專利名稱：：瘧原蟲肝期抗原的制作方法
技術領域：
：本發明涉及由肝期瘧原蟲(戶h^o^i/邁)寄生蟲特異性表達的蛋白質，以及它們在預防、診斷和治療瘧疾中的用途。
背景技術：
：瘧疾對人的健康具有巨大的影響，每年造成數百萬人死亡，并且該疾病是癡疾流行地區，特別是撒哈拉沙漠以南的非洲國家的社會和經濟發展的一個主要障礙。當雌性按蚊將感染性子孢子注入哺乳動物宿主中時，瘙疾感染就開始了。子孢子穿過不同的細胞，之后停留在它們最終的宿主肝細胞中。子孢子進入通過肝細胞質膜內陷產生的寄生泡中。在這種區室中，子孢子轉變進入肝期。肝期快速生長，并進行多輪的核分裂。成熟的肝期釋放成千上萬的裂殖子，其將建立紅細胞感染。據預測，肝期表達許多不同的蛋白質，一些可能是該時期所特有的，但是目前僅鑒定了那些獨特的分子中的少數。肝期特異性分子的鑒定很重要，因為已經在輻射減毒的子孢子疫苗模型中以及最近在基因工程減毒的子孢子疫苗模型中將受感染的肝細胞確立為不育性保護性免疫應答的主要耙標(在Matuschewski(2006)O/rr.//鵬M0/.18:1-9中綜述)。此外，可以在人診斷樣品中檢測到的肝期分子可能可用于診斷早期癡疾。本領域需要保護免于瘧疾感染和疾病的疫苗。本領域還需要關于瘧疾的診斷標記物。本發明解決了這些和其他的需要。發明概述本發明的一個方面提供了分離的肝期瘧原蟲多肽。在一些實施方案中，分離的肝期瘧原蟲多肽包含選自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列。在一些實施方案中，肝期癡原蟲蛋白質優先被與保護免受瘧原蟲感染相關的免疫應答所靶向。本發明的分離的肝期瘧原蟲多肽可以是重組的或合成的多肽。在一些實施方案中，本發明的多肽是包含選自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列的多肽的免疫原性衍生物。此類免疫原性衍生物包括但不限于，包含選自SEQIDNO:49-52的氨基酸序列的肽。本發明的另一個方面提供了分離的核酸分子，其編碼本發明的肝期癡原蟲多肽。因此，一些實施方案提供了分離的核酸分子，其編碼包含選自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物的多肽。本發明的另一個方面提供了包含一種或多種本發明的肝期瘧原蟲多肽和藥學上可接受的載體的組合物。因此，一些實施方案提供了包含肝期瘧原蟲多肽和藥學上可接受的載體的免疫原性組合物，其中肝期瘧原蟲多肽包含選自SBQIDN0:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。在一些實施方案，本發明的組合物是用于誘導免疫應答的免疫原性組合物，例如疫苗組合物。在另一個方面，本發明提供了用于誘導針對癡原蟲寄生蟲的免疫應答的方法，該方法包括施用含有有效量的一種或多種本發明的肝期瘧原蟲多肽的免疫原性組合物。因此，在一些實施方案中，本發明提供了用于在哺乳動物受試者中誘導針對惡性瘙原蟲(戶/M邊^/y咖尸a/c/pari/邁)的免疫應答的方法，該方法包括將含有有效量的至少一種肝期癡原蟲多肽的組合物施用給哺乳動物受試者，所迷肝期痗原蟲多肽選自SEQIDNO:1-48及其免疫原性衍生物。本發明的另外一個方面提供了用于治療有此需要的哺乳動物受試者的方法，該方法包括將含有有效量的一種或多種本發明的肝期瘧原蟲多肽的免疫原性組合物施用給有此需要的哺乳動物受試者。因此，在一些實施方案中，本發明提供了用于治療有此需要的人受試者的方法，該方法包括將含有至少一種分離的選自SEQIDNO:l-48的多肽及其免疫原性衍生物的免疫原性組合物施用給人受試者。此外，本發明提供了基因工程減毒的子孢子，從所迷子孢子中已經除去了至少一種編碼本發明的肝期多肽的基因。因此，在一些實施方案中，本發明提供了基因工程減毒的疸原蟲子孢子，所述子孢子缺少編碼選自SEQIDNO:1-48的肝期多肽的基因。本發明還提供了編碼本發明的肝期瘧原蟲多肽的表達載體，含有此類表達載體的宿主細胞，特異性地結合本發明的肝期瘧原蟲多肽或其免疫原性衍生物的抗體，以及用于檢測本發明的肝期瘧原蟲多肽或編碼它們的核酸分子的存在的診斷測定法。優選實施方案的詳細描述在一個方面，本發明提供了由肝期瘧原蟲寄生蟲表達的新型蛋白質。這些蛋白質中的一些在肝期寄生蟲中特異性表達，如實施例1-3中所顯示的(見表2和3，SEQIDNO:1-28)。一些本發明的肝期蛋白質在子孢子和肝期寄生蟲中都表達，但在血液期寄生蟲中以顯著更^f氐的水平表達，如實施例3中所顯示的(見表4，SEQIDNO:29-48)。在一些實施方案中，肝期瘧原蟲蛋白質優先被與保護免受疾原蟲感染相關的免疫應答所靶向。例如，肝期蛋白質或其免疫原性衍生物可以是與保護相關的T細胞免疫的抗原靶標，如實施例4中所顯示的。相比于來自免疫前或未免疫的受試者的血清，本發明的肝期癡原蟲蛋白質也可以優先被來自已經獲得對于瘧原蟲感染的免疫力的受試者的血清識別(參見，例如Doolan等人，(2003)戶roc.力cad.5"c/.〃W100(17):9952-7;Sundaresh等人，(2006)刃io2'/2尸or邁"/cs22(14):1760-6)。因此，本發明的一個方面提供了分離的肝期瘧原蟲多肽。在一些實施方案中，所述分離的肝期瘧原蟲多肽包含選自SEQIDN0:1-48的氨基酸序列。這些蛋白質的序列、編碼它們的核苷酸序列以及注解信息可以以表l-4中提供的蛋白質/基因ID號從瘧原蟲基因組數據庫(PlasmodiumGenomeDatabase)(//plasmodb.org/;Kissinger等人，(2002)419:490-492)中荻得，并且將其通過提及而并入本文。本發明的分離的肝期癡原蟲多肽可以是重組的或合成的全長多肽或其免疫原性衍生物，如下面更進一步描述的。因此，本發明的一些實施方案提供了分離的瘧原蟲多肽，其包含選自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。例如，分離的多肽可以是選自SEQIDNO:11-44的惡性癡原蟲多肽及其免疫原性衍生物。如在此使用的，術語"多肽"指氨基酸聚合物并且不是指特定長度的產物；因此，肽、寡肽以及蛋白質包括在多肽的定義內。該術語也包括該多肽的表達后修飾，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。包括在該定義內的是，例如，含有一個或多個氨基酸類似物(包括例如，非天然氨基酸、PM等)的肽，具有經取代的鍵以及天然的和非天然的本領域已知的其他修飾的多肽。本發明的肝期瘧原蟲多肽可以是全長多肽，全長多肽的免疫原性衍生物或結構域，或者其免疫原性變體。如此處使用的，術語"免疫原性"指多肽無論是單獨地還是與載體相連接，在存在還是不存在佐劑時，引發體液和/或細胞免疫應答的能力。因此，本發明的全長肝期瘧原蟲多肽的免疫原性部分指能夠引發針對相應的全長多肽的免疫應答的全長多肽的一部分。術語"免疫原性衍生物或結構域"包括任何包含至少5-8個氨基酸(例如，10-50個氨基酸、30-200個氨基酸或100-500個氨基酸)并且能夠誘導針對全長多肽的免疫應答的多肽。因此，免疫原性衍生物包括全長多肽的截短形式、表位或其他衍生物。術語"表位"指沿蛋白質表面排列的3-10個氨基酸的線性隊列。在線性表位中，氨基酸依次連接并且遵循該蛋白質的一級結構。在構象表位中，殘基不依次連接，而是由于該蛋白質的構象(折疊)而沿著表面線性展開。關于構象表位，確定表位的序列的長度可以有很大變化。定義表位的殘基之間的抗原一級結構部分可能對于該構象表位的結構不是關鍵的。例如，這些間插序列的缺失或置換可能不會影響構象表位，只要對該表位構象關鍵的序列得以保留(例如參與二硫鍵成鍵的半胱氨酸、糖基化位點等)。構象表位也可以由同寡聚體或異寡聚體的亞基的兩個或更多個必需區域形成。其他免疫原性衍生物可以通過氨基酸的添加、刪除、置換或重排或者通過它們的化學修飾來制備。肝期瘧原蟲多肽的示例性的表位在實施例1和4中描述。因此，免疫原性衍生物包括但不限于，包含選自SEQIDNO:49-52的氨基酸序列的肽。預測多肽中的免疫原性區域的方法是本領域熟知的。例如，多肽序列可以通過使用幾種算法來分析，包括根據Kyte-DoolitUe方法預測親水性，根據Emini方法預測表面概率，和根據Jameson-Wolf方法預測抗原性(例如，可從DNASTAR，http:〃www.dnastar.com/獲得的Protean軟件)。其他表位預測方法是本領域已知的(參見，例如Moise&DeGroot(2006)"/otec/wo人24(7):791-2)。在一些實施方案中，本發明的肝期瘧原蟲蛋白質的免疫原性衍生物含有包含選自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列的全長多肽的5-10、10-50、20-200、40-300或100-600個連續氨基酸。示例性的本發明多肽的免疫原性衍生物在實施例1和4中描述，并且包括但不限于，包含選自SEQIDN0:49-52的氨基酸序列的肽，包含SEQIDNO:13的氨基酸59-300、SEQIDNO:14的氨基酸72-230、SEQIDNO:17的氨基酸1-545或氨基酸660-1073、SEQIDNO:18的氨基酸28-184、SEQIDNO:20的氨基酸151-326、SEQIDNO:21的氨基酸6-529或氨基酸587-842、SEQIDNO:23的氨基酸1-346、SEQIDNO:25的氨基酸92-587、SEQIDNO:30的氨基酸76-130、SEQIDNO:31的氨基酸415-885、SEQIDNO:33的氨基酸84-229、SEQIDNO'.34的氨基酸22-291、SEQIDNO:35的氨基酸208-512或氨基酸716-1026、SEQIDNO:36的氨基酸1-135、SEQIDNO:39的氨基酸181-306或氨基酸47-457、SEQIDNO:40的氨基酸585-1018、SEQIDNO:41的氨基酸230-843、SEQIDNO:44的氨基酸236-683、SEQIDNO:45的氨基酸26-182和SEQIDNO:48的氨基酸23-459或氨基酸488-813的多肽。適的:因片段或通過肽合成來制備，、其中;用本領域:知的:以下進一步描述的方法。用于重組表達本發明的免疫原性衍生物的示例性方法在實施例6中提供。免疫原性衍生物可以是含有額外序列的融合多肽，所述額外序列編碼一種或多種其他痦原蟲免疫原或其他非瘧原蟲免疫原的表位。備選地，本發明的免疫原性衍生物可以融合至栽體多肽(例如乙型肝炎表面或核心抗原)或者融合至另一種載體，所述另一種載體具有免疫刺激性質(如在佐劑的情形中)，或另外增強對該蛋白質或其衍生物的免疫應答，或在表達、純化或配制該蛋白質或其衍生物中有用。肝期瘧原蟲蛋白質或其免疫原性衍生物可以用常規的連接劑例如戊二醛而化學綴合至大分子上(Geerlings等人，(l988)/./邁邊W70人Z/eWo"106:239-244)。在一些實施方案中，本發明的肝期瘧原蟲多肽包括與SEQIDNO:1-48中所定義的序列具有大于80%的氨基酸序列同一性(例如大于90%的序列同一性、大于95%的氨基酸序列同一性或大于99%的序列同一性)的免疫原性衍生物。在兩個或更多個氨基酸序列的情況下，術語"同一的"或"同一性，，百分比指，如使用下述序列比較算法之一或通過手工比對和目測檢查所測量的，當在比較窗上就最大一致性進行比較和比對時，相同的或具有指定百分比的相同氨基酸殘基的兩個或更多個序列或子序列。應該認識到，不相同的氨基酸位置通常差異在保守性氨基酸置換，其中氨基酸殘基被具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)的其他氨基酸殘基置換并因而不會改變該分子的功能性質。如果序列的差異在于保守置換，則可以上調序列同一性百分比以就該置換的保守性質進行校正。用于進行這種調整的手段是本領域技術人員所熟知的。保守性置換的評分可以根據例如Meyers&Millers(1988)Co邁pyfer^7/7〃c.A/o/.4:11-17的算法來計算。"比較窗"是指連續位置，例如大約25至大約600個位置、或大約50至大約200個位置、或大約100至大約150個位置的區段，在兩個序列進行最佳比對后，可在該區段上將序列與具有相同數目的連續位置的參考序列進行比較。用于比較的序列比對方法是本領域熟知的。用于比較的序列的最佳比對可以通過下述來進行例如，局部同源性算法(Smith&Waterman(1981)Jc^.J/7/7人^"力.2:482);總體比對算法(Needle歸n&Wunsch(1970)/.艇腸7.48:443);相似性搜索方法(Pearson&Lipman(1988)戶roc.iW.丄85:2444;Altschul等人(1997)^wc人/(c/"Aes.25(17):3389-402);這些算法的計算機化實施(例如，WisconsinGeneticsSoftwarePackage,GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.，Madison,Wis.中的GAP,BESTFIT，FASTA和BLAST)，通常使用默認設置；或手工比對和目測檢查(參見，例如CurrentProtocolsinMolecularBiology(1994)Ausubel等人編輯)。例如，BLAST蛋白質搜索可以用XBLAST程序(得分-50，字長-3)來進行，以獲得與SEQIDNO:1-48的氨基酸序列具有大于80%的同一性的氨基酸序列。一個有用算法實施的例子是PILEUP。PILEUP使用漸進的成對比對而由一組相關序列產生多重序列比對。它還可以繪制顯示出用于產生比對的聚類關系的樹狀圖。PILEUP使用Feng&Doolittle(1987)/.^Vo/.35:351-60的漸進比對方法的簡化形式。所使用的方法類似于由Higgins&Sharp(1989)(^^7^5:151-3描述的方法。多重比對操作從兩個最相似序列的成對比對開始，產生兩個經比對的序列的聚簇(cluster)。這個聚簇隨后可以與下一個最相關序列或經比對的序列的聚簇進行比對。兩個序列聚簇可以通過兩個獨個序列的成對比對的筒單延伸來進行比對。在每一次重復時包括不相似性漸增的序列和序列聚簇的一系列此類成對比對產生了最終的比對。在一些實施方案中，本發明的肝期癡原蟲多肽包括野生型多肽的變體。這些變體屬于以下三種類型中的一種或多種置換變體、插入變體或缺失變體。這些變體可以是天然的等位基因變體或種間變體(例如來自不同的惡性瘧原蟲林系的變體)，或者它們可以通過編碼蛋白質的DNA中的核苷酸的位點特異性誘變來制備。位點特異性誘變可以用盒式誘變或PCR誘變或者本領域所熟知的其他技術來進行，以產生編碼該變體的DNA，并隨后在重組細胞培養物中表達該DM。具有多至大約100-150個氨基酸殘基的變體靶蛋白片段可以用已建立的技術通過體外合成來制備。提供功能相似的氨基酸的保守性置換表是本領域所熟知的(Henikoff&Henikoff(1992)Wa〃.K51.丄89:10915-9)。氨基酸置換通常是單個殘基。插入通常將會處于大約1至大約20個氨基酸的級別上，盡管可以耐受明顯更長的插入。缺失的范圍是大約1至大約20個殘基，盡管在一些情形中，缺失可以長得多。置換、缺失和插入或其任意組合可以用于獲得最終的衍生物。在一些實施方案中，本發明的肝期癡原蟲多肽是重組多肽。術語"重組多肽"是指通過重組表達方法產生的多肽，例如，在原核或真核宿主細胞中，或者在無細胞的體外表達系統中，如下面詳細描述的。本發明的肝期瘧原蟲多肽通常使用表達載體來表達并進行純化。表達載體可以是自我復制的染色體外載體或整合入宿主基因組中的載體。通常，表達栽體包含與編碼靶蛋白的核酸有效連接的轉錄和翻譯調控核酸序列。術語"控制序列"指對于在特定的宿主有機體中表達有效連接的編碼序列所必需的DNA序列。例如，適合于原核生物的控制序列包括啟動子、任選的操縱子序列和核糖體結合位點。已知真核細胞使用啟動子、多腺苷酸化信號和增強子。當將核酸序列置于與另一核酸序列處于功能性關系的狀況時，該核酸序列是"有效連接的"。例如，如果其被表達為參與多肽分泌的前蛋白質，則將前序列或分泌前導序列的DNA有效連接至該多肽的DNA;如果啟動子或增強子影響編碼序列的轉錄，則將啟動子或增強子有效連接至該編碼序列；或者，如果安置核糖體結合位點有助于翻譯，則將核糖體結合位點有效連接至編碼序列。有效連接的DNA序列可以是連續的或不連續的。用于連接DNA序列的方法是本領域所熟知的，并且包括使用聚合酶鏈式反應和連接反應。轉錄和翻譯調控核酸將通常適合于用于表達靶蛋白的宿主細胞；例如，來自大腸桿菌(Aco7/)的轉錄和翻譯調控核酸序列優選用于在大腸桿菌中表達靶蛋白。對于各種宿主細胞，本領域已知許多類型的合適表達栽體以及合適的調控序列。用于表達多肽的方法是本領域熟知的(例如，Sambrook等人，(1989)"o/7//^,JZa6or"or/第2版，vol.l-3，ColdSpringHarborLaboratory;Berger和Kimmel(1987)6Wc/eto#o/ecu/ar7e由2',s,MethodsinEnzymology，vol.152，AcademicPress,Inc.，SanDiego，CA;Ausubel等人(1995)CVrre/^戶r由co/i//A/Wo^r,JohnWiley&SonsInc.，NY)。通常，轉錄和翻譯調控序列可以包括但不限于，啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活子序列。啟動子序列編碼組成型或誘導型啟動子。啟動子可以是天然啟動子或雜合啟動子。組合了多于一種啟動子的元件的雜合啟動子是本領域熟知的。表達載體可以包含其他的元件。例如，表達載體可以具有兩種復制系統，因而使得其能在兩種生物體中維持，例如在哺乳動物細胞或昆蟲細胞中表達并在原核宿主中克隆和擴增。此外，對于整合型表達栽體，該表達載體含有至少一個與宿主細胞基因組中的序列同源的序列，以及優選兩個在該表達構建體側翼的同源序列。可以通過選擇合適的同源序列以包含于該栽體中而將整合型載體導向宿主細胞中的特定基因座。用于整合型栽體的構建體是本領域所熟知的。另外，表達載體可以包含選擇標記基因以使得能選擇轉化的宿主細胞。選擇基因是本領域所熟知的，并且將取決于所使用的宿主細胞而不同。本發明的肝期瘧原蟲多肽可以通過下述方式而產生在合適的條胞，^誘導或引起所述肝期i原蟲多肽^表達。適合于蛋白質表達的條件隨所選的表達栽體和宿主細胞而變化，并且可以容易地由本領域技術人員采用常規的試驗來確定。例如，對于在表達載體中使用組成型啟動子，可以對宿主細胞的生長和增殖進行優化，和對于使用誘導型啟動子，可以提供用于誘導的合適生長條件。此外，在一些實施方案中，收獲的時間很重要，例如，在使用桿狀病毒系統時。本領域技術人員將認識到，可以對于在所選宿主細胞中的表達來優化編碼序列。合適的宿主細胞包括酵母、細菌、古細菌、真菌、昆蟲細胞和動物細胞，包括哺乳動物細胞(例如人細月包和細^i系)。因此，宿主細胞包括但不限于，黑腹果蠅("/o^o/7A/7a歷eh/7o^2We/)細胞、四膜蟲(re"a力y邁e/za)、酉良酒酵母(Sacc力aro邁ycesce/er/s/ae)及其他酵母、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(&c///wssu6〃7/"、Sf9細胞、C129細胞、293細胞、脈孢菌(y^"ro^7ora)、BHK、CH0、C0S、HeLa細胞、HepG2細胞、THP1細胞系(巨噬細胞細胞系)和人胚腎細胞系(例如，HEK293)。在一些實施方案中，肝期癡原蟲多肽在哺乳動物細胞中表達。哺乳動物表達系統是本領域所熟知的，并且包括逆轉錄病毒系統。來自病毒基因的啟動子常常用于哺乳動物表達系統中，因為病毒基因通常是高度表達的并且具有廣泛的宿主范圍。實例包括SV40早期啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒LTR啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、單純皰滲病毒啟動子和CMV啟動子。通常，由哺乳動物細胞識別的轉錄終止和多腺苷酸化序列是位于翻譯終止密碼子3，的調控區域，并因此與啟動子元件一起在編碼序列的側翼。轉錄終止子和多腺苷酸化信號的實例包括來源于SV40的那些。學方法來克隆，包括DNA擴增方法，例如聚合酶鏈式反應(PCR)方法(參見例如，Sambrook等人，(1989)#o7ecw/arC7o/2//^,^Za6or"07y他/zwa7，第2版，ColdSpringHarbour,N.Y.;Berger&Kimmel(1987)淑A油Vol.152:6Wcefo#o/ecw/ar670/7//7g7ec力//《wes，AcademicPress,Inc.，SanDiego，CA;Co等人，(1992)/./邁頂w/o人148:1149)。因此，例如，編碼肝期惡性瘧原蟲多肽的核酸分子可以用含有一個限制性位點的有義引物和含有另一個限制性位點的反義引物進行PCR擴增。這將產生編碼具有末端限制性位點的所需序列或子序列的核酸。然后可以將這種核酸連接入具有合適的相應限制性位點的載體中。合適的PCR引物可以容易地由本領域技術人員基于待表達的序列進行選擇。合適的限制性位點也可以通過定點誘變來添加(參見Gillman&Smith(1979)Ce/ze8:81-97;Roberts等人(1987)jV由re328:731-4)。將外源核酸引入宿主細胞中的方法是本領域所熟知的，并且將隨著所使用的宿主細胞而變化。合適的技術包括但不限于，葡聚糖介導的轉染、磷酸鈣沉淀、polybrene介導的轉染、原生質體融合、電穿孔、病毒感染、將核酸包囊于脂質體中以及將核酸直接顯微注射入細胞核中。在一些實施方案中，本發明的肝期瘧原蟲多肽在細菌系統中表達。細菌表達系統是本領域所熟知的。也可以使用來自噬菌體的啟動子，并且其是本領域所熟知的。此外，合成的啟動子和雜合啟動子也是有用的；例如，tac啟動子是trp和lac啟動子序列的雜合體。此外，細菌啟動子可以包括非細菌起源的天然啟動子，該啟動子具有結合細菌RNA聚合酶并起始轉錄的能力。除了功能性啟動子序列外，有效的核糖體結合位點也是需要的。表達載體還可以包含信號肽序列，其提供了在細菌中表達的蛋白質的分泌。表達的蛋白質可以分泌入生長培養基中(例如革蘭氏陽性細菌)或分泌入位于細胞的內膜和外膜之間的周質間隙中(革蘭氏陰性細菌)。細菌表達載體還可以包含表位標簽，其提供了靶蛋白的親和純化。細菌表達載體還可以包含選擇標記基因以使得能夠選擇已轉化的細菌菌抹。合適的選擇標記包括使得轉化的細菌對于藥物(例如氨節青霉素、氯霉素、紅霉素、卡那霉素、新霉素和四環素)具有抗性的基因。選擇標記還包括生物合成基因，例如在組氨酸、色氨酸和亮氨酸生物合成途徑中的那些。將這些組分組裝成表達栽體。用于細菌的表達載體是本領域所熟知的，并且尤其包括用于枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、酪鏈球菌(iYre;^ococc^c,e歷o"'s)和淺青紫鏈球菌(S"一ococci/s7/>油/7<)。使用本領域所熟知的技術例如氯化鈣處理、電穿孔等，將細菌表達載體轉化入細菌宿主中。用細菌表達系統表達本發明的胎盤惡性瘧原蟲多肽的示例性方法在實施例5中描述。本發明的肝期瘧原蟲多肽也可以在昆蟲細胞中產生。用于昆蟲細胞的轉化的表達載體，以及特別是基于桿狀病毒的表達載體，是本領域所熟知的。肝期瘧原蟲多肽也可以在酵母細胞中產生。酵母表達系統是本領域所熟知的，并且包括用于釀酒酵母、白色假絲酵母(a76/ca/3S休麥牙糖假絲酵母(C.邁a〃^a人多形漢遜酵母(i^/^e""7a/oAK歷or/7力aj、脆壁克魯維酵母(A7wj^eroinyces/Vag/7/sJ和乳酸克魯維酵母(f季也蒙畢赤酵母(？/^/3^"//7"/歷0/^/2和巴斯德畢赤酵母(,./7aWoWsJ、粟酒裂殖酵母(Sc力/zosacc力aro邁7cesj90邁6eJ和解月旨耶氏酵母(J^r/^iw'a//po7/〃ca,的表達載體，明的肝期癡原蟲夕肌口j體外表達來說合適的條件下，使用含有編碼肝期癡原蟲多肽的核酸的表達載體，在體外在無細胞的表達系統中產生。無細胞的體外表達系統是本領域所熟知的。如果必要，可以為無細胞系統定制用于共翻譯硫化物-硫化物交換和二硫鍵的正確折疊的條件(Lyubov等人，(1993)脅tec力/20入15(1):79-84)。用無細胞體外表達系統來表達本發明的胎盤惡性瘧原蟲多肽的示例性方法在實施例5中描述。歷史上，發現惡性瘧原蟲蛋白質在異源生物體中的表達是相當有挑戰性的。惡性疾原蟲基因組是任何已知基因組中最富含A+T的其中一種。因此，惡性疾原蟲使用一整套不同的密碼子，這可能導致在異源系統中的低水平表達。此外，在釀酒酵母或巴斯德畢赤酵母中，序列的某些富含A+T的鏈段可以作為多腺苷酸化或轉錄終止信號，導致低水平的表達或截短的mRNA(Romanos等人，(1991)^"c人Jc/^i".19(7):1461-7)。在過去七年獲得的進展已經使得情況大有改進。對于一些瘧原蟲蛋白質，過去有挑戰性的且成功率低的費勁工作現在成為了常規的、主流的分子生物學實踐。例如，可以合成具有合適的密碼子使用和增加的G+C含量的癡原蟲編碼序列。產生合成基因的原則在(Withers-Martinez等人，(1999)戶rWe//2f/2f12(12):1113-20)中有明確的描述。這些原則包括(1)降低整體的A+T含量以消除潛在的轉錄終止信號，(2)消除可導致穩定的發夾結構的回文序列，以及(3)最小化可能產生非特異性引發的串聯重復序列或反向重復序列(長度〈lGbp)。另外，在合成步驟中除去推定的N-聯糖基化位點以模擬缺乏任何糖基化的惡性癡原蟲多肽結構。在巴斯德畢赤酵母中已經成功表達了很多惡性瘧原蟲蛋白質(參見例如，Withers—Martinez等人，(1999)尸ro^/;7A/^12(12):1113-20;Milek等人，(2000)Fa"/刀e18(14):1402-11;Brady等人，(2001)尸rote//2尸wr/尸.23(3):468-75;Kocken等人，(2002)//7尸eC//zm/"/7.70(8):4471-6;Zhang等人，(2002)/."/o人C力e邁.277(51):49767-75;Yadava&Ockenhouse(2003)//2尸ecL/邁M//7.71(9):4961-9;Wang等人，(2005)5/otec力/70/.S/oe"g.90(7):838-47;Pan等人，(2004)/./邁頂u/70入172(10):6167-74;Tsai等人，(2006)/.A/Wec力i70/.121(4):458-70)。此外，可以純化在巴斯德畢赤酵母中產生的疾疾蛋白質來產生臨床等級的產品(參見例如，Malkin等人，(2005)T//ec/.73(6):3677-85)。描述了如何在巴斯德畢赤酵母中克隆和表達蛋白質的詳細方案可從Invitrogen作為BasySelect尸/c力/aExpressionKit(產品編號K1740-01)的一部分而獲得。這種商購可得的試劑盒有助于以DNA序列開始到以表達的蛋白質結束的整個表達過程。用于表達本發明的肝期瘧原蟲多肽的示例性方法在實施例6中描述。細菌表達是另一種產生臨床等級的重組瘧原蟲蛋白質以用于潛在的疫苗應用的有前途的方法(參見例如，Dutta等人，(2006)//尸e".//z/邁w2.70(6):3101-10;Shimp等人，(2006)戶,ofei刀June27，2006[印刷前電子出版];Hillier等人，(2005)/"/ecf.//z/邁w.73(4):2109-15;Darko等人，(2005)Zo/eW./邁/Pw.73(1)287-97;Nardin等人，(2004)///eC/邁邁肌73(11):6519-27;Chen等人，(2004)「acc//7e22(21-22):2701-12;Zhou等人，(2004)戶ro"//2i^pr.尸"r/尸.34(1):87-94;Singh等人，(2003)/"/e".力zm7w/.71(12):6766-74)。與酵母表達類似，重新合成所述基因以優化密碼子表現度(codonrepresentation)提高了重組蛋白質的產率和可溶性(Hillier等人，(2005)/邁邁u".73(4):2109-15)。重組蛋白質的重折疊可以用于產生功能性表位。本發明的肝期瘧原蟲多肽及其免疫原性衍生物也可以用本領域所熟知的技術而制成融合蛋白質。例如，肝期瘧原蟲多肽可以制備為融合蛋白質以增加表達或將其與提供表位的標簽多肽連接，抗-標簽抗體可以選擇性地結合所述表位。通常將表位標簽置于靶蛋白的氨基末端或羧基末端。表達的蛋白質的這種具有表位標簽的形式的存在可以使用針對所述標簽多肽的抗體來檢測。因此，表位標簽使得表達的蛋白質能夠容易地通過親和純化來純化，所述親和純化使用抗-標簽抗體或結合該表位標簽的其他類型的親和基質。各種標簽多肽和它們各自的抗體是本領域所熟知的。示例性的標簽包括但不限于聚組氨酸(poly-his)或聚-組氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)標簽；流感HA標簽多肽及其抗體12CA5(Field等人，(1988)Wo入8:2159-65);c-myc標簽和針對其的8F9、3C7、6E10、G4、B7和9E10抗體(Evan等人，(1985)Ce/人A/o/.5:3610-6);以及單純皰疹病毒糖蛋白D(gD)標簽及其抗體(Paborsky等人，(1990)3(6):547-53)。其他的標簽多肽包括Flag-肽(Hopp等人，(1988)Siorec力"o7.6:1204-10);KT3表位肽(Martin等人，(1992)5^/e"ce255:192-4);微管蛋白表位肽(Skinner等人，(1991)/.飾/.C力e邁.266:15163-6);以及T7基因10蛋白肽標簽(Lutz-Freyermuth等人，(1990)戶潔.5W.咖87:6393-7)。肝期癡原蟲多肽(包括其免疫原性衍生物)的共價修飾包括在本發明的范圍內。共價修飾的一種類型包括將蛋白質的被靶向的氨基酸殘基與能與該蛋白質的所選側鏈或者N-或C-末端殘基反應的有機衍生化試劑反應。用雙官能試劑進行衍生化可用于例如將蛋白質與水不可溶性支持基質或表面交聯以用于篩選測定法中。通常使用的交聯劑包括但不限于，1，1-雙(重氮乙酰基)-2-苯基乙烷，戊二醛，N-羥基琥珀酰亞胺酯(例如，與4-疊氮基水楊酸形成的酯)，同基雙功能亞氨酸酯，包括二琥珀酰亞氨基酯例如3，3，-二硫代雙(琥珀酰亞氨基丙酸酯)，雙功能馬來酰亞胺例如二-N-馬來酰亞胺基-l，8-辛烷，以及諸如甲基-3-[(p-疊氮基苯基)聯硫基]propioimidate的試劑。本發明的肝期瘧原蟲多肽(包括其免疫原性衍生物)可以在表達后進行純化或分離。術語"分離的"、"純化的"或"生物學上純的"指這樣的材料，所述材料實質上或基本上沒有在其天然狀態中發現通常與其伴隨的組分。純度和同質性通常使用分析化學技術例如聚丙烯酰胺凝膠電泳或高效液相色傳法來測定。作為制備物中存在的主要種類的蛋白質被認為是基本上純化的。術語"純化的"表示蛋白質在電泳凝膠上基本上產生一條帶。例如，其表示，蛋白質具有至少85%的純度，例如至少95%的純度或至少99%的純度。術語"分離的多肽"也包括在重組宿主細胞內原位的多肽，因為該多肽天然環境的至少一種組分將不存在。然而，通常地，使用至少一個純化步驟來制備分離的多肽。取決于哪些其他組分存在于樣品中，本發明的肝期疾原蟲多肽可以以各種本領域技術人員已知的方法進行分離或純化。標準的純化方法包括電泳、分子、免疫學和色謙技術，包括離子交換、疏水、親和和反向HPLC色謙法以及色謙聚焦。例如，蛋白質可以用抗體柱來純化。超濾和滲濾技術，與蛋白質濃縮一起，也是有用的。合適的純化技術在本領域中是標準的(通常參見R.Scopes(1982)/Vote/"/^r/77cs〃o/z,Springer-Verlag,N.Y.;Deutcher(1990)//e由c^//7j^/l^r頂0/(^"/fo7.7<2.'Cw/defo^P/7fe//7戶wri尸ycaf/'o刀,AcademicPress,Inc.N.Y.)。需要的純化程度將取決于多肽的用途而不同。在一些情形中，可以不需要純化。本發明的一些實施方案提供了合成的肝期瘧原蟲多肽。具有多達大約100-150個氨基酸殘基的多肽可以使用已建立的技術通過體外合成來制備。合成的多肽可以使用本領域已知的方法，例如在Merrifield等人，(1964)/.J邁.C力e邁.85:2149;Houghten等人，(1985)#"7.Sc人f/^，82:51:32;和Stewart&Young(1984)Solidphasepeptidesynthesis,PierceChemCo.，Rockford,III中描述的那些方法，通過化學合成(例如固相肽合成)來制備。可以合成在氨基末端具有或不具有甲硫氨酸的此類多肽。化些參考文獻中列出的方法i行氧化以形成二硫;。此外，^T以制備在結構和/或功能上類似于多肽具體表現的肽模擬物(peptidomimetics)。已經描述了用于制備類似于多肽的肽^=莫擬物的幾種方法(參見，例如美國專利號5，288，707;5,552,534;5，811，515;5，817，626;5,817,879;5，821，231和5，874，529)。本發明的另一個方面提供了分離的核酸分子，其編碼本發明的肝期瘧原蟲多肽。因此，一些實施方案提供了分離的核酸分子，其編碼包含選自SEQIDN0:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物的多肽。例如，所述核酸分子可以編碼選自SEQIDNO:11-44的惡性痦原蟲多肽及其免疫原性衍生物。術語"分離的核酸分子，，指已經從其天然環境中移出的核酸分子、DNA或RNA。例如，對于本發明來說，認為包含于載體中的重組核酸是分離的。分離的核酸分子的實例包括在異源宿主細胞中維持的重組DNA分子或在溶液中的純化的(部分或基本上純化的)DM分子。分離的RNA分子包括本發明的DNA分子的體內或體外RNA轉錄物。根據本發明的分離的核酸分子進一步包括通過合成產生的此類分子。本發明的分離的核酸分子包括包含編碼肝期瘧原蟲多肽或其免疫原性衍生物的開放閱讀框(0RF)的DM分子。這些核酸分子的序列可以不同于編碼本發明的肝期疾原蟲多肽的任何天然序列，但是，由于遺傳密碼的簡并性而仍然編碼肝期瘧原蟲多肽。當然，遺傳密碼是本領域熟知的。因此，對于本領域技術人員來說產生此類簡并變體是常規的。本發明的另一個方面提供了編碼本發明的肝期瘧原蟲多肽的表達載體。本發明的另一個方面提供了包含編碼本發明的肝期癡原蟲多肽的表達栽體的宿主細胞。本發明的另外一個方面提供了特異性地結合本發明的肝期瘧原蟲多肽(包括其免疫原性衍生物)的抗體。術語"抗體"指完整的免疫球蛋白，或指免疫球蛋白的抗原結合部分，其與完整抗體竟爭特異性結合本發明的蛋白質或蛋白質的片段。示例性的抗體包括多克隆的、單克隆的、人源化的、雙特異性的和異綴合的抗體。本發明的免疫球蛋白的抗原結合部分可以通過各種技術產生，包括但不限于重組DNA技術和完整抗體的酶促或化學切割。如此處使用的，"分離的抗體"是這樣的抗體，其(1)不與天然與其結合的組分(包括在其天然狀態中與其伴隨的其他抗體)相結合，(2)沒有來自相同物種的其他蛋白質，(3)由來自不同物種的細胞表達，或(4)在自然界中不存在。術語"特異性地結合，，和"特異性的結合"指本發明抗體結合第一種分子種類優先于結合其他分子種類的能力，其中所述其他分子種類與該抗體和第一種分子種類相混合。當抗體可以特異性地結合第一種分子種類時，該抗體被認為是特異性地"識別"所述第一種分子種類。在本發明中，第一種分子種類是本發明的肝期瘧原蟲多肽。用于制備多克隆抗體的方法是技術人員已知的。多克隆抗體可以在哺乳動物中產生，例如通過一次或多次注射免疫劑，如果需要，還有佐劑。通常，免疫劑和/或佐劑將通過多次皮下或腹膜內注射而注射入哺乳動物中。免疫劑可以包括本發明的全長肝期瘧原蟲多肽或其免疫原性衍生物。將免疫劑綴合至已知在待免疫的哺乳動物中具有免疫原性的蛋白質可以是有用的。此類免疫原性蛋白質的實例包括但不限于，匙孔血藍蛋白、血清白蛋白、牛甲狀腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制劑。可用的佐劑的實例包括弗氏完全佐劑和MPL-TDM佐劑(單磷酰基脂質A、合成的棒桿菌分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可由本領域技術人員進行選擇而不需要過度的試驗。單克隆抗體可以用雜交瘤方法，例如由Kohler&Milstein(19")^&re256:495描述的那些方法來制備。在雜交瘤方法中，通常用免疫劑來免疫小鼠、倉鼠或其他合適的宿主動物來引出產生或能夠產生將特異性地結合所述免疫劑的抗體的淋巴細胞。備選地，可體外免疫淋巴細胞。用于產生單克隆抗體的合適的永生化細胞系是本領域所熟知的(參見，例如Goding(1986)MonoclonalAntibodies:PrinciplesandPractice,AcademicPress,pp.59-103;Kozbor(1984)/.133:3001;Brodeur等人，(1987)MonoclonalAntibodyProductionTechniquesandApplications,MarcelDekker，Inc.,NewYork,pp.51-63)。由雜交瘤細胞產生的單克隆抗體的結合特異性可以通過免疫沉淀或通過體外結合測定法例如放射免疫測定法(RLA)或酶聯免疫吸附測定法(ELISA)來測定。這些技術和測定法是本領域所熟知的。單克隆抗體的結合親和性可以例如通過Munson和Pollard(1980)j/2a人腸c力e瓜107:220所描述的斯卡查德分析(Scatchardanalysis)來測定。單克隆抗體可以通過常規的免疫球蛋白純化方法，例如蛋白A-sepharose、羥磷灰石色鐠、凝膠電泳、透析或親和色譜從培養基或腹水中分離或純化。單克隆抗體也可以通過重組DNA方法，例如U.S.Pat.No.4，816，567(通過提及并入本文)中描述的那些方法來制備。單克隆抗體可以4吏用噬菌體展示文庫來分離(Hoogenboom&Winter(1991)/.#0/.萬/oA227:381;Marks等人，(1991)/.222:581)。本發明的抗體可以是單價抗體。用于制備單價抗體的方法是本領域所熟知的。例如，一種方法涉及免疫球蛋白輕鏈和經修飾的重鏈的重組表達。通常在Fc區中的任意位點處將重鏈截短以防止重鏈交聯。備選地，將有關的半胱氨酸用另一種氨基酸殘基置換或將其刪除以防止交聯。體外方法也適合用于制備單價抗體。可使用本領域已知的常規技術來消化抗體以產生其片段，特別是Fab片段。抗體也可以是人或人源化抗體、雙特異性抗體或異綴合抗體(heteroconjugateantibodies)。用于制備人或人源化抗體、雙特異性抗體或異綴合抗體的方法是本領域所熟知的，并且例如在Desnoyers等人，U.S.Pat.No.7,084,258(通過提及并入本文)中描述。特異性地結合本發明的肝期瘧原蟲多肽的抗體可以用于診斷測定法以例如檢測肝期癡疾寄生蟲的存在，或者可用作治療性或預防性試劑以用于治療或預防癡原蟲感染。術語"治療性試劑"指能夠治療瘧疾感染的試劑。術語"預防性試劑，，指能夠預防惡性瘧原蟲感染的試劑。在一些實施方案中，所述抗體可用于通過被動免疫來治療處于發展出或患瘧疾的風險中的受試者。通常，這將包括將治療或預防有效量的一種或多種本發明的抗體施用給易患瘧疾的受試者或表現出癡疾感染的受試者。可以施用該抗體的任何活性形式，包括Fab和F(ab')2片段。治療具有瘧疾感染的個體可以包括施用治療有效量的本發明抗體。施用的抗體的劑量將取決于諸如患者的年齡、體重、高度、性別、一般醫學狀況、既往病史等的因素以及本領域技術人員已知的其他因素而變化。合適的有效量可以僅使用常規的試驗而容易地確定。用于治療或預防應用的有效量和施用途徑在下面進一步描述。本發明的另一個方面提供了包含一種或多種本發明的肝期瘧原蟲多肽和藥學上可接受的栽體的組合物。因此，一些實施方案提供了包含肝期瘧原蟲多肽和藥學上可接受的載體的免疫原性組合物，其中所述肝期瘧原蟲多肽包含選自SEQIDNO:1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。例如，分離的多肽可以是選自SEQIDNO:11-44的惡性癡原蟲多肽及其免疫原性衍生物。在一些實施方案中，所述免疫原性組合物包含至少兩種選自SEQIDNO:1-48的肝期瘧原蟲多肽及其免疫原性衍生物。在一些實施方案，本發明的組合物是用于誘導免疫應答的免疫原性組合物，例如疫苗組合物。"疫苗"是能夠引發針對瘧原蟲寄生蟲感染和/或瘧疾的保護作用的免疫原性組合物，無論是部分還是完全。用于治療受感染的個體的疫苗可以稱為治療性疫苗。本發明的免疫原性組合物也可以用于在惡性癡原蟲不能感染的物種中引發抗體，例如在兔或小鼠中產生抗體。除了一種或多種本發明的肝期瘧原蟲多肽外，本發明的組合物還可以包含其他抗原。例如，所述組合物可以包含基于瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原，其目前在RTS，S疫苗中使用(參見MatuschewskiU006)to\r.Op./薦/20/.18:1-9)。本發明進一步提供了用于通過將一種或多種本發明的惡性瘧原蟲多肽懸浮或包裝在合適的藥學上可接受的栽體中來制備免疫原性組合物的方法。合適的藥學上可接受的載體包括無菌水或無菌生理鹽水溶液，特別是磷酸鹽緩沖鹽水(PBS),這是本領域所熟知的。本發明的免疫原性組合物通常還包含佐劑。合適的佐劑是本領域所熟知的(參見例如，Kscc/"e/es/g/2—7力e57/6y""a/dJf/y"p^/^/f/7/roac力(1995)PharmaceuticalBiotechnology,Volume6(eds.Powell,M.F.，&Newman,M.J.)PlenumPress,NewYorkandLondonISBN0-306-44867-X)。示例性的佐劑包括不在人中使用的弗氏完全佐劑(CFA)、弗氏不完全佐劑UFA)、角藍烯、角鯊烷和明礬(例如Alhydrogel,Superfos,Denmark)，這些佐劑是本領域所熟知的材料并且可從多個來源商購獲得。其他的示例性佐劑包括在Lanar等人，美國專利號7，029，685和美國專利公開號2006/0073171(通過提及而引入本文)中描述的佐劑。在一些實施方案中，免疫原性組合物是疫苗組合物。疫苗制備在NewTrendsandDevelopmentsinVaccine(eds.Voller等人)，UniversityParkPress,Baltimore,Md.，U.S.A.,1978中進行了全面描述。包嚢在脂質體內例如由Fullerton，美國專利號4，235，877進行了描述。蛋白質與大分子的綴合例如由Likhite，美國專利號4，372，945以及由Armor等人，美國專利號4，474，757所公開。每份疫苗劑量中存在的免疫原的量被選擇為誘導免疫應答而無明顯不利副作用的量。術語"免疫應答"措獲得的和程度增強的針對瘧原蟲感染或痗疾的保護性免疫力，例如在隨后暴露于瘧疾寄生蟲后完全或部分的針對感染或疾病的保護作用。每劑中存在的免疫原的量取決于采用哪些特異性免疫原以及其他因素而變化。通常，期望每劑包含總共1-1000微克的蛋白質，例如1-200微克或10-100微克或5-50微克的蛋白質。在初次疫苗接種后，受試者將通常接受一次或多次加強免疫。關于特定疫苗的最佳量以及加強免疫的數目和頻率可以通過標準研究(包括觀察受試者中的免疫應答)根據經驗來確定。本發明的疫苗組合物可以通過本領域已知的任何合適的施用方法進行施用，包括但不限于，皮內、皮下、肌內、腹膜內、口服、眼(例如作為眼噴霧劑)和靜脈內。常規地，疫苗通過注射例如皮下或肌內注射而經腸胃外施用。適于其他施用方式的另外制劑包括栓劑，以及在一些情形中，口服制劑或鼻噴霧劑。對于栓劑，傳統的粘合劑和載體可以包括例如聚烷撐二醇或甘油三酯。口服制劑包含通常采用的賦形劑，例如，藥用級甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂等。在一些實施方案中，本發明的疫苗組合物是包含編碼一種或多種本發明肝期惡性瘧原蟲多肽的核酸分子的DNA疫苗。因此，一些實施方案提供了包含編碼多肽的核酸分子和藥學上可接受的載體的免疫原性組合物，其中所述多肽包含選自SEQIDN0:l-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。例如，所述核酸分子可以編碼選自SEQIDN0:11-48的惡性癡原蟲多肽及其免疫原性衍生物。所述免疫原性組合物可以額外包含編碼其他抗原的核酸，所述其他抗原例如為基于瘧原蟲環子孢子蛋白質的抗原，其目前在RTS，S疫苗中使用(參見Matuschewski(2006)Cwrr.化/鵬歸/.18:1-9)。用于制備和施用表達癡原蟲蛋白質的DNA疫苗的方法是本領域已知的，并且先前已有描述(參見，例如000比11&HoffmanQOOl)/W././^a"7o入31:753-62;Narum等人，美國專利號7，078，507，通過提及而并入本文)。在一些實施方案沖，本發明的疫苗組合物是包含編碼一種或多種本發明的肝期惡性癡原蟲多肽的病毒栽體的病毒疫苗。用于本發明的疫苗組合物的示例性病毒載體包括但不限于，痘苗病毒栽體(例如基于經修飾的痘苗病毒或禽痘病毒的載體)、腺病毒栽體和黃熱病毒載體(參見，例如Imoukhuede等人，(2006)&cc//ie，//7;7ress;Miao等人，(2006)Facc//7e，2'刀；ress;Tao等人，(2005)/.^t.201:201-9)。用于制備和施用表達瘧原蟲蛋白質的病毒疫苗的方法是本領域已知的，并且先前已有描述(參見，例如，Imoukhuede等人，(2006)Facc//7e，///re^;Miao等人，(2006)racc//7e，//7;7,e5^;Tao等人，(2005)/.五;r;7.￥e《201:201-9)。用于制備編碼本發明的肝期瘧原蟲多肽的DNA疫苗的示例性方法在實施例7中提供。在另一個方面，本發明提供了基因工程減毒的子孢子，從所述子孢子中已經除去了至少一種編碼本發明的肝期多肽的基因。因此，在一些實施方案中，本發明提供了基因工程減毒的痗原蟲子孢子，所述子孢子缺少編碼選自SEQIDNO:1-48的肝期多肽的基因。編碼肝期多肽的基因可以是編碼選自SEQIDNO:11-44的惡性疾原蟲多肽的基因。用于制備基因工程減毒的缺少肝期基因的癡原蟲子孢子的方法先前已經有描述(參見例如，Mueller等人，(2005)#a433:164-7;Mueller等人，(2005)戶roc,Jca丄Sci.^S^102:3022-7;Kappe等人，美國專利公開號2005/0226896，通過提及而并入本文)。本發明的另一個方面提供用于誘導針對肝期惡性瘧原蟲寄生蟲的免疫應答的方法，該方法包括施用含有有效量的一種或多種本發明的肝期惡性痗原蟲多肽的免疫原性組合物。因此，在一些實施方案中，本發明提供了用于在哺乳動物受試者中誘導針對惡性瘧原蟲的免疫應答的方法，該方法包括將含有有效量的至少一種分離的多肽的組合物施用給哺乳動物受試者，所述多肽選自SEQIDNO:1-48及其免疫原性衍生物。例如，所述分離的多肽可以是選自SEQIDNO:11-44的惡性疾原蟲多肽及其免疫原性衍生物。如此處使用的，術語"哺乳動物受試者，，包括但不限于，人、山羊、兔和小鼠。在一些實施方案中，哺乳動物受試者是人受試者。本發明的另一個方面提供了用于治療有此需要的哺乳動物受試者的方法，包括將含有有效量的一種或多種本發明的肝期惡性瘧原蟲多肽的免疫原性組合物施用給有此需要的哺乳動物受試者。因此，在一些實施方案中，本發明提供了用于治療有此需要的人受試者的方法，包括將含有至少一種分離的選自SEQIDNO:l-48的多肽及其免疫原性衍生物的免疫原性組合物施用給人受試者。例如，所述分離的多肽可以是選自SEQIDNO:11-44的惡性瘧原蟲多肽及其免疫原性衍生物。法，該方法包括施用活的、基因工程減毒的瘧原蟲生物體，所述瘧原肽的基因。用于施用活的、基因工程減毒的癡原蟲生物體和誘導針對瘧原蟲寄生蟲的免疫應答的方法先前已經有描述(參見，例如，Mueller等人，(2005)yY""re433:164-7;Mueller等人，(2005)戶藩.Sc/.KW102:3022-7;Kappe等人，美國專利公開號2005/0226896，通過提及而并入本文)。術語"處理，，指治療性處理和預防性或保護性措施，其中目標是防止或減緩(減輕)所耙向的病理狀態或疾病。需要處理的那些受試者包括已經患有疾病的那些受試者以及傾向于患有疾病的那些受試者或其中疾病有待阻止的那些受試者。在一些實施方案中，待處理的受試者是患有瘧疾例如肝期瘧疾的人受試者。在一些實施方案中，待處理的受試者是有感染瘧疾風險的人受試者。待處理的受試者先前可能有或可能沒有被癡原蟲寄生蟲感染。用于治療性或預防性處理的術語"有效量"指足以在被施用了組合物的個體中誘導所需的應答(例如免疫應答)的組合物的量或劑量。優選地，有效量是足以實現如上定義的處理的量。施用特定治療性或預防性處理的有效量和方法可以基于患者個體和疾病的階段以及本領域技術人員已知的其他因素而變化。此類化合物的治療功效和毒性可以通過標準的藥學程序在細胞培養物或試驗動物中測定，例如測定ED50(在50%的群體中治療上有效的劑量)和LD50(50%的群體致死的劑量)。毒性效果與治療效果的劑量比是治療指數，并可表示為比率LD50/ED50。表現出大的治療指數的藥物組合物是優選的。將從細胞培養測定法和動物研究中獲得的數據用于制定一定范圍的用于人的劑量。此類化合物的劑量優選處于一定的循環濃度范風內，所述循環濃度范圍包括具有小的毒性或無毒性的ED50。取決于所采用的劑型、患者的敏感性和施用途徑，劑量可以在該范圍內變化。確切的劑量由獨個醫生根據待處理的患者而選擇。調節劑量和施用以提供足夠水平的活性成分或維持所需的效果。可以考慮的其他因素包括惡性瘧原蟲在患者的地理鄰近區的流行狀況、患者的疾病狀態的嚴重度、患者的年齡和體重、飲食、施用的時間和頻率、藥物聯用、反應敏感性和對治療的耐受性/響應。合適的有效量可以僅用常規的試驗而容易地確定。每個個體可能需要幾次劑量以獲得足夠的應答從而實現處理。關于初次施用和隨后施用(例如，加強注射)的合適的給藥方案也可以變化，但是典型的是進行初次施用，相隔一段時間(數周或數月)后進行后繼施用。通過處理而引發的抗體產生很容易通過下述方式來確定從施用了免疫原性組合物的受試者中獲得血漿或血清樣品，并就它們結合用于引發針對惡性瘧原蟲寄生蟲(例如肝期寄生蟲)的免疫應答的多肽的能力來對其中的抗體進行檢定。示例性的方法包括但不限于，本領域所熟知的ELISA測定法、免疫焚光測定法(IFA)或其他免疫測定法如Western印跡法。針對本發明的一種或多種肝期惡性瘧原蟲寄生蟲的抗體可以使用眾所周知的技術從哺乳動物受試者的血液中分離，然后重構入用于被動免疫的第二種疫苗中，這也是眾所周知的。類似的技術用于人的廣球蛋白免疫。例如，來自一位或許多位經免疫的受試者的抗血清可以在含水硫酸銨(通常40-50°/的飽和度)中沉淀，并且通過色譜法(例如親和色譜)純化經沉淀的抗體。在另一個方面，本發明提供了診斷和篩選試劑和測定法，其可以是基于蛋白質的或基于核酸的。這些試劑和測定法可以用于檢測本發明的肝期瘧原蟲多肽或編碼它們的核酸分子的存在，以便確定患者是否正患有或可能患有瘧疾。可以使用許多技術，包括但不限于，ELISA、夾心測定法、免疫沉淀、免疫印跡法、雜交技術和PCR。在一些實施方案中，本發明的肝期瘧原蟲多肽用于檢測哺乳動物受試者中的抗體。在一些實施方案中，針對本發明肝期瘧原蟲多肽的抗體用于檢測這些多肽的存在，診斷性免疫測定法程序在本領域中是標準的(參見例如，A2Wca/d"2'//cW7iz邁W3070《/(1991)第7版，Stites，D.，&Terr，A.)。示例性的方法可以例如使用固相支持物或免疫沉淀。大多數測定法涉及使用經標記的抗體或多肽。此類標記可以是，例如酶標記、熒光標記、化學發光標記、放射性標記或染料分子。放大來自免疫復合物的信號的測定法也是已知的，例如利用生物素和抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白的測定法，以及酶標記和介導的免疫測定法，例如ELISA測定法。一些實施方案提供了用于體外診斷可能被惡性癡原蟲感染的受試者中的瘧疾的方法，該方法包括(a)使來自哺乳動物受試者的含有抗體的生物樣品與一種或多種本發明的肝期惡性癡原蟲多肽在一定條件下接觸，所述條件使得所述多肽和所述抗體之間能夠形成抗原/抗體復合物，并且(b)檢測抗原/抗體復合物的形成。可以用于執行該方法的生物樣品的實例是紅細胞、白細胞、血清或尿。使得能夠形成抗原/抗體復合物的條件是本領域所熟知的。本發明還提供了用于監控針對由惡性瘧原蟲引起的感染或疾病而進行疫苗接種的受試者的免疫狀態的方法，該方法包括(a)使來自受試者的含有抗體的生物樣品與一種或多種本發明的肝期惡性瘧原蟲多肽在一定條件下接觸，所述條件使得所述多肽和所述抗體之間能夠形成抗原/抗體復合物，并且(b)檢測抗原/抗體復合物的形成。在上面描述的診斷和監控方法中，可以進一步將所述生物樣品與一種或幾種來源于其他癡原蟲抗原的抗原肽接觸。在一些實施方案中，診斷和篩選試劑和測定法是基于核酸的。用于基于核酸的測定法的示例性診斷和篩選試劑包括與編碼本發明的惡性癡原蟲多肽的核酸分子互補的核酸探針。基于核酸的診斷和篩選測定法是本領域所熟知的。用于本發明該方面的示例性診斷和篩選測定法在Scherf等人，美國專利號6，855，323(通過提及而并入本文)中描述。本發明還提供了可用于實現本發明的試劑盒。所述試劑盒可以包括第一容器裝置，該容器裝置含有本發明的多肽、核酸分子、組合物和/或抗體。所迷試劑盒還可以包括其他容器裝置，所迷其他容器裝置含有實現本發明所必需的或便于實現本發明的溶液。所述容器裝置可以由玻璃、塑料、或箔制成，并且可以是管形瓶、瓶、嚢、管、袋等。所述試劑盒還可以包含書面信息，例如用于實現本發明的程序，或分析信息，例如第一容器裝置中所包含的試劑的量。所述容器裝置可以與書面信息一起在另一容器裝置例如盒子或袋子中。M"i兌明了頓.A者虔、用千實戰太勞曰/方案，但是不應理解為限制本發明實施例1本實施例描述了在肝期發育過程中差異表達的新的保守的約氏瘧原蟲(/Vas/z70cT/咖yoe"2')蛋白質的鑒定。有關肝期生物學的最重要的問題之一是該階段是否差異地表達獨特的一組蛋白質。然而，由于肝期難以通過試驗進行追蹤，因而該問題仍然遠沒有解決。本實施例描述了在體內在嚙齒動物瘧疾的約氏瘧原蟲的肝期中差異表達的基因及其蛋白質產物(PyLSPl)。生物信息學分析、PCR和RT-PCR闡明了完整的基因結構并鑒定了在惡性瘧原蟲中的PyLSPl直向同源物。RT-PCR和免疫測定法顯示，PyLSPl表達在體內晚肝期被上調，但在子孢子和寄生蟲血液期中其未顯著表達。材料和方法微陣列研究使用Trizol(Invitrogen)從感染了〉3百萬個約氏瘧原蟲野生型子孢子的BALB/c小鼠肝臟中分離肝總RNA。在寄生蟲血癥達到5%時，從Swiss-Webster小鼠中的血液期感染物中獲得血液期RNA。用DM酶(Invitrogen)處理RNA以除去基因組DNA污染物。將大約20微克總RNA用于cDNA合成，并使用購自Stratagene的Fairplay標記試劑盒用熒光Cy3或Cy5染料間接進行標記。將經Cy3和Cy5標記的cDM與由DrexelUniversity的LawrenceBergman小組制備的定制的65-mer寡核苷酸陣列雜交過夜，該陣列具有雙倍的關于約氏瘧原蟲全部~6500個有注解的基因的探針。洗滌后，用GenePix掃描儀掃描該微陣列載片，并用Acuity軟件分析結果。將每個點的信號強度標準化，并與具有隨機寡核苷酸(陰性對照)的點進行比較。將檢測表達的基因的閾值設定為陰性對照的信號強度的4倍。對來自感染后40小時的受感染的肝臟、未感染的肝臟和混合的血液期的總RM進行微陣列分析。如下選擇用于分析的我們的候選基因在感染40小時的肝臟中高度表達；在混合的血液期中低水平表達或不表達；可能與惡性癡原蟲基因直向同源；和存在信號肽。信號肽的存在是由該基因編碼的蛋白質可被分泌并因而可在宿主-寄生蟲相互作用中起重要作用的指示。然后，通過定量實時PCR來分析候選基因，如實施例2中所描迷的。蛋白質表達研究推定的免疫原性肽的定位用在網絡上可獲得的用于蛋白質二級結構預測的各種程序來鑒定。肽2(KDDYSKNNGKDSLVCC，SEQIDNO:49)和肽5(CNLKYLLLHHTNAFLC，SEQIDNO:50)由商業公司(Sigma-Genosys)合成。通過SigmaGenosys，將兩只新西蘭白兔用于抗體的產生。按照77-天時間表(每只動物6次免疫和4次放血)，與弗氏佐劑一起皮下注射所述肽。使用標準方案，將所述肽抗體用于LSP1的免疫熒光和免疫印跡分析。結果LSP1的鑒定和表達利用微陣列基因表達譜，我們鑒定了僅在40小時的體內約氏癡原蟲LS發育時表達的基因(表1和2)。一個獨特表達的基因是編碼具有~380kDa的預測分子量的假定蛋白質的戶j^S厶約氏癡原蟲基因產物含有預測的可切割的信號肽和跨膜結構域。分別使用PlasmoDB和SangerCenter數據庫，用PyLSPl氨基酸序列進行BLAST同源性搜索以鑒定在惡性瘧原蟲和柏氏瘧原蟲(尺6erg力ei)中的直向同源基因。在惡性癡原蟲和柏氏痦原蟲寄生蟲中都發現了潛在的直向同源物。約氏癡原蟲PyLSPl的基因識別號是PY04499(SEQIDNO.1)，惡性痦原蟲PyLSPl的基因識別號是Pf14—0179(SEQIDNO:11),和柏氏癡原蟲PyLSPl的基因識別號是gi68075600。LSP1在晚肝期表達我們用特異性引物通過RT-PCR和qRT-PCR研究了戶/丄57^在不同的寄生蟲發育階段的表達。在感染后40小時提取的受感染肝臟樣品中檢測到了尸/i^尸7。這些結果也顯示，PyLSPl在子孢子、早肝期和血液期中被下調(參見下面的表1)。為了研究PyLSPl的蛋白質表達模式，我們產生了針對兩種獨立的肽的抗血清，所述兩種獨立的肽處于在具有高度的預測的抗原性的區域中。免疫共定位分析顯示，在感染后44小時提取的肝臟切片中PyLSPl由LS高度表達。在感染后24小時在LS中存在淡的內部染色。PyLSPl看起來位于寄生泡中。在子孢子、血液期或早LS中檢測不到表達。免疫共定位數據與RT-PCR數據一致，PyLSPl存在于晚LS中但不存在于早LS中。實施例2本實施例描述了在肝期發育過程中差異表達的新的約氏瘧原蟲蛋白質的鑒定。材料和方法a.RNA制備根據生產商的說明書，用Trizol(InvUrogen)從混合的血液期、唾液腺子孢子和約氏瘧原蟲感染的小鼠肝臟中制備總RNA。來自混合的血液期和被感染的小鼠肝臟的總RNA用Turbo-freeRNA酶(Ambion)處理，而來自子孢子的總RNA用無RNA酶的DM酶(Invitrogen)根據生產商的說明書進行處理。經處理的RM用RNeasymini試劑盒(Qiagen)進行凈化。RAN濃度通過分光光度法進行測量，和RAN品質用AgilentBioanalyzer來檢驗。b.引物設計用引物分析軟件PrimerExpressv2，0和v3.0(AppliedBiosystems)來設計引物。i殳計是基于可從PlasmoDB獲得的基因的mRNA序列。將擴增子設定在IOO至250bp。c.常規和實時RT-PCR:對于常規的RT-PCR,將2.5微升稀釋的cDNA用于每個25微升的PCR反應，該反應具有2.5微升稀釋的cDM、25皮摩爾每種引物和12.5孩吏升BiolineRedPCRmix(Bioline)，使用以下循環條件最初在95。C下變性3分鐘；9VC下30秒、55匸下"秒和"。C下1分鐘，進行30個循環；以及最后在72。C下延伸7分鐘。實時PCR分析在ABIprism7300SequenceDetectionSystems上用SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems)來進4亍。PCR反應體系由12.5微升SYBRGreenPCRMasterMix、20皮摩爾正向和反向引物以及5微升稀釋的cDNA組成，總體積為25微升。PCR循環條件使用ABIPrism7300SDSSoftware的默認條件進行。為了驗證PCR擴增產物是獨特的，在PCR后增加解離方案，從65'C升至95。C。對于每種引物對，包括了無模板對照，感染40小時的肝臟+混合的血液期cDNA混合物的4種系列稀釋物的標準曲線，以及每種測試cDNA(混和的血液期，12、24、40小時的肝臟，和唾液腺子孢子)。d.正規化(normalization)和相對定量用相對標準曲線方法(RelativeStandardCurveMethod)(AppliedBiosystems公報)將五種不同的RM樣品正規化至約氏瘧原蟲的18S和14-3-3蛋白持家基因。標準品從來自混合的血液期和被感染的小鼠肝臟(1:1)的總RM混合物中制備。第一條鏈的cDM從這種總RNA混合物中制備。將得到的cDNA的1:1、1:5、1:10、1:25和1:50的稀釋物用作每種引物對的實時PCR的模板。來自測試cDNA的每種擴增的基因產物的相對量從相應的標準曲線上內插得到。由于定量被正規化至18S和14-3-3持家基因，因而產生了耙基因和參考基因(18S和14-3-3)的標準曲線。每種靶基因的正規化的量被表示為靶基因的相對量與每種參考基因的比率，從而得到不同的正規化的值。然后，通過得到在不同測試cDM中每種基因的正規化表達值與在混合的血液期中該基因的正規化表達值的比率，計算出與混合的血液期相比較的倍數變化表達(即，將混合的血液中的倍數表達設定為1的值)。結果發現IO種約氏瘧原蟲基因在肝期中特異性表達。這些基因中的9種在惡性癡原蟲中具有直向同源物，如表1中所顯示的。這IO種基因在肝期中的表達模式顯示于表2中。表l.在實施例1和2中鑒定的肝期基因<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>表2.在實施例l和2中鑒定的肝期基因的表達模式<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>實施例3本實施例描述了在肝期發育過程中差異表達的新的惡性癡原蟲蛋白質的鑒定。我們優化了惡性瘧原蟲寄生蟲對HC-04肝細胞的體外感染并采用RNA的無偏擴增以便獲得足夠的材料用于微陣列研究。我們將這些材料施加至微陣列上，并比較未感染的和受感染的HC-04肝細胞的基因表達譜以鑒定被肝期寄生蟲獨特轉錄的基因。我們用生物信息學工具來分析這些基因以確定哪些可能是肝期寄生蟲所特有的。這些基因編答來預防惡性痗原蟲i染，、或用于開發靶向肝^寄生蟲的藥物或診^劑。材料和方法a.惡性癡原蟲對HC04肝細胞的體外感染的優化將人肝細胞系HC-04接種于6-孔組織培養板中，并在用在空氣中的10%0)2平衡的潮濕培養箱中于37。C，在補充有抗生素和胎牛血清的培養基中維持直至匯合。將在銅養后3周手工剖出的惡性癡原蟲子孢子以2:1(子孢子細胞)的比率加入至HC-04細胞中。在子孢子接種后3小時改變培養基，然后每48小時改變培養基，直至觀察到紅細胞外裂殖子(參見Sattabongkot等人，(2006)J瓜/.7>o/.74(5):706-7)。肝期寄生蟲的檢測用吉姆薩染色來進行。b.微陣列研究微陣列試驗如先前描述的(Bozdech等人，(2003)^"o/weWo人4(2):R9)來進行。將未經修飾的70-mer寡核苷酸印在CorningUltraGaps聚-L-賴氨酸載片上。在用硼酸中和的l-甲基-2-吡咯烷酮中用琥珀酸酐封閉載片。使用PureLinkMicro-to-MidiTotalRNAPurificationSystem(Invitrogen，產品目錄號12183-018)并根據生產商的說明書來分離RM。使用Ambion'sAminoAllylMessageAmpIIaRNAKitAmplification(Ambion，產品目錄號1753)并根據生產商的說明書來擴增RNA。在存在0.1MNaHC03pH9.0的情況下，將得到的含有aa-dUTP的cDNA偶連至CyScribeCy3或Cy5(Amersham，Piscataway，NJ)單官能染料。將偶聯反應體系在室溫下孵育最少1小時。雜交介質含有3xSSC、1.5mg/mlpoly(A)腿和0.5%SDS。雜交在65°C下進行8-16小時。在室溫下將陣列在2xSSC/0.2%SDS中洗滌并然后在0.lxSSC中洗滌。使用GenePix4000掃描儀來掃描所述微陣列，并^f吏用GenePix軟件(AxonInstruments,UnionCity,CA)來分析圖象。c.qPCR:用96-孑L形式的7000SequenceDetectionSystem(AppliedBiosystems)在lxSYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems，產品目錄號4334973)中，在存在500nM每種正向和反向引物的情況下以0.050ml的體積進行qPCR反應。典型的qPCR條件是5(TC下2分鐘，95。C下10分鐘，隨后進行45個循環的擴增。每個擴結果、'、^'在4個完成的微陣列中的兩個或更多個中被檢測為上調(在感染的對未感染的HC04細胞中)的惡性瘧原蟲基因的比例實質上并且顯著地大于非疾疾(人或酵母)基因的比例。這確立了我們的標準在我們的4個陣列中的2個或多個中被檢測為上調的基因是候選肝期抗原。由肝期寄生蟲轉錄的基因已經通過定量PCR(qPCR)進行了證實。肝期基因的qPCR檢測用下面的質量控制程序來進行以確保特異性鑒定和定量a)每種基因用兩個獨立的引物對/qPCR反應來檢測；b)qPCR-擴增的基因片段通過瓊脂糖凝膠上的大小來證實；c)將受感染的HC04細胞的qPCR與未感染的HC04細胞的qPCR進行比較以顯示特異性；d)將肝期基因的qPCR正規化至持家基因的qPCR以定量豐度；e)比較肝期寄生蟲和其他階段(子孢子期、晚環狀體期、晚營養子期和晚裂殖體期)之間的基因的qPCR以證實轉錄的階段特異性。表3顯示了在用一組持家基因進行正規化后，與子孢子期、晚環狀體期、晚營養子期和晚裂殖體期相比較，通過qPCR鑒定為在肝期期間過表達的惡性瘧原蟲基因的表達的相對量(以log2為刻度)。0(零)的值反映了在生物學上無意義的轉錄的估計值，這基于比持家基因轉錄水平的幾何平均值低1"70倍的水平。表3中的基因有可能對于肝期寄生蟲是獨特的。其表達被發現在肝期中相比于其他階段有所升高的其他基因包括PFE0935c、PFB0610c、PF11一0480、PFD0270c、PFL1995c、PFA0170c、PF08—0054和PFI0875w。這些基因的序列以及由它們編碼的蛋白質可以從瘧原蟲基因組數據庫(http:〃plasmodb.org/;Kissinger等，(2002)^a,"re419:490-492)獲得，并且在此通過提及而并入本文(于2006年9月28日獲取的版本)。所有上述基因以及苗，或者作為藥物和診斷劑的靶標。位于惡性瘧原蟲基因座PFE0305w的基因(SEQIDNO:20)具有類似于轉錄起始因子TFIID(—種結合TATA的蛋白質)的序列。我們表明，這種轉錄起始因子是肝期特異性的。因此，敲除該基周可能提供了一種產生減毒的瘧疾寄生蟲的有力的策略。表3.肝期特異性基因的相對表達模式<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>LS-晚裂殖體期表4顯示了在子孢子期寄生蟲(在侵入肝細胞前)中過表達的惡性瘧原蟲基因表達的相對量(以1og2為刻度)，所述基因在肝期寄生蟲發育期間繼續表達，但是在血液期發育期間不表達或在血液期發育期間以顯著更低的水平表達。用一組持家基因將表達正規化。O(零)的值反映了在生物學上無意義的轉錄的估計值，這基于比持家基因轉錄水平的幾何平均值低170倍的水平。這些基因也是用于寄生蟲的基因敲除減毒，用于藥物和疫苗設計，以及用于開發診斷劑的重要靼標。表4.與血液期相比較，在肝期中過表達的基因的相對表達模式<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>SP=子孢子LR=晚環狀體期LT=晚營養子期LS=晚裂殖體期實施例4本實施例描述了作為保護性免疫的靶標的兩種肝期惡性瘧原蟲蛋白質的鑒定。針對肝期瘧疾的完全保護性免疫可以用減毒的寄生蟲來誘導(在Matuschewski(2006)Cwrr./邁邁wo/.18:1-9中做了綜迷)。這最初用已經通過輻射減毒的瘧原蟲得到證明，并且更近一些時候用已經通過除去關鍵的毒力基因而基因工程減毒的寄生蟲得到證明。在這些模式系統中，已經將保護性免疫與產生IFN，的T細胞相關聯(Kurtis等人，(2001)7re油尸ara"7o人17(5):219-23;Hoffman等人，(2002)/./力尸e".嵐185:1155-64;Berenzon等人，(2003)/.//MW30人171(4):2024-34),盡管還未清楚誰是該特異性T細胞的抗原華&標。我們使用了由減毒的寄生蟲誘導的保護性免疫的嚙齒動物模型，標。通過靜脈內注射用已經在子孢子期(即在蚊子的唾液腺中)經輻射減毒的柏氏瘧原蟲寄生蟲對小鼠接種三次。該免疫接種包括75，000個減毒的寄生蟲以用于引發，隨后為"，000和W，000個寄生蟲以用于每次加強。在最后的免疫接種后7天用10，000個野生型寄生蟲攻擊嚙齒動物，并且顯示出為完全保護的。在攻擊后5周我們從受保護的嚙齒動物的肝臟和脾臟中收集了免疫細胞，并檢查它們針對肽的特異性應答，所述肽代表惡性瘧原蟲抗原的柏氏瘧原蟲直向同源物。將肝單核細胞與單獨的培養基、與來自惡性瘙原蟲肝期蛋白質PFE305w(SEQIDNO:20)的柏氏瘧原蟲直向同源物的肽12(INLQNLNYI，SEQIDNO:51)、或與來自PF11—0480(SEQIDNo:19)的柏氏疸原蟲直向同源物的肽4(IAVENCNNI，SEQIDNO:52)—起培養。我們證明，來自受保護的嚙齒動物的肝臟T細胞而不是脾臟T細胞作為對于肽12和4的響應而表達IFN-y。這些數據確定，肝期蛋白質PFE0305w(SEQIDNO:20)和PF11一0480(SEQIDNo:19)為與保護作用相關的免疫力的抗原耙標，以及為由肝期癡疾寄生蟲表達的免疫原性抗原。實施例5本實施例描述了重組肝期癡原蟲蛋白質的表達。材料和方法a.蛋白質序列的分析不能表達為全長蛋白質的大分子量蛋白質可以表達為預測的免疫原性結構域。此類免疫原性結構域從在實施例1-3中鑒定的蛋白質的序列中預測，并用于動物免疫接種研究。蛋白質序列用DNASTAR程序通過幾種算法來分析，包括根據Kyte-Doolittle方法預測疏水性，才艮據Emini方法預測表面概率，和才艮據Jameson-Wolf方法預測抗原性(DNASTAR，Inc)。b.蛋白質在大腸桿菌中的表達蛋白質在原核載體pET28b中的表達通過下列方式來進行培養細菌至對數生長期，用1mMIPTG誘導重組蛋白質的表達，并繼續培養細菌培養物至飽和。離心培養物并將細菌細胞粒狀沉淀在溶液A(50mMTris、10mMEDTA、5mMDTT、2%TritonX-IOO、500mMNaClpH7.5)中洗滌3次。將蛋白質在溶液B(6M鹽酸胍、50mMTrispH8.0、5mMDTT)中溶解2小時。通過離心除去細胞碎片，并根據生產商的說明書(Novagen)將蛋白質溶液上樣至鎳柱上以純化His-標記的重組蛋白質。c.體外蛋白質表達由于一些瘧疾抗原可能難以在細胞系統中表達并且是依賴構象的，所以還將一種備選方法用于表達在實施例1-3中鑒定的蛋白質，這通過使用由CellFreeSciences生產的無細胞體外蛋白質合成系統(ENDEXTTechnology)來進行。該方法使用無轉錄抑制劑的麥胚裂解產物，其使得能夠穩定地翻譯真核蛋白質，包括構象依賴性的瘧疾抗原。將編碼這些蛋白質的基因克隆入pEU-E01-His-TEV-MCS載體(CellFreeSystems,Inc.)中，隨后根據生產商的說明書(CellFreeSciences)來合成蛋白質。使用抗-His珠并根據生產商的說明書(Dynal)來純化His-標簽蛋白質。d.蛋白質的免疫識別就它們被來自免疫的和未免疫的個體的T細胞和血清所識別來分析重組蛋白質，例如如在實施例4中，在Doolan等人，(2003)A^〃.JcaASc/.〃W100(17):9952-7中，和在Sundaresh等人，(2006)A/o/z7/謹"ic5122(14):1760-6中所描述的。預期用于免疫兔的蛋白質是具有免疫原性的，并且引發識別瘧原蟲肝期的抗體，如實施例l中所描述的，和/或引發T細胞應答，如實施例4中所描述的。以相比于來自未免疫的個體的T細胞和/或血清而言顯著更高的水平與來自免疫的個體的T細胞和/或血清反應的蛋白質被預期是用于癡疾疫苗的好的免疫原。實施例6本實施例描述了重組肝期惡性瘧原蟲蛋白質及其免疫原性衍生物在巴斯德畢赤酵母中的表達。a.免疫原性結構域的鑒定蛋白質序列用DNASTAR程序通過幾種算法來分析，包括根據Kyte-DooliUle方法預測疏水性，根據Emini方法預測表面概率，和根據Jameson-Wolf方法預測抗原性(DNASTAR，Inc)。為了改善重組蛋白質的溶解性，在表達結構域中不包含高度疏水的區域。b.肝期癡原蟲蛋白質在巴斯德畢赤酵母中的表達根據描述了如何在巴斯德畢赤酵母中克隆和表達蛋白質的詳細方案(可從Invitrogen作為EasySelectPichiaExpressionKit(產品編號K1740-01)的一部分而獲得)來表達蛋白質。c.高分子量肝期惡性瘧原蟲蛋白質的表達不能表達為全長蛋白質的高分子量蛋白質可以表達為預測的免疫原性結構域。在實施例1-3中鑒定的大的肝期瘧原蟲蛋白質中的一些在它們的序列中沒有顯示任何明顯的結構PF14—0179(SEQIDNO:11)是預測的423kDa蛋白質，PFD0260c(SEQIDNO:12)是預測的233.7kDa蛋白質，MAL13P1.66(SEQIDNO:15)是預測的345.7kDa蛋白質，PF11—0480(SEQIDNO:19)是預測的348kDa蛋白質，PFC0195w(SEQIDNO:26)是預測的170.5kDa蛋白質，PFC0960c(SEQIDNO:27)是預測的231.8kDa蛋白質，PFE1070c(SEQIDNO:42)是預測的162kDa蛋白質，和PFE1200w(SEQIDNO:43)是預測的147.8kDa蛋白質。將這些蛋白質表達為許多部分重疊的多肽，每個40-70kDa。d.小分子量和中等分子量的肝期惡性瘧原蟲蛋白質的表達將下列小分子量和中等分子量的蛋白質表達為全長蛋白質PF10—0027(SEQIDNO:16)是預測的49.7kDa蛋白質，PF11-0230(SEQIDNO:22)是預測的19.7kDa蛋白質，PF14—0534(SEQIDNO:24)是預測的55kDa蛋白質，PF13-0112(SEQIDNO:28)是預測的9.2kDa蛋白質，PF08-0073(SEQI譜:29)是預測的44.8kDa蛋白質，PFll-0221(SEQIDNO:32)是預測的7.1kDa蛋白質，PFB0690w(SEQIDNO:37)是預測的29.7kDa蛋白質，和PFD0205c(SEQIDNO:38)是預測的19.6kDa蛋白質。e.所選擇的肝期惡性瘧原蟲蛋白質的表達PFI112k(SEQIDNO:13)是分子量為33kDa的推定的3-氧酰基-(酰基-載體蛋白)還原酶。全長蛋白質和包含氨基酸59-300的保守結構域都被表達。PF13—0128(SEQIDNO:14)是分子量為26kDa的P-羥基酰基-acp脫水酶的前體。全長蛋白質和包含氨基酸72-230的保守結構域都被表達。MAL8P1.201(SEQIDNO:17)是分子量為128.6kDa的保守的假定蛋白質。該蛋白質表達為兩個結構域第一個結構域包含氨基酸1-545,第二個結構域包含氨基酸660-1073。這兩個結構域都是親水的并且含有多個抗原表位。PFE1450c(SEQIDNO:18)是分子量為22kDa的保守的假定蛋白質。表達了在推定的跨膜結構域后于氨基酸28處開始的該蛋白質的一個結構域。PFE0305w(SEQIDNO:20)是分子量為38kDa的轉錄起始因子TFIID(—種結合TATA的蛋白質)。表達了全長的蛋白質，以及包含氨基酸151-326的保守結構域。MAL7P1.164(SEQIDNO:21)是分子量為100kDa的推定的適體相關蛋白(adapter-relatedprotein)。該蛋白質表達為兩個結構域第一個結構域包含氨基酸6-529，笫二個結構域包含氨基酸587-842。第一個結構域與銜接蛋白(Adaptin)的N-末端區域具有廣泛的序列同源性。笫二個結構域是親水性的并且含有多個抗原表位。PF14-0113(SEQIDNO:23)是分子量為113kDa的假定蛋白質。基于抗原表面概率，表達了包含氨基酸1-346的結構域。PF11-0118(SEQIDNO:25)是分子量為72.5kDa的j艮定蛋白質，其與轉錄延伸調控劑1，TBP-相關因子基本上同源。基于序列同源性，表達了包含氨基酸92-578的結構域。PF10-0164(SEQIDNO:30)是假定的膜蛋白。表達了包含氨基酸76-130的親水性非膜部分。PF10-0214(SEQIDNO:31)是分子量為168kDa的假定蛋白質。基于抗原表面概率，表達了包含氨基酸415-885的結構域。PF13-0012(SEQIDNO:33)是分子量為26.8kDa的假定蛋白質。該蛋白質從氨基酸84表達，沒有推定的跨膜結構域。PF14-0044(SEQIDNO:34)是分子量為33.5kDa的假定蛋白質。該蛋白質從氨基酸22表達，沒有推定的信號肽。PF14—0050(SEQIDNO:35)是分子量為124kDa的假定蛋白質。該蛋白質表達為兩個結構域第一個結構域包含氨基酸208-512，第二個結構域包含從716至羧基末端的氨基酸。這兩個結構域均是親水性的并且含有多個抗原表位。PFA0200w(SEQIDNO:36)是分子量為19kDa的假定的膜蛋白。這種蛋白質表達為包含氨基酸1-135的親水性非膜部分。PFD0215c(SEQIDNO:39)是分子量為56kDa的pf52蛋白。該蛋白質表達為兩個結構域第一個結構域包含氨基酸181-306,第二個結構域包含氨基酸47-457。第一個結構域與性階段抗原s48/45結構域具有廣泛的序列同源性。第二個結構域沒有疏水性跨膜區并且含有多個抗原表位。PFD0285c(SEQIDNO:40)是分子量為280.9kDa的推定的賴氨酸脫羧酶，其與Lys/Arg脫羧酶的主結構域基本上同源。基于序列同源性，表達了包含氨基酸585-1018的結構域。PFD0430c(SEQIDNO:41)是分子量為94.7kDa的假定蛋白質。基于抗原表位表面概率，表達了從氨基酸230開始至C-末端的結構域。PFE1550w(SEQIDNO:44)是分子量為85kDa的假定的膜蛋白。這種蛋白質表達為包含氨基酸236-683的親水性非膜部分。PFD0800c(SEQIDNO:45)是分子量為20kDa的4艮定蛋白質。在推定的跨膜結構域后于氨基酸26開始表達該蛋白質。PFD0425w(SEQIDNO:48)是分子量為113kDa的假定蛋白質。該蛋白質表達為兩個結構域第一個結構域包含氨基酸23-459，第二個結構域包含氨基酸488-813。第一個結構域與銜接蛋白的N-末端區域具有廣泛的序列同源性。這兩個結構域均是親水性的并且含有多個抗原表位。f.蛋白質的免疫識別就它們被來自免疫的和未免疫的個體的T細胞和血清所識別來分析重組蛋白質，例如如在實施例4中，在Doolan等人，(2003)100(17):9952—7中，和在Sundaresh等人，(2006)"/oZ/7尸or邁a〃cs22(14):1760-6中所描述的。預期用于免疫兔的蛋白質是具有免疫原性的，并且引發識別瘧原蟲肝期的抗體，如實施例l中所描述的，和/或引發T細胞應答，如實施例4中所描述的。以相比于來自未免疫的個體的T細胞和/或血清而言顯著更高的水平與來自免疫的個體的T細胞和/或血清反應的蛋白質被預期是用于癡疾疫苗的好的免疫原。實施例7本實施例描述了編碼肝期癡原蟲多肽的DM疫苗的制備。研發有有前途的方法之一。作為疫苗的DNA由Ulmer等人，(1993)Sc/e/"259:1745-9首先報道，其報道了在注射編碼病毒蛋白質的質粒DNA后誘導了針對流感的保護性免疫。正在評估DM或核酸疫苗針對一系列寄生蟲病(包括瘧疾)的效力。來自在嚙齒動物模型系統中的研究的數據已經提供了下述原理的證據DNA疫苗在誘導針對各種候選疫苗抗原的體液和T細胞應答方面是有效的。特別是，誘導有效的細胞應答通常使DNA疫苗接種相對于亞基蛋白質疫苗接種具有免疫學優勢。已經在許多系統中證明了針對寄生蟲攻擊的保護作用。最近已經使用302種惡性瘧原蟲基因(Aguiar等人(2004)Ge層"es.14(10B):2076-82)、192種約氏痗原蟲子孢子基因(Haddad等人(2004)J/2尸ecL/邊邁M.70(8):4329-35)和~2000種柏氏瘧原蟲全長cDM(Shibui等人(2005)阮c/刀e23(34):4359-66)評價了DNA作為疫苗的用途。材料和方法(改編自Shibui等人，(2005)ra"/ze23(34):4359-66)。將編碼全長基因的cDNA插入表達載體中。根據生產商的說明書，提取質粒DM,進行純化，并以2微克DNA/mg金的加載率在存在亞精胺的情況下用CaCh沉淀至1微米的金顆粒上。將氦基因槍系統用于以這些包被有DNA的金顆粒來接種小鼠。通過三次注射金顆粒來對小鼠進行免疫，每次注射間隔l周。在1周后，用血液期寄生蟲或從受感染的蚊子中剖出的感染性子孢子攻擊經免疫的小鼠。將在此引用的每一篇科學或專利參考文獻通過提及而并入本文。盡管已經舉例說明并描述了本發明的優選實施方案，但應該理解，可以在其中做各種改變而不背離本發明的精神和范圍。權利要求1.分離的多肽，其包含選自SEQIDNO11-44的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。2.免疫原性組合物，其包含分離的多肽和藥學上可接受的載體，其中所述分離的多肽包含選自SEQIDNO:11-44的氨基酸序列及其免疫原性4汁生物。3.分離的核酸分子，其編碼包含選自SEQIDNO:11-44的氨基酸序列及其免疫原性衍生物的多肽。全文摘要本發明提供了分離的肝期瘧原蟲多肽，該多肽包含選自SEQIDNO1-48的氨基酸序列及其免疫原性衍生物。本發明還提供了分離的編碼本發明的肝期瘧原蟲多肽的核酸分子，包含一種或多種本發明的肝期瘧原蟲多肽的組合物，用于誘導針對肝期瘧原蟲多肽的免疫應答的方法，和用于治療和診斷肝期瘧疾的方法。文檔編號C07K14/445GK101321778SQ200680045159公開日2008年12月10日申請日期2006年9月29日優先權日2005年9月30日發明者A·塔倫,I·巴西克,J·W·溫德勒,L·W·伯格曼,P·達菲,S·H·I·卡普,U·克日奇,V·A·馬爾科夫,小D·G·赫普納申請人:西雅圖生物醫學研究所;由沃爾特·里德軍隊研究院軍隊秘書處為代表的美利堅合眾國;費城健康教育公司，D/B/A爵碩大學藥學院"Ducom"