驗室)進行定量平行線放射免疫試驗測定各種血清，與每毫升含100個國際單位(IU)的WHO國際HBIG標準比較。樣品的放射活性超出了稀釋液曲線范圍，而且每分鐘計數(CPM)小于負對照，說明計數要用1∶10和1∶10的稀釋液進行。用AUSRIA
試驗箱以U.S.F.D.A.提供的HBSAg/ad標準進行定量平行線放射免疫試驗測定樣品的乙肝表面抗原免疫原性。得到的結果與用德國國家HBSAg/al標準測定的結果一致。
下面表1表示從例2到例5不同樣品的蛋白含量和抗免疫原性以及它們的比率，即“抗免疫原比活性”。可以看出，熱處理降低抗免疫原比活性約50%。這是富含如圖6所示例5所述的絲狀抗原的證據。
圖8表示用四種制劑的稀釋液一次注射后28-30天產生了至少1毫國際單位/毫升乙肝表面抗原的抗體的小鼠百分數。依據這個標準衡量，熱處理的制劑明顯地增加了免疫原性。估計使50%小鼠血清新換所需用量經熱處理后可增加7.4倍效價的免疫原性，如下表2資料所示，例5的絲狀部分是具有29.5倍效價的免疫原最強的部分。
表1
熱處理對抗免疫原比活性的影響
例號材料 乙肝表抗蛋白(1)抗免疫原性(2)抗免疫原比活性(3)
(毫克/毫升) (毫克/毫升) 及占處理前的百分數
2 未處理的 1.44 0.55 0.38 100
乙肝表抗
3 102℃下加 1.44 0.27 0.19 50
熱2分鐘
RX乙肝
表抗
4 102℃下加 0.74 0.23 0.31 81
熱2分鐘
8000g上清液
5 102℃下加熱 0.35 0.02 0.06 16
2分鐘8000g
沉淀
(1)用BIORAD蛋白試驗
(2)用與德國HBSAg/ad標準比較的AUSRIA試驗進行平行線放射免疫試驗(RIA)。
(3)抗免疫原比活性抗免疫原性/乙肝表抗蛋白
表3 加熱失活的乙肝表抗對小鼠免疫原性的影響
(A)對50%小鼠血清轉換所需量(ED)的影響
例號 材料 估計的(ED) 效價
Log 10 納克/小鼠 納克/小鼠
2 未處理的乙肝表抗 2.91 813 1.0
3 在102℃加熱2 2.04 110 7.4
分鐘RX乙肝表抗
4 在102℃加熱2 2.46 288 2.8
分鐘8000g上清液
5 在102℃加熱2 1.44 27.6 29.5
分鐘8000g沉淀
(B)對應答者中有意義的乙肝表抗抗體水平的影響
例號 材料 估計達到1.5log1毫國際單位/毫升 效價
的材料用量
Log 10 納克/小鼠 納克/小鼠
2 未處理的乙肝表抗 3.18 1500 1.0
3 在102℃加熱2 2.40 250 6.0
分鐘RX乙肝表抗
4 在102℃加熱2 2.46 288 5.2
分鐘8000g上清液
5 在102℃加熱2 1.95 89 16.8
分鐘8000g沉淀
從上面資料得出的結論是加熱上述方法分離得到的純乙肝表抗顆粒增加它的免疫原性，從而得到極高的抗體水平。定量參數是從估計產生幾何構型有意義的乙肝表抗抗體水平1.5 Log 10毫國際單位/毫升(30毫國際單位)所需的量衍生的。用這個參數，將其在102℃加熱2分鐘估計能增加免疫原性6倍。因此，本發明含蛋白物質的特征是具有比主要含直徑18-24納米的球型乙肝表抗顆粒的免疫原性高4～6倍，優選的為高6～8倍。當然，通過把本發明的絲狀結構顆粒與直徑18-24納米球形顆粒分離開，得到的組合物免疫原性高20～30倍，這在例5所述資料中已得到證實。
令人驚奇地發現在102℃滅活本發明提純的乙肝表抗2分鐘，不僅如期望的降低了殘留感染性，而且出乎意料地急驟增加了免疫原性。這種增強的免疫原性使我們可能制造低蛋白含量的疫苗，從而降低了生產成本，使疫苗價格大大下降。
例8比較估計用其它類似純化技術和滅活技術得到的熱滅活疫苗
用上述純化程序，將乙肝表抗用聚乙二醇沉淀兩次，再通過負吸附到羥磷灰石上，然后等密度離心。這種部分純化的材料定名為樣品A。
另一種部分純化的乙肝表抗組合物定名為樣品B，它是用Brumelhuis等人的方法制備的。(見Eds.P.Maupas和P.Guesry在1981年荷蘭Elsevier舉行的血清學討論會會刊發表的文章“加熱滅活乙肝疫苗來制備乙肝疫苗”)。
用磷酸鹽緩沖鹽水將樣品A稀釋到1毫克/毫升，2毫克/毫升，4毫克/毫升和6毫克/毫升，然后如下述熱處理。依據Brummelhuis的方法將樣品B重懸調至濃度為每毫升含20微克乙肝表抗，然后再熱處理。
將樣品A和B置于內徑為2毫米的金屬管內，接一段短的硅橡膠管，用金屬螺夾封住。將其浸在102℃的熱穩定油浴中2分鐘以滅活樣品。然后將其移至冰水浴冷卻。
將滅活樣品如圖3到圖6用磷鎢酸負染色，然后在電鏡下拍片，樣品A(1-6毫克/毫升)的電鏡圖顯示它具與圖4-6一樣的多態絲狀物。根據荷蘭紅十字會的方法制備的滅活樣品，樣品B除含乙肝表抗外還至少含3毫克/毫升的其它血清蛋白，它們的電鏡圖顯示不具乙肝表抗絲狀顆粒。還發現如例6中加辛酸鈉穩定后的清蛋白1～3毫克/毫升不改變向多態的轉化(見圖7)，免疫原性仍然增強。結論是，乙肝表抗的純化方式及熱處理時的濃度決定了是否需要瞬時熱處理，從而使乙肝抗原顆粒轉化成圖4～6所示新的，不一般的多態。因此，熱處理本身并不是改變形態的決定因素，得到新的改善其免疫原性的形態是取決于純化技術與所用熱滅活方式的結合。
進一步敘述本發明的最佳實施方案。在開始研究時是用諸如清蛋白的合適的蛋白稀釋純化抗原得到多態抗原，加清蛋白等是為了使抗原熱處理時不變性失活。而本發明發現可以不予先稀釋加熱滅活抗原。因而，最佳實施方案就是將純化而未稀釋的乙肝表抗加熱滅活。
本發明的原則是通過瞬時加熱、滅活純的濃膜制備物來加強類脂膜免疫原的免疫原性，從而降低它的用量。因此對諸如在酵母，細胞培養等真核接觸中生產的乙肝重組DNA疫苗及流感，狂犬病，麻疹，皰疹病毒，如HTLVⅠ，Ⅱ和Ⅲ的逆轉錄病毒，寄生蟲疫苗及其它現在已有和正在研究的疫苗本發明是均適用的。
權利要求
1、熱滅活含病毒和它抗原成分的濃物質的方法，其特征是該濃物質不用其它蛋白類材料稀釋。熱滅活溫度為101-104℃，1到15分鐘。
2、根據權利要求
1所述的方法，其中所說的濃物質沒用任何穩定材料所稀釋。
3、根據權利要求
1所述的方法，其中所說的濃物質是通過將其它血清蛋白從含該病毒的血清中除去而得到的。
4、根據權利要求
3所述的方法，其中所說的制備該濃物質的步驟是除去其它血清蛋白時不用任何蛋白稀釋含該濃物質的病毒。
5、根據權利要求
3所述的方法，其中滅活的濃物質中含顆粒狀的抗原至少為1毫克/毫升。
6、根據權利要求
1所述方法，將該濃物質加熱滅活后立即冷卻。
7、根據權利要求
6所述方法，其中含顆粒狀的乙肝表面抗原是通過下列步驟得到的
(1)將血漿與聚乙二醇接觸，從血漿沉淀乙肝表面抗原，從而將乙肝表面抗原與其它血清蛋白分離;
(2)將分離出的乙肝表面抗原通過羥基磷灰石的負吸附進一步除去血清蛋白;
(3)將吸附的乙肝表面抗原等密度離心。
8、根據權利要求
7所述方法，其中的顆粒置于一個直徑0.1到10毫米的管中，將該管懸在熱介質中，在800-1000毫米水銀柱壓力下，于101到104℃加熱1到15分鐘。
9、用權利要求
1的方法生產的蛋白類物質。
10、用權利要求
6的方法生產的蛋白類物質。
11、用權利要求
7的方法生產的蛋白類物質。
12、根據權利要求
1的方法，其中加熱時間為2到5分鐘。
13、根據權利要求
5的方法，其中含顆粒的抗原是乙肝表面抗原。
14、根據權利要求
5的方法，其中含顆粒的抗原濃度為0.5到10mg/ml。
15、根據權利要求
1的方法，其中物質的含顆粒的乙肝表面抗原含量至少為95%(重量比)。
16、根據權利要求
1的方法，其中物質的含顆粒的乙肝表面抗原含量至少為99%(重量比)。
17、根據權利要求
1的方法，其中所述熱滅活是在壓力為800到1000mm汞柱條件下進行的。
18、根據權利要求
1的方法，其中所述熱滅活是在壓力為900到1000mm汞柱條件下進行的。
專利摘要
本發明揭示一種制備含自然界未發現的乙肝表面抗原顆粒的蛋白類物質的方法，該顆粒在加熱含該抗原蛋白的任何病毒也無法得到的。該方法包括將不用其它蛋白物質或穩定劑稀釋的濃物質，以至少1毫克/毫升的濃度在101到105℃下加熱1到15分鐘，然后冷卻之。
文檔編號A61K39/29GK86102113SQ86102113
公開日1986年11月19日 申請日期1986年3月31日
發明者阿爾夫里德·梅爾·普倫斯, 克旺格·索·基姆 申請人:紐約血中心公司, 尤金泰克國際公司導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan