一種利用聚多巴胺生物檢測表面進行抗原檢測的方法及應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學檢測領域，具體地說是一種利用聚多巴胺生物檢測表面進行 抗原檢測的方法及應用。
【背景技術】
[0002] 聚多巴胺（PDA)是一種具有粘附性、親水性及生物相容性的仿生高分子。可以通 過將DA溶解在堿性的水溶液（如10mMtris-HCl緩沖液，pH= 8. 5)中，在有氧的條件下 靜置或者攪拌均可以生成具有粘附性的聚多巴胺（PDA)。
[0003]聚多巴胺具有活性的酚羥基、含氮官能團和雙鍵，對幾乎所有基底均具有粘附性， 可實現對玻璃、纖維、石英等的表面修飾。這種經PDA修飾的表面可以繼續利用聚多巴胺的 反應性進一步反應，從而在在材料表面生成新的功能層。例如，利用與含巰基、氨基等化合 物反應形成單分子層、
[0004] 通過化學鍍形成金屬層以及通過大分子接枝形成生物活性層等。這些新的功能層 可以進一步用于電化學傳感器、細胞成像、藥物包埋釋放等醫學領域。
[0005] 目前聚多巴胺在電化學傳感器和藥物包埋釋放等方面已得到廣泛應用，但是聚多 巴胺在疾病診斷、食品檢測和環境監測中的應用有待進一步研宄，如果將聚多巴胺應用于 生物檢測界面的制備，并進一步應用于醫學、食品和環境檢測，將具有廣闊的開發前景。
[0006]本發明公布了一種利用聚多巴胺生物檢測表面進行抗原檢測的方法。本發明首先 通過多巴胺（DA)的自聚合在基底表面修飾上一層聚多巴胺（PDA)，之后利用聚多巴胺的化 學反應性進一步與抗體發生反應，將抗體修飾在PDA表面，進而通過雙抗夾心法檢測樣品 中抗原的含量，并研宄其在生物醫學、食品、環境等檢測領域的相關應用。
[0007] 該方法制備的新型聚多巴胺生物檢測表面具有很高的應用價值。綜合以上技術和 相關背景，我們所闡述的方法較為新穎，且重現性較好，準確率較高。同時由于聚多巴胺具 有良好的粘附性，幾乎可以修飾所有基底表面，拓展了生物檢測的應用范圍，在生物醫藥、 疾病診斷、食品安全、環境檢測方面具有良好的應用前景。

【發明內容】

[0008]本發明的目的是拓展聚多巴胺在疾病檢測、食品安全、環境監測中的應用，通過制 備新型聚多巴胺生物檢測表面，并將該表面應用于醫學、食品與環境檢測，拓展聚多巴胺的 應用范圍，同時為疾病診斷、食品與環境檢測提供新的思路。
[0009] 本發明的工藝包括以下步驟：
[0010] (1)制備檢測界面：通過多巴胺（DA)的自聚合在基底表面修飾上一層聚多巴胺 (PDA)膠層，將能與待測抗原特異性結合的抗體（一抗）接枝到聚多巴胺（PDA)膠層表面； [0011] (2)接入抗原：將待測樣品中能與上述抗體特異性結合的抗原與抗體結合；
[0012] (3)形成"夾心":加入與待測抗原呈特異反應的酶聯抗體（二抗）；
[0013] (4)加入上述酶的發光底物，通過光學方法測定底物濃度，從而得到樣品中抗原的 含量。
[0014] 所述基底包括孔板、玻璃、纖維、石英和塑料。
[0015] 步驟⑴中聚多巴胺直接與抗體溶液反應過夜制備抗體檢測界面，或，使用戊二 醛作為交聯劑，聚多巴胺先與多官能團化合物反應，再與抗體溶液反應過夜制備抗體檢測 界面。
[0016] 所述多官能團化合物包括多聚甲醛、乙二醛、丙二醛、丁二醛、戊二醛、環氧氯丙 烷、環己烷甲醛和環戊烷羧酸。
[0017] 所述光學方法包括化學發光法、分光光度法如紫外光譜法和熒光光譜法。
[0018] 上述方法用于生物醫學檢測時所述抗原包括血液、尿液、唾液、汗液、體液標本中 降鈣素原（PCT)、甲胎蛋白（AFP)、甲狀腺球蛋白TG、人絨毛膜促性腺激素hCG、胰島素、甲狀 旁腺激素（PTH)、骨鈣素、癌胚抗原、鐵蛋白、糖類抗原、前列腺特異抗原PSA、鱗狀細胞癌抗 原SCCA、組織多態性抗原TPA、促黃體生成激素、雌二醇、睪酮、垂體泌乳素、肌鈣蛋白T、衣 原體、弓形蟲、AB0血型抗原、ABH抗原、人游離前列腺特異性抗原（fPSA)、人總前列腺特異 抗原（tPSA)、過氧化物酶金葡菌A蛋白、狂犬病毒抗原RV-Ag、人淋巴細胞抗原、人組織多肽 抗原（TPA)、人痢疾內阿米巴抗原、單純皰瘆病毒抗原、人糖連抗原724和人新型隱球菌抗 原。
[0019] 上述方法用于食品檢測時所述抗原包括黃曲霉、慶大霉素、卡那霉素、新霉素、沙 門氏菌、軍團菌、大腸桿菌、李斯特菌、副溶血性弧菌、金黃色葡萄球菌、幽門螺桿菌、伏馬 毒素、赭曲毒素、河豚毒素、CP4EPS蛋白、免疫球蛋白、氨芐西林鈉、脫氧雪腐鐮刀菌烯酮和 展青霉素黃曲霉毒素。
[0020] 上述方法用于環境監測時所述抗原包括垃圾焚燒飛灰中的二噁英，土壤中的蘇云 金芽孢桿菌的Bt殺蟲蛋白，土壤中的除草劑毒莠定、莠去津、西瑪津、撲草凈甘草磷和丁草 胺，水環境中的甲氰菊酯，環境中的甲胺磷、氟蟲腈、除蟲脲、甲基對硫磷和毒死蜱。
[0021] 本發明中，多巴胺通過自聚合形成聚多巴胺沉積在基底表面，通過聚多巴胺的化 學反應性與抗體反應形成PDA-抗體檢測界面，通過抗體與抗原的特異性反應接入待測抗 原；加入與待測抗原呈特異反應的酶聯抗體（二抗），形成"雙抗夾心";之后加入酶的發光 底物，發光底物在酶的作用下發生化學反應并釋放大量的能量，產生激發態的中間體。這種 激發態中間體，當其回到穩定的基態時，可同時發射出光子。利用光學方法測定底物濃度， 從而得到樣品中抗原的含量。
[0022] 本發明的創新性和優勢如下：
[0023] 1、將聚多巴胺應用于檢測界面的制備，并應用于生物醫學、食品安全、環境監控等 領域具有創新性，同時拓展了聚多巴胺的應用范圍。
[0024] 2、新型聚多巴胺生物檢測表面的制備方法較為新穎，且重現性較好，準確率較高， 具有很高的應用價值。
[0025]3、由于聚多巴胺具有良好的粘附性，幾乎可以修飾所有基底表面，拓展了生物醫 學檢測的應用范圍。
【附圖說明】
[0026] 圖1是PDA-抗體界面檢測標本中抗原含量示意圖。
[0027] 圖2是PDA膜的制備與表征，其中圖2a為不同反應時間對PDA膜接枝率的影響； 圖2b為不同DA濃度對PDA膜接枝率的影響，圖2c和2d分別為PDA膜的SEM圖和拉曼光 譜圖。
[0028] 圖3是"一步法"（a)和"兩步法"（b)測得的不同濃度PCT抗體的接枝率以及兩 者接枝率的比較（c)。
[0029] 圖4是"一步法"（a)和"兩步法"（b)測得的不同濃度甲胎蛋白抗體的接枝率以 及兩者接枝率的比較（c)。
[0030] 圖5 "一步法"制備的PDA-抗體檢測界面測得的PCT抗原（a)和AFP抗原（b)發 光值隨濃度的變化曲線。
[0031] 圖6是"兩步法"制備的PDA-抗體檢測界面測得的PCT抗原（a)和AFP抗原（b) 發光值隨濃度的變化曲線
[0032] 圖7a是使用"一步法"制備的PDA-抗體檢測界面檢測肉制品中沙門氏菌含量。
[0033] 圖7b是使用"兩步法"制備的PDA-抗體檢測界面檢測土壤中莠去津含量。
【具體實施方式】
[0034] 下面結合實施例對本發明做進一步詳細、完整地說明，但僅是對本發明的示例性 說明，而非對本發明范圍的限制。
[0035] 實施例1 :PDA膜的制備與表征
[0036] 選取5mg/mLDA溶液，測定不同反應時間對聚多巴胺接入量的影響，結果如圖 2(a)所示。由圖可知，隨著反應時間的增加，基底的吸光度增加，PDA接入量增大；當DA含 量為5mg/mL時，反應4h和6h后吸光度變化不大，故可選取4小時作為最佳PDA反