專利名稱：乙肝病毒表面抗原的逃逸突變蛋白的制作方法
技術領域：
本發明涉及乙肝病毒表面抗原的逃逸突變蛋白。
乙肝(HBV)病毒感染患者的血清中一般有三種不同的含乙肝表面抗原(HBsAg)的結構Dane氏顆粒、小球形顆粒和桿狀顆粒。Dane氏顆粒是外徑42納米的圓球含直徑28納米的內核。小球形顆粒的直徑約為22納米。桿狀顆粒直徑約22納米長約50至230納米。
這些粒子含有被稱為主要蛋白、中等蛋白和大蛋白的三種糖蛋白。HBV-DNA的乙肝表面抗原的開放閱讀框架分成三個區域pre-S1、pre-S2和S。該開放閱讀框架編碼主要蛋白、中等蛋白和大蛋白。主要蛋白的完整氨基酸序列可參見Valenzuela等Nature,280:815-819(1979)。Valenzuela等所述的氨基酸序列長226個氨基酸，本發明涉及的氨基酸位置參照了他們公開的氨基酸序列。HBsAg含有數個抗原決定基，其中最重要的是a決定基，d/y決定基和w/r決定基。
近來，乙肝疫苗已被廣泛用于人體。一種典型的疫苗，例如Merck的RECOMBIVAX HB疫苗含有酵母重組生產的adw亞型HBsAg。當人群被免疫后，病毒被迫圍繞疫苗發生演變。因對疫苗產生應答反應而發生演化的突變株稱為“逃逸突變株”(escape mutant)。目前的疫苗也許不能有效地對付這類逃逸突變株。而且，目前有些免疫診斷試驗可能測不出這類逃逸突變株。
某些逃逸突變株已有報道。Carman等在Lancet,336:325-329(1990)中報告了145位甘氨酸變為精氨酸的突變。WO 95/21189也報告了在122位氨基酸后插入附加氨基酸的突變。McMahon等，Hepatology 15(5):757-766(1992)還報道了其它突變株。此外，已開展了人工突變蛋白的研究，例子見Mangold等，Virology,211:535-543(1995)。Mangold等在121、124、137、139、147和149位進行了各種突變研究。
本發明提供了分離的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段和含有這些蛋白的顆粒。這些突變蛋白、片段和顆粒可用來改進疫苗，這些突變蛋白、片段和顆粒以及與它們特異性結合的試劑可用來改進免疫試驗。
本發明提供一種分離的突變乙肝表面抗原蛋白，它包含感染人的乙肝病毒表面抗原蛋白的一段氨基酸序列，其中第121位氨基酸不是半胱氨酸，而且第120、122、123、147或149位氨基酸至少有一個不是所述位置的保守氨基酸。本發明還提供了一種分離的突變乙肝表面抗原蛋白，它包含一段感染人的乙肝病毒表面抗原蛋白的氨基酸序列，其中第122位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
本發明還提供一種疫苗，它在藥學上可接受的載體中包含了免疫原性量的突變乙肝表面抗原蛋白，其片段或含有所述蛋白的顆粒。本發明還提供能特異性識別突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含有所述蛋白顆粒的特異性結合試劑。
本發明還提供一種檢測樣品中有無突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的方法，它包括a)在適宜產生結合的條件下，使樣品與特異性識別本發明突變表面抗原蛋白的特異性結合劑接觸；b)測定特異性結合劑結合的程度，該程度與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的存在、或含量相關；由此確定樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的存在、或含量。本發明還提供標定樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒含量的方法，以及測定特異性結合劑與突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒結合親和力的方法。
本發明提供一種檢測樣品中編碼突變乙肝表面抗原蛋白核酸序列的方法；包括a)提供一份懷疑含有編碼本發明突變乙肝表面抗原蛋白核酸序列的樣品；b)檢測編碼突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列。
以下說明書將清楚地闡明本發明的其它特征和優越性。本發明的目的和其它優越性，是通過分離的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段和含所述蛋白的顆粒、它們的特異性結合劑，以及利用這些蛋白、其片段和含所述蛋白的顆粒、和/或特異性結合劑的免疫試驗和疫苗來實現和達到，這些都將在本文的描述中、權利要求和附圖中給以具體的說明。上面的簡要概述和下面的詳細說明都應該理解成是舉例性和說明性，是為了進一步說明權利要求。
圖1是CTS突變乙肝表面抗原蛋白的部分氨基酸序列。
圖2是CTS突變乙肝表面抗原蛋白的部分氨基酸序列與某些其它HBV亞型的比較。
圖3是CTS突變乙肝表面抗原蛋白的部分氨基酸序列與某些其它HBV亞型的比較。
圖4和圖5是突變HBsAg-CTS和20種乙肝病毒亞型的系統發育亞型分組和距離。
圖6是表8數據的圖表形式，以中和百分比為抗體強度對抗原濃度之比的函數繪制。
圖7是表9數據的圖表形式，以中和百分比為抗體強度對抗原濃度之比的函數繪制。
圖8是表10數據的圖表形式，以中和百分比為抗體強度對抗原濃度之比的函數繪制。
在圖6至圖8中，實線和方塊代表對天然HBsAg的抗體應答，虛線和菱形代表對突變HBsAg的抗體應答。
本發明提供了一種分離的突變乙肝表面抗原蛋白，它包含感染人的乙肝病毒表面抗原蛋白的一段氨基酸序列，其中第121位氨基酸不是半胱氨酸，而且第120、122、123、147或149位氨基酸至少有一個不是所述位置的保守氨基酸。在一個實施方案中，分離的突變乙肝表面抗原表現出不同于野生型乙肝表面抗原蛋白的抗原性。在另一個實施方案中，第120、122或123位氨基酸中至少有一個不是該位置的保守氨基酸；在另一實施方案中，第147或149位氨基酸至少有一個不是該位置的保守氨基酸在本發明一個實施方案中，第120、122、123、147或149位氨基酸中至少兩個不是各自位置的保守氨基酸。在另一實施方案中，第120、122、123、147或149位氨基酸中至少3個、4個或這5個都不是各自位置的保守氨基酸。
在其它實施方案中，121位的保守半胱氨酸被酪氨酸取代；120位的保守脯氨酸被丙氨酸取代；122位的保守賴氨酸或精氨酸被谷胺酰胺取代；123位的保守蘇氨酸被脯氨酸取代。在實施方案之一中，120位的保守脯氨酸被丙氨酸取代，122位的保守賴氨酸或精氨酸被谷胺酰胺取代，123位的保守蘇氨酸被脯氨酸取代。
在另一實施方案中，第127位的氨基酸不是該位置的保守氨基酸；較好的是，第127位的保守脯氨酸被異亮氨酸取代。在另一實施方案中，第117位的氨基酸不是該位置的保守氨基酸；較好的是，第117位的保守絲氨酸被精氨酸取代。在另一實施方案中，第96位的氨基酸不是其保守氨基酸；原第96位的纈氨酸以被丙氨酸取代為佳。在另一實施方案中，第113位的氨基酸不是其保守氨基酸，此位上的保守蘇氨酸以被亮氨酸取代為佳。
在另一實施方案中，第133位的氨基酸不是該位置的保守氨基酸，該位置原來的保守甲硫氨酸以被蘇氨酸取代為佳。在另一實施方案中，第140位上不是保守氨基酸，該位置的保守蘇氨酸以被異亮氨酸取代為佳。在另一實施方案中，第147位上不是其保守氨基酸，該位置的保守半胱氨酸以被酪氨酸取代為佳。在另一實施方案中，第149位上不是原有的保守氨基酸，該位置的保守半胱氨酸以被酪氨酸取代為佳。
在另一實施方案中，第147和第149位上不是各自原來的保守氨基酸。在另一實施方案中，第121、147和149位上的保守半胱氨酸均被酪氨酸取代。在另一實施方案中，第145位上是保守的甘氨酸。在另一實施方案中，第137、138和139位上都是保守半胱氨酸。在另一實施方案中，第124位上是保守的半胱氨酸。
本發明提供了一種分離的突變乙肝表面抗原蛋白，它包含感染人的乙肝病毒表面抗原蛋白的氨基酸序列，其中第122位上不是該位置的保守氨基酸。在另一實施方案中，分離的突變乙肝表面抗原蛋白表現出不同于野生型乙肝表面抗原蛋白的抗原性。在另一實施方案中，第122位的保守賴氨酸或精氨酸被谷胺酰胺取代。
在本發明的實施方案中，分離的突變乙肝表面抗原蛋白是乙肝表面抗原的主要蛋白、乙肝表面抗原中等蛋白和乙肝表面抗原大蛋白。在本發明另一實施方案中，蛋白質包含一段前S(pre-S)序列。在本發明其它實施方案中，此蛋白質包含部分或完整的前S1序列，或部分或完整的前S2序列。
在本發明的一個實施方案中，分離的突變乙肝表面抗原蛋白包含以下氨基酸序列，其第117位至第123位為Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro(SEQ ID NO:28)。在另一實施方案中，分離的乙肝表面抗原蛋白包含第113位至第133位如下的氨基酸序列Leu-Ser-Thr-Ile-Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro-Cys-Thr-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO:29)。在另一實施方案中，分離的乙肝表面抗原蛋白包含第140至147位如下的氨基酸序列Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQ ID NO:30)。在另一實施方案中，分離的乙肝表面抗原蛋白包含如下第117至123位氨基酸序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro(SEQ ID NO:28)和如下第140至147位氨基酸序列Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQIDNO:30)。在另一實施方案中，分離的乙肝表面抗原蛋白包含如下第117至149位氨基酸序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro-Cys-Thr-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Thr-Ser-Thr-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQ IDNO:31)。在另一實施方案中，分離的乙肝表面抗原蛋白包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列(見后文)。
本發明提供一種分離的突變乙肝顆粒，它包含本發明的乙肝表面抗原蛋白。本發明還提供本發明分離的突變乙肝表面抗原蛋白的片段。在本申請應用中，突變乙肝表面抗原蛋白的“片段”指，該片段含有至少30個氨基酸，其中包括120至149位的氨基酸序列。優選的片段之一是突變乙肝表面抗原蛋白的分離片段，該分離片段含有一段至少30個氨基酸的序列，該序列包括第120至149位的氨基酸，其中第121位上不是半胱氨酸，而且第120、122、123、147或149位上至少有一個不是原來位置上的保守氨基酸。另一種優選片段是突變乙肝表面抗原蛋白的分離片段，該分離片段含有一段至少30個氨基酸的序列，該序列包括第120至149位的氨基酸，其中第122位上不是原來位置的保守氨基酸。
本發明還提供包括本發明突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的組合物，而且基本上是無血的組合物。
本發明提供一種疫苗，它在藥學上可接受的載體中，包含免疫原性量的本發明突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。
本發明提供一種特異性結合劑，該試劑特異性地識別本發明的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒，其中的特異性結合劑是特異性針對突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的。在一個實施方案中，特異性結合劑基本上不結合具有任何以下表型的天然HBV:ayw,ayr,adr，或adw。在另一實施方案中，特異性結合劑基本上結合所有具有任何以下表型的天然HBV:ayw,ayr,adr，或adw。在實施方案之一中，特異性結合劑識別序列性表位；在另一實施方案中，特異性結合劑識別構象性表位。所述特異性結合劑可以是單克隆抗體、單克隆抗體片段或多克隆抗體。
本發明提供一種分泌本發明單克隆抗體的雜交瘤。
本發明提供一種對照樣品，其中含有已知量的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。
本發明提供一種檢測樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白的顆粒的方法，它包括(a)在適合產生結合的條件下使樣品與特異性結合劑接觸，該試劑特異性地識別本發明突變乙肝表面抗原蛋白；(b)測定特異性結合劑的結合程度，該結合程度與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白的顆粒的存在或含量相關；由此確定樣品中有無突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白的顆粒，或其含量。在一個實施方案中，利用含有已知量的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的對照樣品，確定結合程度與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白的顆粒的存在、或含量之間的關系。在另一實施方案中，特異性結合劑是特異性針對突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白的顆粒的。在另一實施方案中，所述方法包括非競爭性試驗。在另一實施方案中，此試驗包括具有標記的第二特異性結合劑；此標記可以是放射性標記、酶標記、熒光標記、化學發光標記、生物發光標記或落射熒光(epifluorescent)標記。在另一實施方案中，所述方法包括凝集試驗；在另一實施方案中，還包括競爭性試驗。所述方法可以包括利用能與突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白的顆粒發生交叉反應的標記物。樣品可以是血液樣品或疫苗。
本發明提供測試突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的標定方法，包括(a)提供含有已知量本發明突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的兩份或多份對照樣品；(b)測試各份對照樣品，記錄各份對照樣品產生的信號；(c)制作與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的含量相關的標定曲線。
本發明提供一種測試特異性結合劑結合親和力的方法，包括(a)提供含有已知量本發明突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的對照樣品；(b)在適合產生結合的條件下，將對照樣品與特異性結合劑接觸；(c)測定特異性結合劑的結合程度；由此確定特異性結合劑與突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的結合親和力。在一個實施方案中，將結合親和力與預先測定的最低結合親和力相比較。在另一實施方案中，此種比較是生產診斷用免疫試劑盒質量控制過程的一部分。在一個優選實施方案中，特異性結合劑是單克隆抗體或單克隆抗體片段。
本發明提供一種診斷用免疫試劑盒，包括本發明的特異性結合劑。本發明還提供一種包括本發明對照樣品的診斷用免疫試劑盒。
本發明提供利用重組法生產的本發明突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。在實施方案之一中，所述蛋白、顆粒或片段是利用重組法在酵母、桿菌或哺乳動物細胞中生產的。
本發明提供分離的DNA，它編碼本發明的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。在一個實施方案中，此分離的DNA包括一段編碼SEQ IDNO:2氨基酸序列的序列。在另一實施方案中，此分離的DNA包括一段編碼以下氨基酸序列的序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro-Cys-Thr-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Thr-Ser-Thr-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQ ID NO:31)。
本發明提供一種載體，它包括編碼本發明突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的DNA。
本發明提供一種檢測樣品中突變乙肝表面抗原蛋白編碼核酸序列的方法，包括(a)提供懷疑含有本發明突變乙肝表面抗原蛋白編碼核酸的樣品；(b)檢測編碼突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列。在優選實施方案中，在檢測步驟(b)之前，至少部分此核酸序列被擴增。在另一實施方案中，檢測步驟按如下進行，擴增后的核酸與核苷酸探針的至少一部分雜交，該探針含有與擴增的突變乙肝核酸互補的核苷酸序列；并檢測此探針。在另一實施方案中，探針是標記過的。在另一實施方案中，雜交后的探針與擴增的核酸形成的復合物是利用對雙鏈DNA特異性結合劑檢測的；該特異性結合劑最好是單克隆抗體或單克隆抗體片段。在另一個實施方案中，檢測步驟是按核苷酸序列長度來分離擴增后的核酸，并檢測與擴增后乙肝核酸對應的核苷酸序列。
本發明提供的核酸探針所含核苷酸序列選自以下序列有義探針#1(從nt491至nt526)5′-GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA CCC-3′(SEQ ID NO:34)；反義探針#2(從nt526至nt491):5′-GGG TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′(SEQ ID NO:35)；有義探針#3(從nt500至nt523):5′-ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA-3′(SEQ ID NO:36)；反義探針#4(從nt523至nt500):5′-TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT-3′(SEQ ID NO:37)；有義探針#5(從nt488至nt511):5′-CCA GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG-3′(SEQ ID NO:38)；反義探針#6(從nt514至nt491):5′-TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′(SEQ ID NO:39)；有義探針#7(從nt515至nt538):5′-GCA TAC CAA CCC TGC ACG ACT ATT G-3′(SEQ ID NO:40)；反義探針#8(從nt538至nt515):5′-C AAT AGT CGT GCA GGG TTG GTA TGC-3′(SEQ ID NO:41)；有義探針#9(從nt573至nt605):5′-GT ATC AAA CCT TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′(SEQID NO:42)；有義探針#10(從nt584至nt605):5′-TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′(SEQ ID NO:43)；反義探針#11(從nt616至nt595):5′-TGG GAIGGG AAIATA GGIGTA A-3′(SEQ ID NO:44)；或者核苷酸序列和雜交活性與上述核苷酸序列中任一條基本相同的核苷酸序列。在優選實施方案之一中，此探針僅由上述序列之一構成。在優選實施方案之一中，這些探針被用在本發明的方法和試劑盒中。所述探針還可以進一步包含可測標記。用于這些探針的合適引物對該領域技術人員來說是眾所周知的。
本發明提供了檢測編碼本發明突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列的試劑盒，包括至少一種試劑，它含有核苷酸引物，該引物能夠與乙肝表面抗質特有的核酸退火并引發其擴增；和至少一種試劑，它含有能夠與擴增的突變乙肝表面抗原核酸雜交的核酸探針。
對乙肝表面抗原DNA進行了克隆和測序，所述DNA取自(稱為CTS)腎移植患者的血清樣品，該患者EIT-MAK-3試驗(Sorin Diagnostics,Saluggia)乙肝表面抗原(HBsAg)呈陽性，AXSYM-HBsAg試驗(AbboR Laboratories)卻呈陰性。AbboRtt試驗沒有測出稱為CTS的乙肝表面抗原是因為乙肝病毒的突變。使用提供假陰性指示的試驗，可能導致延誤對感染突變株患者的有效治療，或者使得突變的HBV由供血者傳遞給受血者。
當該克隆的核苷酸序列被翻譯后，其產物呈現出大量的突變，這些突變被認為決定了抗原二級和三級結構的差異。這些突變還決定該蛋白質的抗原性差異。
突變HBsAg-CTS與天然ayw亞型的HBsAg最為同源。此相對同源性提示HBsAg-CTS是由ayw亞型演變而來。盡管相似，HBsAg-CTS所具有的某些特征揭示它從系統發育上說明顯不屬于ayw亞型。具體地說，d/y決定基根據第122位上有堿性氨基酸(Arg(R)或Lys(K))來鑒定的d/y決定基在HBsAg-CTS中沒有。取而代之的是，突變HBsAg-CTS在該位置上是谷胺酰胺(Gln(Q))。但是值得注意的是，w/r決定基被保留，因為第160位的殘基是賴氨酸(Lys(K))。w/r決定基是根據第160位存在堿性氨基酸(Arg(R)或Lys(K))來鑒定的。
還可以發現其它的明顯差別。例如，在HBsAg-CTS中，一般為半胱氨酸(Cys(c))的第121、147和149位殘基被酪氨酸(Tyr(T))取代。值得注意的是，第121、147和149位被認為在該蛋白質的有關部分，HBsAg的a決定基折疊成由二硫鍵穩定的雙環結構來說是十分重要的。這種穩定的雙環結構是a決定基的特征之一，并被認為影響著抗原的抗原性。更重要的是，HBsAg的a決定基上的穩定雙環結構，提供了宿主對此產生抗體的免疫優勢表位。因為乙肝病毒突變株的免疫優勢表位構象異常，就可能逃過常規試驗方法的檢測。
應指出，即使缺失雙環免疫優勢表位，仍可能得到產生構象性表位與突變HBsAg結合的抗體。而且，抗體可能通過序列性表位與突變HBsAg結合。同樣，與突變HBsAg具有親和性的單克隆抗體可用來制造能夠檢測和定量乙肝病毒突變株的試劑，并用于能對乙肝病毒突變株產生免疫應答的疫苗中。
HBsAg-CTS包括附加突變。通過將HBsAg-CTS的氨基酸序列與不同乙肝病毒亞型的氨基酸序列排除分析，在各種亞型中通常具有良好保守性的位置出現了8處突變。這些附加突變(位于96,113,117,120,123,127,133,140,147，和149位)見表1，其中的保守氨基酸一般可在各種亞型的特定位置找到，而其取代氨基酸可在HBsAg-CTS的那些位置找到。
表1
編碼突變HBsAg-CTS的DNA包含以下276個核苷酸的序列TGTCTGCGGCGTTTTATCATCTTCCTCTTCATCCTGCTGCTATGCCTCATCTTCTTGTTGGCTCTTCTGGACTATCAAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCTAATTCCAGGACTCTCGACCATCCGCACGGGAGCATACCAACCCTGCACGACTATTGCTCAAGGAACCTCTACGTATCCCTCCTGTTGCTGTATCAAACCTTCGGACGGAAATTACACCTATATTCCCATCCCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAAYYCCTATGGGAGTGGGCCTCA(SEQ ID NO:1)該276個核苷酸的序列編碼以下92個氨基酸的序列Cys Leu Arg Arg PheIle Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu15 10Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Asp Tyr Gln15 20 25Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Leu Ser30 35Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile40 45 50Ala Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Ile55 60 65Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro70 75Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala80 85 90Ser(SEQ ID NO:2)在SEQ ID NO:2中，氨基酸的位置從“1”開始順序編號。要將上述位置轉換成HBsAg基因組的標準位置，需于每一位置加“75”。這種轉換對于SEQ ID NO:2至6來說是必須的。要將SEQ ID NO:7至27中的位置轉換成HBsAg基因組的標準位置，需于每一位置加“33”。在圖1中，SEQ ID NO:2用氨基酸的單字母符號表示。核苷酸序列(SEQ ID NO:1)和氨基酸序列(SEQ ID NO:2)都只是完整序列的一部分；DNA編碼HBsAg的主要蛋白具有總共226個氨基酸。
上述92氨基酸序列(SEQ ID NO:2)與HBsAg的不同亞型(ayw3,adr,adw2和ayw)排除對齊，HBsAg-CTS的突變是顯而易見的。所述不同亞型的部分序列在所附的序列表中給出。(SEQ ID NO:3來自HBVAYW3,SEQ ID NO:4來自HBVADR,SEQ ID NO:5來自HBVADRW2,SEQ ID NO:6來自HBVAYW)。為了方便比較，在圖2中用氨基酸的單字母符號將這些序列與SEQ ID NO:2進行了比較。在對齊時，突變氨基酸以粗體和下劃線表示。
利用長度為154個氨基酸的氨基酸序列將上述比較擴大到各亞型的許多種。在這些分析中，HBsAg-CTS與HBsAg4個亞型的20種進行了比較。所附的序列表中給出了這些不同亞型的部分序列。SEQ ID NO:7來自7AYWS,SEQ IDNO:8來自6AYWS,SEQ ID NO:9來自3AYWS,SEQ ID NO:10來自2AYWS,SEQID NO:11來自1AYWS,SEQ ID NO:12來自1ADYWS,SEQ ID NO:13來自5AYWS,SEQ ID NO:14來自5ADWS HBVAYW,SEQ ID NO:15來自2ADWS,SEQ IDNO:16來自3ADWMUT,SEQ ID NO:17來自2ADWMUT,SEQ ID NO:18來自1ADWS,SEQ ID NO:19來自4ADWMUT,SEQ ID NO:20來自3ADWS,SEQ IDNO:21來自1ADWMUT,SEQ ID NO:22來自4ADRS,SEQ ID NO:23來自1ADRS,SEQ ID NO:24來自3ADRS,SEQ ID NO:25來自2ADRS,SEQ ID NO:26來自4ADWS,SEQ ID NO:27來自CTS。
為了方便比較，在圖3中用氨基酸的單字母符號將這些序列與SEQ ID NO:2進行了比較。在對齊時，突變氨基酸以粗體和下劃線表示。符號“*”表示隊列中的該位置在突變體中完全保守，符號“.”表示隊列中的該位置在突變體中比較保守。
在這些154氨基酸序列中，突變HBsAg-CTS有100個氨基酸(64.9％)與其它20種亞型相應位置的氨基酸是相同的(“完全保守”)，有32個氨基酸(20.8％)與其它20種亞型相應位置的氨基酸相似(“比較保守”)。
表2表示了本發明分離株與其它亞型之間的氨基酸同源性。用PC/GENE軟件包中的CLUSTAL程序(IntelliGenetics,Mountain View,Califomia)分析了核苷酸序列和推導氨基酸序列；對齊時使用的序列下載自GenBank數據庫(登錄號J02203,X59795,X65257,X77310,X77308,X65258,J02202,D00329,D00330,X51970,X69798,M54923,S81945,S81946,D16665,X01587,S50225,D23677,D23678，和Z72478)。
表2
使用直接得自Dr.J.Felsenstein,Department of Genetics,University ofWashington,Seattle的PHYLIP包(系統發育參考包)1993年3.5c版，進行系統發育分析，將HBsAg-CTS的154氨基酸序列(SEQ ID NO:27)與20種亞型的同等大小的片段(SEQ ID NO:7-26)進行了比較。用PHYLIP包中的SEQBOOT程序進行bootstrap分析，獲得了這些不同亞型的集落，為了消除可能對各系統發育性集落產生非特異性影響的某些因素，對數據重復取樣250次。圖4和圖5顯示了系統發育分析的結果。在尋找確定相關亞型的圖4中，可以看見HBsAg-CTS突變株是HBsAg ayw亞型的一員。然而在圖5中，HBsAg-CTS與HBsAg ayw亞型的系統發育距離十分明顯。在圖5中，分枝的長度與系統發育的長度成正比。
表3給出了HBsAg-CTS與不同HBsAg亞型之間，以及不同HBsAg亞型相互之間的系統發育距離。
表3<
表2、表3、圖4和圖5的數據揭示，HBsAg-CTS演變自ayw亞型；但是它與ayw亞型的系統發育距離與各種亞型之間的距離相當。此外，HBsAg-CTS與ayw亞型中其它成員的系統發育距離，比各亞型彼此之間的系統發育距離(＜0.04)大得多(0.097-0.119)。
根據REAC801確認試驗(FDA證書號89-0376)中所述的方法進行中和試驗，已將HBsAg-CTS確認為逃逸突變株。使用了3種中和溶液(a)抗HBsAg陽性人血漿(用在被稱為REAC801的試劑盒中，自然感染，得自Sorin Diagnostics,Saluggia,Italy),(b)抗HBsAg陽性人IgG(Biagini血清，用于被動預防的自然感染材料，得自Farma Biagini S.p.A.)和(c)ENGERIX-B疫苗接種后的獻血者的人血清，得自SmithKline Beecham。
使用一種得到美國食品和藥物管理委員會認可的方法，其中，當發生30％以上的中和時，認為樣品被中和，由此確認為HBsAg陽性。當然，應指出，30％是一個相對值，它可能受到中和抗體強度和樣品中抗原濃度的影響。不同抗原和抗體之間的相對比較是通過在不同濃度中和抗體的標準化而實現的。濃度以毫國際單位(mIU)表示。雖然標準化抗原濃度更難，但已將天然HBsAg亞型ad的濃度大致定量在1.3PEI U/ml(PEI是Paul Erlich Institut,Germany的縮寫)，將突變株(CTS)大致定量在0.5PEI U/ml。在此條件下，估計抗體對突變株的抑制程度將遠高于對天然毒株。因為這個濃度是正確的與天然抗原相比，突變抗原的抗體與抗原之比高得多。所以，因為中和突變抗原比中和天然抗原慢，該結果清楚地表明，應該在疫苗和診斷用試劑中引入突變蛋白。
中和試驗的結果見下文。在各試驗中，HBsAg檢測是使用ETI-MAK-2PLUS，批號PP885試劑盒(得自Sorin Diagnostics,Saluggia,Italy)進行的；該試劑盒包含REAC801 Sol.A.結果見表4
表4中的結果顯示，在中和試驗(REAC801的Sol.A.)中使用HBsAg陰性人血清對被測樣品獲得的數值，這是為了以非抑制形式確定HBsAg陽性樣品的基線，以便計算中和百分比。
表5至表7顯示了對三種樣品溶液的中和試驗結果。
表5REAC801(人血漿抗HBs+)<
表6hIgG抗HBs(Biagini血清)<
<p>表7免疫血清(ENGERIX-B )
最后，表8至表10顯示抗體強度(Ab，以mIU/mL表示)與抗原濃度(Ag，以PEI U/mL)之比。
表8REAC801(人血漿抗HBs+)
表9hIgG抗HBs(Biagini血清)
表10免疫血清(ENGERIX-B)
還對表8至10中的數據進行了制圖，分別繪制在圖6至圖8中。表8至10和圖6至8中的數據證明HBsAg-CTS是逃逸突變株。
如前文所指出的，在ETI-MAK-3試驗中檢測到HBsAg-CTS，但是在AXSYM-HBsAg試驗中檢測不到它。這一結果提示，AXSYM-HBsAg試驗依賴于免疫優勢表位“a”的存在，而a在HBsAg-CTS中發生構象突變。相反，ETI-MAK-3試驗對天然或突變構象的免疫優勢表位“a”都能檢測到。應注意的是，在免疫試驗中的“檢測”和“測定”意指測定目標在樣品中是否存在、或測定其含量兩者或其一。
ETI-MAK-3試驗提供了直接、非競爭性夾心試驗(利用酶聯免疫吸附(ELISA)技術)來定性測定HBsAg。簡而言之，將具有與HBsAg有親和性的單克隆抗體與微滴孔壁之類表面結合。讓抗體與可能含有或不含HBsAg的樣品接觸。如果樣品中有HBsAg，它會與抗體結合形成抗體/HBsAg復合物。然后將表面與酶示蹤劑接觸，后者會與抗體/HBsAg復合物結合。通過檢測結合示蹤劑的水平，就能夠確定樣品中HBsAg的水平。一個優選的示蹤劑是結合了辣根過氧化物酶的綿羊抗HBsAg抗體。
市售的測試系統通常包括確定特殊生物物質存在所必需的各種試劑。例如，ETI-MAK-3試驗包括微滴板，板上的孔包被以與HBsAg有親和性的單克隆抗體，酶示蹤劑，陽性和陰性對照溶液，示蹤劑稀釋液，洗滌緩沖液，顯色溶液，底物溶液和封閉劑。最后的三種試劑是用來適當產生可測信號的，此信號反映樣品中示蹤劑(由其顯示抗原)的存在與水平。
本發明特別適用于制造乙肝病毒免疫試劑盒，因為即使在缺乏天然構象的免疫優勢表位時，用它可確保試劑盒中的單克隆抗體保持其與HBsAg的親和性。具體地說，突變乙肝病毒可能在依靠檢測HBsAg天然構象的免疫優勢表位(a)的試驗中被漏檢。這樣，突變株的檢測需要使用結合突變抗原的抗體。為了確保免疫試劑盒中所用的抗體能夠檢測出突變的乙肝病毒，測試系統的制造過程要求所用的抗體保持它們對突變抗原的親和性。在制造中，可以如下做到這點，讓抗體試樣接觸已標定標準量的突變抗原，然后檢測該抗原的存在與水平。如果試驗結果準確，此抗體就可用在試劑盒中。如果結果不準確，則需用符合免疫試驗要求的另一抗體代替之。這樣做，可以確保市售的免疫試劑盒能夠測出樣品中HBsAg的存在與水平，即使HBsAg是沒有免疫優勢表位的突變變異體。
突變HBsAg還可能在免疫試劑盒中作為陽性對照試劑提供。此陽性對照通常含有經熱滅活和保存處理的HBsAg。例如，ETI-MAK-3試驗的陽性對照是2.5mL再鈣化人血漿，含有熱滅活保存的HBsAg(ad和ay亞型)最高濃度為0.4-1U/mL。
當然，顯然本發明不想被局限于一種特定的診斷試驗或試劑盒，而意向包括實施所述試驗的多種診斷試驗和試劑盒。試驗可能包括但不限于以競爭、直接反應或夾心型試驗為基礎的那些試驗，可用固相，或者可用免疫沉淀或其它任何不用固相的方法進行。
試驗可以是各種形式的。有些依賴于使用標記的特異性結合分子例如抗體，而有些則通過觀察生成的沉淀來檢測抗體(或其它特異性結合劑)與抗原的相互反應。不依賴于標記抗體的定性和定量試驗的例子如凝膠沉淀、單向免疫擴散、免疫電泳(包括火箭電泳和雙向電泳)和利用人射光散射的定量試驗(濁度法)。優選的是凝集測試；美國專利5,286,452(Hansen)和5,589,401(Hansen等)中有凝集試驗的實例。
經常使用某種方式的標記來檢測抗原-抗體相互反應。標記可以是放射性的或非放射性的。根據測試方式，或者標記本發明的特異性結合劑，或者標記與它們結合的其它特異性結合劑。可用免疫試驗(包括放射性免疫試驗)和免疫標定(immunometric)試驗(包括免疫標定放射性試驗和酶聯免疫吸附試驗)，也可用免疫印跡技術、還可以考慮使用化學發光、熒光、酶、生物發光和落射熒光標記。也可以考慮使用Abbott Laboratories,Chicago,Illinois,USA出售的那種類型的IMX試驗。
也可以測試突變乙肝核酸。在這類方法中，使用核酸探針來檢測編碼突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列。聚合酶鏈反應之類的擴增方法可以與核酸探針合用。一種優選的測試突變乙肝核酸的方法使用了一種被稱為DNA酶免疫試驗(DEIA)的方法，其中，探針與單鏈DNA雜交，用能夠區別單鏈和雙鏈DNA的單克隆抗體來檢測探針-DNA雜交復合物。DEIA試驗可參見Mantero等，Clin.Chem.,37/3:422-429(1991)。
除用于診斷試驗外，本發明的逃逸突變HBsAg還可以用在乙肝病毒疫苗中。具體地說，疫苗可以在藥學上可接受的載體中含有免疫原性量的本發明逃逸突變株。疫苗的免疫原性量可用該領域一般技術人員眾所周知的方法來測定。藥學上可接受的載體可以包括鹽水或其它合適的載體，并可以另含有各種添加劑、佐劑等。此外，疫苗可以含有其它HBV抗源，例如正常HBsAg或含有完整或部分pre-S1或pre-S2多肽的復合HBsAg顆粒。
擴增程序HBV的“S”基因總長為657個核苷酸(從HBV基因組的單一EcoR Ⅰ位點數起的第157至第837位核苷酸)；該基因編碼了稱為HBsAg的219個氨基酸的蛋白質。擴增反應使用了兩段引物，所述的引物的目標在第157至837位核苷酸的范圍之內。用下述引物進行45輪循環的擴增有義引物“a4”5′-CTC GTG GTG GAC TTC TCT CAA TTT-3′(SEQID NO:32)(核苷酸255-278)；反義引物“a5”5′-GGA AAG CCC TAC GAA CCA CTG-3′(SEQ ID NO:33)(核苷酸717-697)。
擴增得到的“S”基因片段總長463核苷酸，編碼一段154個氨基酸的多肽(包括HBsAg的第34到187位氨基酸殘基)。
反應混合物的組成為Tris HCl pH=8.8(67mM),(NH4)2SO4(1.6mM),MgCl2(2mM),2-巰基乙醇(10mM),100ug/mL牛血清白蛋白，三磷酸脫氧核糖核酸(dNTPs)(各200mM),2.5U Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer)和50pmol的各個引物。
擴增前，取一份血清樣品沸煮5分鐘，然后14000rpm(4℃)離心15分鐘；回收上清液，用5微升處理過的樣品在50微升的總體積中進行擴增。
總共45輪擴增，每輪包括94℃變性1分鐘，64℃退火1分鐘和72℃延伸1分鐘；為了提高克隆效率，最后一輪的延伸時間為10分鐘，擴增反應用PerkinElmer熱循環儀進行。
463bp的擴增產物用Oiaex樹脂(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)在瓊脂糖凝膠上純化后，克隆到pCR2.1載體(Invitrogen,San Diego,California)中，轉化到XL-1藍色大腸桿菌株中，然后在菌落中篩選出陽性克隆。
挑選了4個克隆進行測序，結果完全相同。
更具體地說，將克隆在加有氨芐青霉素的LB肉湯培養基中于37℃培養過夜；第二天，用QlAwell系統(Qiagen GmbH,Hilden,Germany)從5ml液體培養物中純化質粒DNA。
用A.L.F.自動DNA測序儀和Autoread測序試劑盒(Pharmacia Biotech,Uppsala,Sweden)測序如此制備的DNA模板(必須不含蛋白質、染色體DNA和有機溶劑)。
該系統使用了非放射化學方法來測序，其中，一段5’端熒光標記的引物退火與模板結合。
使用標準雙脫氧測序法，用T7 DNA聚合酶在4次分開的反應中延伸熒光引物，然后上樣在聚丙烯酰胺凝膠上。
以上描述和附圖是為了說明本發明的實施方式，決不是限定本發明的范圍。對本領域技術人員來說顯而易見的是，在本發明的宗旨和范圍內，可以對分離的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段和含所述蛋白的顆粒、它們的特異性結合劑、以及使用所述蛋白、其片段和含所述蛋白的顆粒和/或特異性結合劑的免疫測試和疫苗進行各多種修飾和變化。所以，本發明意向覆蓋了屬于所附權利要求及其等值范圍內的各種修飾和變化。
序列表<110>DiaSorin,S.r.l.<120>乙肝病毒表面抗原的逃逸突變蛋白<130>SBD1004EP序列<140><141><150>EP 97830635.5<151>1997-12-01<160>44<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>276<212>DNA<213>乙肝病毒<220><221>CDS<222>(1)..(276)<400>1tgt ctg cgg cgt ttt atc atc ttc ctc ttc atc ctg ctg cta tgc ctc48Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15atc ttc ttg ttg gct ctt ctg gac tat caa ggt atg ttg ccc gtt tgt96Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys20 25 30cct cta att cca gga ctc tcg acc atc cgc acg gga gca tac caa ccc144Pro Leu Ile Pro Gly Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro35 40 45tgc acg act att gct caa gga acc tct acg tat ccc tcc tgt tgc tgt192Cys Thr Thr Ile Ala Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys50 55 60atc aaa cct tcg gac gga aat tac acc tat att ccc atc cca tca tcc240Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser65 70 75 80tgg gct ttc gga aaa yyc cta tgg gag tgg gcc tca276Trp Ala Phe Gly Lys Xaa Leu Trp Glu Trp Ala Ser85 90<210>2<211>92<212>PRT<213>乙肝病毒<400>2Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys20 25 30Pro Leu Ile Pro Gly Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro35 40 45Cys Thr ThrI le Ala Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys50 55 60Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser65 70 75 80Trp Ala Phe Gly Lys Xaa Leu Trp Glu Trp Ala Ser85 90<210>3<211>92<212>PRT<213>乙肝病毒<400>3Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys20 25 30Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr35 40 45Cys Met Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys50 55 60Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser65 70 75 80Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser85 90<210>4<211>92<212>PRT<213>乙肝病毒<400>4Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys20 25 30Pro Leu Ile Pro Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr35 40 45Cys Thr Ile Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys50 55 60Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser65 70 75 80Trp Ala Phe Ala Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser85 90<210>5<211>92<212>PRT<213>乙肝病毒<400>5Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys20 25 30Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr35 40 45Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys50 55 60Ser Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser65 70 75 80Trp Ala Phe Gly Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser85 90<210>6<211>92<212>PRT<213>乙肝病毒<400>6Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu1 5 10 15Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys20 25 30Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr35 40 45Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys50 55 60Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser65 70 75 80Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser85 90<210>7<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>7Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Arg Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Gly Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Glu Tyr Gln Gly Met Leu His Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Thr65 70 75 80Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Thr Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>8<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>8Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro LeuIle Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser His Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Met Gly Leu Ser145 150<210>9<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>9Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Lgu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>10<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>10Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser AsR His Ser PTo Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys LeuIle Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly AsR Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>11<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>11Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu1 510 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Met Thr Thr Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>12<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>12Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu15 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Ile Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Ser Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Ile Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>13<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>13Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Leu Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>14<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>14Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Leu Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>15<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>15Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>16<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>16Ser Trp Trp Thr Ser Leu Ser Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>17<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>17Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ile Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>18<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>18Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Met Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>19<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>19Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Ile Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Val Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>20<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>20Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu1 510 15Gly Gln Asn Ser Arg Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Leu Gly Ser65 70 75 80Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>21<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>21Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Ile Ile Pro Gly Ser65 70 75 80Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Asn Ser Leu Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Arg Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>22<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>22Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe115 120 125Leu Trp Glu Gly Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>23<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>23Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>24<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>24Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Glu Ala Pro Thr Cys Pro1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser145 150<210>25<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>25Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys Pro1 5 10 15Gly Arg Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys LeuIle Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Thr65 70 75 80Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln85 90 95Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Arg Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser145 150<210>26<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>26Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Leu Pro Gly Cys Pro1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Leu Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro Gly Ser65 70 75 80Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Ser Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Leu Gly Lys Tyr115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Gln Phe Val Gln Trp Cys Val Gly Leu Ser145 150<210>27<211>154<212>PRT<213>乙肝病毒<400>27Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu1 5 10 15Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys20 25 30Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile35 40 45Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Ala Leu50 55 60Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Leu65 70 75 80Ser Thr Thr Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile Ala Gln85 90 95Gly Thr Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Ile Lys Pro Ser Asp Gly100 105 110Asn Tyr Thr Tyr Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe115 120 125Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val130 135 140Pro Phe Val Gln Trp Phe Ala Gly Leu Ser145 150<210>28<211>7<212>PRT<213>乙肝病毒<400>28Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Prol 5<210>29<211>21<212>PRT<213>乙肝病毒<400>29Leu Ser Thr Ile Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile Ala1 5 10 15Gln Gly Thr Ser Thr20<210>30<211>10<212>PRT<213>乙肝病毒<400>30Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr1 5 10<210>31<211>33<212>PRT<213>乙肝病毒<400>31Arg Thr Gly Ala Tyr Gln Pro Cys Thr Thr Ile Ala Gln Gly Thr Ser1 5 10 15Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Ile Lys Pro Ser Asp Gly Asn Tyr Thr20 25 30Tyr<210>32<211>24<212>DNA<213>乙肝病毒<400>32ctcgtggtgg acttctctca attt 24<210>33<211>21<212>DNA<213>乙肝病毒<400>33ggaaagccct acgaaccact g21<210>34<211>36<212>DNA<213>乙肝病毒<400>34ggaytmtcga ccatcmgcac gggagcatac caaccc36<210>35<211>36<212>DNA<213>乙肝病毒<400>35gggttggtat gctcccgtgc kgatggtcga kartcc36<210>36<211>24<212>DNA<213>乙肝病毒<400>36accatcmgca cgggagcata ccaa 24<210>37<211>24<212>DNA<213>乙肝病毒<400>37ttggtatgct cccgtgckga tggt 24<210>38<211>24<212>DNA<213>乙肝病毒<400>38ccaggaytmt cgaccatcmg cacg 24<210>39<211>24<212>DNA<213>乙肝病毒<400>39tcccgtgckg atggtcgaka rtcc 24<210>40<211>25<212>DNA<213>乙肝病毒<400>40gcataccaac cctgcacgac tattg25<210>41<211>25<212>DNA<213>乙肝病毒<400>41caatagtcgt gcagggttgg tatgc25<210>42<211>33<212>DNA<213>乙肝病毒<400>42gtatcaaacc ttcggacgga aattacacct ata 33<210>43<211>22<212>DNA<213>乙肝病毒<400>43tcggacggaa attacaccta ta 22<210>44<211>22<212>DNA<213>乙肝病毒<400>44tgggatggga atataggtgt aa 2
權利要求
1．一種分離的突變乙肝表面抗原蛋白，其中包含感染人的乙肝病毒的表面抗原蛋白的氨基酸序列，所述序列中第121位氨基酸不是半胱氨酸，第120、122、123、147或149位氨基酸中至少有一個不是該位置的保守氨基酸。
2．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述的蛋白呈現不同于野生型乙肝表面抗原蛋白的抗原性。
3．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120、122或123位氨基酸中至少有一個不是該位置的保守氨基酸。
4．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第147或149位氨基酸至少有一個不是該位置的保守氨基酸。
5．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120、122、123、147或149位氨基酸中至少有兩個不是該位置的保守氨基酸。
6．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120、122、123、147或149位氨基酸中至少有三個不是該位置的保守氨基酸。
7．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120、122、123、147或149位氨基酸中至少有四個不是該位置的保守氨基酸。
8．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120、122、123、147或149位氨基酸中所有五個不是該位置的保守氨基酸。
9．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第121位的保守性半胱氨酸被酪氨酸取代。
10．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120位的保守性脯氨酸被丙氨酸取代。
11．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第122位的保守性賴氨酸或精氨酸被谷胺酰胺取代。
12．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第123位的保守性蘇氨酸被脯氨酸取代。
13．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第120位的保守性脯氨酸被丙氨酸取代，第122位的保守性賴氨酸或精氨酸被谷胺酰胺取代，并且，第123位的保守性蘇氨酸被脯氨酸取代。
14．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第127位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
15．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第127位的保守性脯氨酸被異亮氨酸取代。
16．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第117位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
17．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第117位的保守性絲氨酸被精氨酸取代。
18．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第96位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
19．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第96位的保守性纈氨酸被丙氨酸取代。
20．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第113位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
21．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第113位的保守性絲氨酸或蘇氨酸被亮氨酸取代。
22．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第133位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
23．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第133位的保守性甲硫氨酸被蘇氨酸取代。
24．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第140位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
25．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第140位的保守性蘇氨酸被異亮氨酸取代。
26．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第147位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
27．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第147位的保守性半胱氨酸被酪氨酸取代。
28．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第149位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
29．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第149位的保守性半胱氨酸被酪氨酸取代。
30．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第147和149位氨基酸不是各自位置的保守氨基酸。
31．根據權利要求30所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第121、147和149位的保守性半胱氨酸被酪氨酸取代。
32．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第145是保守性甘氨酸。
33．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第137、138和139位氨基酸都是保守性半胱氨酸。
34．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第124位氨基酸是保守性半胱氨酸。
35．一種分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中包含感染人的乙肝病毒表面抗原蛋白的氨基酸序列，所述序列第122位氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
36．根據權利要求35所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述的蛋白質呈現不同于野生型乙肝表面抗原蛋白的抗原性。
37．根據權利要求35所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中第122位的保守性賴氨酸或精氨酸被谷胺酰胺取代。
38．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述的蛋白質是乙肝表面抗原的主要蛋白。
39．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白是乙肝表面抗原的中等蛋白。
40．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白是乙肝表面抗原的大蛋白。
41．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白質包含一段pre-S序列。
42．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白質包含部分或完整的pre-S1序列。
43．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白質包含部分或完整的pre-S2序列。
44．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白包含如下第117至123位的氨基酸序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro(SEQ ID NO:28)。
45．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白包含如下第113至133位的氨基酸序列Leu-Ser-Thr-Ile-Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro-Cys-Thr-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Thr-Ser-Thr(SEQ ID NO:29)。
46．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白包含如下第140至147位的氨基酸序列Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQ IDNO:30)。
47．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白包含如下第117至123位的氨基酸序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro(SEQ ID NO:28)和如下第140至147位的氨基酸序列Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQID NO:30)。
48．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，所述蛋白包含如下第117至149位的氨基酸序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro-Cys-Thr-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Thr-Ser-Thr-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQ ID NO:31)。
49．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中包含列于SEQ IDNO:2的氨基酸序列。
50．一種分離突變乙肝顆粒，其中包含權利要求1至49中任一項所述的突變乙肝表面抗原蛋白。
51．根據權利要求1所述的分離突變乙肝表面抗原蛋白，其中的分離片段包含一段至少30個氨基酸的序列，所述序列包含第120至149位的氨基酸，其中第121位的氨基酸不是半胱氨酸，而且第120、122、123、147或149位氨基酸中至少有一個不是各自位置的保守氨基酸。
52．根據權利要求35所述的突變乙肝表面抗原蛋白的分離片段，其中分離片段包含一段至少30個氨基酸的序列，所述序列包含第120至149位的氨基酸，其中第122位的氨基酸不是該位置的保守氨基酸。
53．一種組合物，其中包含權利要求1或35所述的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段、或含所述蛋白的顆粒，而且基本上無血液。
54．一種疫苗，它在藥學上可接受的載體中包含免疫原性量的權利要求1或35所述的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段、或含所述蛋白的顆粒。
55．一種特異性結合劑，它特異性地識別權利要求1或35所述的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段、或含所述蛋白的顆粒，其中的特異性結合劑是特異性針對乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的。
56．根據權利要求55所述的特異性結合劑，所述的特異性結合劑識別序列性表位。
57．根據權利要求55所述的特異性結合劑，所述的特異性結合劑識別構象性表位。
58．根據權利要求55所述的特異性結合劑，所述的特異性結合劑是單克隆抗體。
59．根據權利要求55所述的特異性結合劑，所述的特異性結合劑是單克隆抗體的片段。
60．根據權利要求55所述的特異性結合劑，所述的特異性結合劑是多克隆抗體。
61．一種分泌權利要求58所述單克隆抗體的雜交瘤。
62．一種對照樣品，其中包含已知量的權利要求1或35所述的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。
63．一種檢測樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的方法，它包括(a)在適宜于產生結合的條件下，讓樣品與特異性識別權利要求1或35所述突變表面抗原蛋白的特異性結合劑接觸；(b)測定特異性結合劑的結合程度，所述的結合程度與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的存在或含量相關；由此確定樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的存在或含量。
64．根據權利要求63所述的方法，該方法用含有已知量突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒的對照樣品，確定結合程度與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的存在或含量之間的相關關系。
65．根據權利要求63所述的方法，其中的特異性結合劑是特異性針對突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的。
66．根據權利要求63所述的方法，其中的方法包括非競爭性試驗。
67．根據權利要求66所述的方法，其中的試驗包括具有標記的第二特異性結合劑。
68．根據權利要求67所述的方法，其中的標記是放射性標記、酶標記、熒光標記、化學發光標記、生物發光標記或落射熒光標記。
69．根據權利要求63所述的方法，其中的方法包括凝集試驗。
70．根據權利要求63所述的方法，其中的方法括競爭性試驗。
71．根據權利要求63所述的方法，其中的方法包括使用能與突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒交叉反應的標記基質。
72．根據權利要求63所述的方法，其中的樣品是血液樣品。
73．根據權利要求63所述的方法，其中的樣品是疫苗。
74．一種突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒測試的標定方法，它包括(a)提供含有已知量權利要求1或35所述突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒的兩份或多份對照樣品；(b)檢測試驗中的各個對照樣品，記錄各份對照樣品產生的信號；(c)制作所產生的信號與樣品中突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒的含量相關關系的標定曲線。
75．一種檢測特異性結合劑結合親和力的方法，它包括(a)提供含有已知量權利要求1或35所述突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒的對照樣品；(b)在適宜產生結合的條件下，將對照樣品與特異性結合劑接觸；(c)測定特異性結合劑的結合程度；由此確定特異性結合劑與突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒的結合親和力。
76．根據權利要求75所述的方法，它還包括將所測結合親和力與預先測定的結合親和力最小值相比較。
77．根據權利要求76所述的方法，其中的方法是診斷用免疫試劑盒生產過程中質量控制的一部分。
78．根據權利要求75所述的方法，其中的特異性結合劑是單克隆抗體或單克隆抗體片段。
79．一種診斷用免疫測試試劑盒，它包含權利要求55所述的特異性結合劑。
80．一種診斷用免疫測試試劑盒，它包含權利要求62所述的對照樣品。
81．利用重組法生產的權利要求1或35所述的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。
82．根據權利要求81所述的蛋白質、顆粒或片段，它們是利用重組法在酵母、桿菌或哺乳動物細胞中生產的。
83．分離的DNA，它編碼權利要求1或35所述的突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白的顆粒。
84．根據權利要求83所述的分離的DNA，它包含一段編碼SEQ ID NO:2氨基酸序列的序列。
85．根據權利要求83所述的分離的DNA，它包含編碼以下氨基酸序列的序列Arg-Thr-Gly-Ala-Tyr-Gln-Pro-Cys-Thr-Thr-Ile-Ala-Gln-Gly-Thr-Ser-Thr-Tyr-Pro-Ser-Cys-Cys-Cys-Ile-Lys-Pro-Ser-Asp-Gly-Asn-Tyr-Thr-Tyr(SEQ ID NO:31)。
86．一種載體，它包含編碼權利要求1或35所述突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒的DNA。
87．一種檢測樣品中編碼突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列的方法，它包括(a)提供懷疑含有編碼權利要求1或35所述突變乙肝表面抗原蛋白、其片段或含所述蛋白顆粒核酸序列的樣品；(b)檢測編碼突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列。
88．根據權利要求87所述的方法，它在檢測步驟(b)之前，至少部分核酸序列被擴增。
89．根據權利要求88所述的方法，其中的檢測步驟是如下進行的將擴增的核酸與核苷酸探針的至少一部分雜交，所述探針包含與被擴增的突變乙肝核酸互補的核苷酸序列；并檢測探針。
90．根據權利要求89所述的方法，其中的探針是標記過的。
91．根據權利要求89所述的方法，其中雜交后的探針與擴增核酸形成的復合物是用對雙鏈DNA特異性的結合劑檢測的。
92．根據權利要求91所述的方法，其中的特異性結合劑是單克隆抗體或單克隆抗體片段。
93．根據權利要求88所述的方法，其中的檢測步驟是如下進行的，即根據核苷酸序列的長度分離被擴增核酸，并檢測與被擴增乙肝核酸對應的核苷酸序列。
94．根據權利要求89所述的方法，其中的核苷酸探針包含一段選自以下的核苷酸序列5′-GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA CCC-3′；5′-GGG TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′；5′-ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA-3′；5′-TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT-3′；5′-CCA GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG-3′；5′-TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′；5′-GCA TAC CAA CCC TGC ACG ACT ATT G-3′；5′-C AAT AGT CGT GCA GGG TTG GTA TGC-3′；5′-GT ATC AAA CCT TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′；5′-TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′；5′-TGG GAT GGG AAT ATA GGT GTA A-3′；或者核苷酸序列或雜交活性與以上任一核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。
95．一種用于檢測編碼權利要求1或35所述突變乙肝表面抗原蛋白的核酸序列的核苷酸探針，它包含一段選自以下的核苷酸序列5′-GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA CCC-3′；5′-GGG TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′；5′-ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA-3′；5′-TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT-3′；5′-CCA GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG-3′；5′-TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′；5′-GCA TAC CAA CCC TGC ACG ACT ATT G-3′；5′-C AAT AGT CGT GCA GGG TTG GTA TGC-3′；5′-GT ATC AAA CCT TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′；5′-TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′；5′-TGG GAT GGG AAT ATA GGT GTA A-3′；或者核苷酸序列或雜交活性與以上任一核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。
96．根據權利要求95所述的核苷酸探針，它還包含一個可測標記。
97．根據權利要求95所述的核苷酸探針，其中的探針主要由所述序列之一構成。
98．用于檢測編碼權利要求1或35所述突變乙肝表面抗原蛋白的核苷酸序列的試劑盒，它包括至少一種試劑，此試劑包含能夠與乙肝表面抗原特有核酸退火結合并引發擴增反應的核苷酸引物；和至少一種試劑，此試劑包含能夠與被擴增突變乙肝表面抗原核酸雜交的核苷酸探針。
99．根據權利要求98所述的試劑盒，其中的核苷酸探針包括一段選自以下的核苷酸序列5′-GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA CCC-3′；5′-GGG TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′；5′-ACC ATC MGC ACG GGA GCA TAC CAA-3′；5′-TTG GTA TGC TCC CGT GCK GAT GGT-3′；5′-CCA GGA YTM TCG ACC ATC MGC ACG-3′；5′-TCC CGT GCK GAT GGT CGA KAR TCC-3′；5′-GCA TAC CAA CCC TGC ACG ACT ATT G-3′；5′-C AAT AGT CGT GCA GGG TTG GTA TGC-3′；5′-GT ATC AAA CCT TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′；5′-TCG GAC GGA AAT TAC ACC TAT A-3′；5′-TGG GAT GGG AAT ATA GGT GTA A-3′；或者核苷酸序列或雜交活性與以上任一核苷酸序列基本相同的核苷酸序列。
全文摘要
本發明提供一種分離的突變乙肝表面抗原蛋白,其中包含感染人的乙肝病毒的表面抗原蛋白的氨基酸序列,其中第121位氨基酸不是半胱氨酸,第120、122、123、147或149位氨基酸中至少有一個不是該位置的保守氨基酸。本發明還提供一種檢測樣品中突變乙肝表面抗原蛋白或含所述蛋白顆粒的方法。
文檔編號C07K14/02GK1230549SQ9812278
公開日1999年10月6日 申請日期1998年12月1日 優先權日1997年12月1日
發明者D·普里米, G·菲奧爾達利西, M·帕拉 申請人:迪亞索林國際股份有限公司